3.2 Molekularbiologie
3.2.4 Quantitative Real-Time PCR
Die Methode der Real-Time PCR ermöglicht es, durch Primer markierte Gensequenzen zu amplifizieren und gleichzeitig auch zu quantifizieren. So können Aussagen getroffen werden, ob eine Stimulation der Endothelzellen mit einem TGC-spezifischen Produkt eine veränderte Expression bestimmter Genabschnitte zur Folge hatte.
Wie bereits unter Kapitel 3.1.11, 3.2.1 und 3.2.2 beschrieben, wurden Endothelzellen mit FGF1, 2 und 4 sowie Endothelzellvollmedium und serumreduziertem Medium stimuliert, es folgte die Isolation der RNA und Umschreibung zu cDNA. Die Auswahl von FGF1, 2 und 4 als Stimulanzien basierte auf Erkenntnissen, die im Rahmen des MTT-Assay gewonnen wurden und eine veränderte Expression ausgewählter Gensequenzen erwarten ließen.
Die eingesetzten Primer, deren Gensequenz, Anlagerungstemperatur, Amplifikationszyklen, Produktgrößen und Accession-Nummer sind der Tabelle 4 zu entnehmen.
Tabelle 4: Informationen zu den in der Real-Time PCR eingesetzten Primern
Rev: GTGGACACGCTGTGAGTGG 60 40 247 NM_001075
924.1
Syndekan 2 (SN2)
For: AACGGACCCAGATGAAGAGG
Rev: GCACTGGATGGTTTGCGTTC 60 40 207 NM_001034
788.2
Syndekan 3 (SN3)
For: GTGCTCGTAGCTGTGATCGT
Rev: TTGCTTGTCAGGCTTCTGGT 60 40 159 NM_001206
531.1
Syndekan 4 (SN4)
For: GGGCAGGAATCCGATGACTT
Rev: TTCCAGTTCCTTGGGTTCGG 60 40 162 XM_584869
.6
Heparanase (HPA)
For: GACCCCTCAAGAAGGTTTGGT
Rev: GCCGACAGGCCCAATTTAT 60 40 100 NM_174082
.2
Rev: GAGCTCGTCTTCCGTACCAG 60 40 238 NM_181009
Rev: TTGTCCTTCTCCCAGGGTC 60 40 247 NM_174745
.2
Matrix-Metalloprotein ase 9 (MMP9)
For: GACCAGGACAAGCTCTACGG
Rev: CAGAAGCCCCACTTCTTGTC 60 40 202 NM_174744
.2
Primer Sequenz (5‘→3‘)
Rev: CTGCCAGTCACCTCTAAGCC 60 40 198
NM_174389
Rev: AGGGGGCATCTTAGTGGG 60 40 235 NM_174390
.2
Rew: CAGGGGATGGATGAGCAG 60 40 230 NM_174471 .3
Rew: TTGATGTTCTTCTCCGTGACC 60 40 255 NM_174472 .4
Emmprin (EMP)
For: AGACGGAGTATGAGGTGGACT
Rev: CTGGTCCCCAGATTCGCTTT 60 40 233 NM_001075
Histon F3α
Die Primer für die Gene Histon F3α und Ubiquitin dienten bei der Durchführung der Real Time PCR als interner Standard (Housekeeping Gene), da diese Gene in jeder Zelle, unabhängig von einer möglichen Stimulation, vorkommen und so für eine Normierung der Ergebnisse anderer Primer genutzt werden konnten.
Bei der Durchführung der Real-Time PCR durchlaufen die zu analysierenden Proben, ähnlich wie bei der konventionellen PCR, eine bestimmte Anzahl von Zyklen, in denen der markierte Genabschnitt amplifiziert wird. Nach Ablauf eines jeden Zyklus wird die Menge der neu gebildeten DNA-Moleküle gemessen und kann darauf hin, an Hand eines Graphen, in Echtzeit dargestellt werden. Um die
Zunahme der neu gebildeten DNA-Sequenzen zu erfassen, wird der Fluoreszenzfarbstoff SYBR-Green den Probenansätzen hinzugefügt. Dieser hat die Eigenschaft, in doppelsträngiger DNA zu interkalieren. Das nach jedem Zyklus gemessene Fluoreszenz-Signal ist proportional zur vorhandenen Menge des markierten Genabschnittes. Für die Durchführung der Real-Time PCR wurde der Step One Plus Real-Time Cycler von Applied Biosystems® verwendet.
Nachfolgend ist das Programm für die Durchführung der Real Time PCR aufgeführt:
1. 95°C für 10 Minuten Denaturierung der doppelsträngigen cDNA 2. 95°C für 15 Sekunden Denaturierung bei 95°C
3. 60°C für 60 Sekunden Primer-Anlagerung und Elongation
Der Prozess der Denaturierung, Primer-Anlagerung und nachfolgender Elongation wird in 40 Zyklen wiederholt.
4. 95°C für 15 Minuten 5. 60°C für 60 Minuten 6. 95°C für 15 Minuten
Die Schritte 4.- 6. sind Bestandteil der Schmelzkurvenanalyse, bei der die Qualität der Real-Time PCR-Produkte überprüft wird. Sollten im Rahmen der Amplifikation nicht nur das gewünschte PCR-Produkt, sondern auch beispielsweise unspezifische Primer-Dimere entstanden sein, weißt die Schmelzkurve mehrere Peaks auf.
Während der ersten Real-Time PCR-Zyklen wird ausschließlich eine Hintergrundfluoreszenz gemessen. Kommt es zum exponentiellen Anstieg des zu amplifizierenden Genabschnittes, wird der sogenannte Threshold (Schwellenwert) überwunden und das Fluoreszenzsignal tritt aus dem Hintergrund hervor. Der Zyklus, bei dem dieser Schwellenwert überwunden wird, kann auch als Threshold Cycle (Ct-Wert) bezeichnet werden.
Bevor mit den Analysen mittels Real-Time PCR begonnen werden konnte, erfolgte eine Optimierung der eingesetzten Primer, wobei für MMP1, 2, 9, 13 und 14, TIMP1 und 2, Histon F3α und Ubiquitin bereits Informationen über deren Optimierung vorlagen. Bestandteil der Optimierung war, es, zu testen, bei welchem Mengenverhältnis der Primer die höchsten Amplifikationsergebnisse erzielt wurden und die Schmelzkurven nur einen Peak aufwiesen. Ansätze, die Primer in unterschiedlichem Verhältnis enthielten, wurden mit Mastermix (MM) 1 bis 3 bezeichnet und sind nachfolgend mit ihren Bestandteilen aufgeführt:
MM 1
SYBR Green 12,5µl
cDNA 1µl
Nuklease-freies H20 9,5µl
Primer forward 1,5µl
Primer reverse 0,5µl
MM 2
SYBR Green 12,5µl
cDNA 1µl
Nuklease-freies H20 8,5µl
Primer forward 1,5µl
Primer reverse 1,5µl
MM 3
SYBR Green 12,5µl
cDNA 1µl
Nuklease-freies H20 5,5µl
Primer forward 1,5µl
Primer reverse 4,5µ
Der für jeden Primer verwendete MM ist der Tabelle 5 zu entnehmen. Des Weiteren wurden Verdünnungsreihen mit unterschiedlichen cDNA-Konzentrationen nicht stimulierter Endothelzellen hergestellt und anschließend damit Real-Time PCR Durchgänge durchgeführt, um für jeden Primer die cDNA-Menge festlegen zu können, bei der während der Real-Time PCR ein Ct-Wert im Bereich von 18 bis 25 erreicht wird. Unter Verwendung der hierbei entstandenen Standardkurven wurde für die verwendeten Primer deren jeweilige Effizienz in Prozent berechnet, wobei eine Effizienz von 100% einer Verdoppelung der cDNA in jedem Zyklus entsprechen würde. Nachfolgend ist die verwendete Formel aufgeführt:
: = 10− 10/
E = Effizienz m = Steigung
Ziel war es, dass jeder eingesetzte Primer eine Effizienz von 90 bis 130% aufwies.
Als weitere Größe wurde der Determinationskoeffizient (R2) berechnet, der angibt, ob die Effizienz der Amplifizierung bei unterschiedlichen eingesetzten cDNA-Konzentrationen gleich ist. R2 ist ein Wert für die Linearität und sollte im Rahmen der durchgeführten Versuche für jeden Primer einen Wert >0,985 aufweisen.
Informationen zu eingesetzter cDNA, Effizienz und Determinationskoeffizient sind ebenfalls der Tabelle 5 zu entnehmen.
Nach Ablauf von Primer-Optimierung und Festlegung der einzusetzenden cDNA-Konzentration wurde mit der Durchführung der Real Time PCR unter Verwendung der cDNA der stimulierten Endothelzellen begonnen. Dazu wurden vorab jeweils für die cDNA der stimulierten Endothelzellen (Endothelzellvollmedium, serumreduziertes Medium, FGF1, 2 und 4; siehe Kapitel 3.1.11) Verdünnungsreihen hergestellt, um die cDNA in der gewünschten Konzentration einsetzten zu können. Die Durchführung der Real-Time PCR erfolgte auf 96-Well Platten. Jeder Reaktionsansatz umfasste dabei 25µl, wobei zuerst in jedes Well 24µl des entsprechenden MM vorgelegt und 1µl cDNA der einzelnen Stimulationen hinzugegeben wurden. Für jeden Primer wurde, pro Real-Time PCR Durchgang,
die cDNA der einzelnen Stimulationen im doppelten Ansatz analysiert, wobei für jeden Primer auch zwei Nullkontrollen mit durchgeführt wurden, bei denen an Stelle der cDNA Nuklease-freies H20 hinzu gegeben wurde. Anschließend erfolgte die Abdeckung der Wellplatte mit einer selbsthaftenden Folie, dann wurde die Platte für wenige Sekunden auf dem Rüttler geschüttelt und für 15 Sekunden bei 1000 x g zentrifugiert. Im letzten Schritt wurde die Wellplatte in den Real-Time Cycler verbracht, um das bereits aufgeführte Programm zu durchlaufen. Insgesamt wurden für jeden Primer vier Real-Time PCR Durchgänge durchgeführt.
Tabelle 5: Mastermix, eingesetzte cDNA, Effizienz und Determinationskoeffizient der in der Real-Time PCR eingesetzten Primer
Primer Mastermix Eingesetzte
cDNA (ng) Effizienz (%) Determinationskoeffizient (R2)
SN1 2 50 89 0,97
SN2 2 100 155 0,98
SN3 2 25 128 0,95
SN4 2 25 101,75 0,83
HPA 2 100 94 0,76
ET1 2 6,25 112 0,983
ECE1 2 3,125 108 0,96
MMP1 1 100 96 0,94
MMP2 1 1,56 99,18 0,9
MMP9 1 100 83 0,98
MMP13 2 100 117 0,595
MMP14 2 100 95,25 0,897
TIMP1 1 1,5 104,16 0,95
TIMP2 1 6,25 92,78 0,962
EMP 2 3,125 103 0,97
HF3α 2 25 88,7 0,997
UBI 2 6,25 119 0,96