Die Rolle mikrovaskulärer Endothelzellen in der Pathogenese des ARDS

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Einleitung

In der Pathogenese einer Sepsis kommt es zu hämody- namischen Veränderungen, welche durch die Ab- nahme der endothelialen Schrankenfunktion und Verminderung des peripheren Widerstandes gekenn- zeichnet sind. Weitere Charakteristika sind die Induktion einer disseminierten intravasalen Gerin- nung, die Ausbildung von Mikrothromben sowie die verstärkte Adhäsion aktivierter Leukozyten am

Endothel (8, 28, 41). Daraus wird ersichtlich, daß die Zellen der Blutgefäße (Arterien, Venen und das mikrovaskuläre Gefäßsystem) nicht nur Zielzellen für Effekte anderweitig endogen synthetisierter proinflammatorischer Mediatoren sind, sondern selbst eine aktive Rolle bei der Entwicklung inflammationsbe- dingter Gewebsschädigung spielen. Sie sind aktiv in den Ablauf physiologischer Prozesse involviert (51, 72), aber die im Rahmen einer Entzündung aktivierten Endothelzellen sind zusätzlich an der Induktion und

Die Rolle mikrovaskulärer Endothelzellen in der Pathogenese des ARDS

– Vergleich zu makrovaskulären Endothelzellen –

The role of microvascular endothelial cells in the pathogenesis of ARDS – Comparison to macrovascular endothelial cells –

G. Ch. Beck¹, B. A. Yard², J. Schulte¹und K. van Ackern¹

1Institut für Anästhesiologie und Operative Intensivmedizin (Direktor: Prof. Dr. Dr. h.c. K. van Ackern)

2V. Medizinische Klinik - Nephrologie (Direktor: Prof. Dr. F. J. van der Woude) Universitätsklinikum Mannheim

Zusammenfassung: Mikrozirkulationsstörungen spie- len eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung des Multi- organversagens im Rahmen einer Sepsis. Somit kön- nen die Dysfunktion und die Schädigung mikrovas- kulärer Endothelzellen zum entscheidenden Mediator organspezifischer Veränderungen unter Inflamma- tionsbedingungen werden.

Verschiedene In-vivo- und In-vitro-Studien zeigen, daß die Struktur und die Funktionen von Endothel- zellen in Abhängigkeit ihrer Organ- und Gefäß- herkunft stark variieren können. Besonders mikrovas- kuläre Endothelzellen der Lunge scheinen eine erhöh- te Sensitivität gegenüber proinflammatorischen Sti- muli zu haben. Im Vergleich zu makrovaskulären Endothelzellen synthetisieren die mikrovaskulären Endothelzellen der Lunge große Mengen an Adhäsi- onsmolekülen, Zytokinen, Chemokinen sowie prokoa- gulatorischen Faktoren. Diese speziellen phänotypi- schen Eigenschaften könnten u.a. die hohe Inzidenz des "adult respiratory distress syndrome" (ARDS) im Rahmen einer Sepsis mitbegründen.

Der folgende Artikel gibt eine Übersicht über die wichtigsten Unterschiede zwischen verschiedenen mikro- und makrovaskulären Endothelzellen unter septischen Bedingungen im allgemeinen und über die Bedeutung der mikrovaskulären Endothelzellen der Lunge bei der Entwicklung eines ARDS im besonde- ren.

Summary: Alterations in microcirculation are critical steps in the initiation of multiple organ failure during

septic processes. Dysfunction and damage of micro- vascular endothelial cells may therefore be assumed to play a key role in the pathogenesis of sepsis and its organ manifestations.

Numerous studies performed in vivo and in vitro have shown that endothelial cells are extremely heteroge- neous and differ in both structure and function, depending on their respective tissue environment.

Microvascular endothelial cells of the human lung, in particular, seem to be highly sensitive to proinflamma- tory stimuli. Compared to macrovascular endothelial cells, their response is characterized by an increased synthesis of adhesion molecules, cytokines, chemoki- nes and procoagulatory factors. These specific pro- perties may explain at least in part why the lung is so vulnerable to damage in septic situations, particularly to the development of an adult respiratory distress syndrome (ARDS).

This article attempts to review the heterogeneity of different endothelial cells with regard to the patterns of general inflammation, and to investigate the impor- tance of microvascular endothelial cells of the lung in the pathogenesis of ARDS.

Schlüsselwörter: Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS) – Akutes Lungenversagen – Gefäßendothel – Sepsis – Entzündung

Key words: Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS) – Acute Lung Injury – Vascular Endothelium – Sepsis – Inflammation.

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Intensivmedizin

Synthese von proinflammatorischen Mediatoren wie Zytokinen, Wachstumsfaktoren, Adhäsionsmolekülen oder Chemokinen beteiligt und für das gestörte Gleichgewicht zwischen pro- und antikoagulatori- schen Reaktionen verantwortlich.

Obwohl Endothelzellen viele gemeinsame Eigen- schaften haben, unterscheiden sie sich entsprechend ihrer Gefäßlokalisation entscheidend in Struktur, Metabolismus und Expression von Antigenen und Oberfächenmarkern. Individuelle Eigenschaften der verschiedenen Endothelzellen konnten erst seit der Einführung einer Methode zur Isolierung von Endo- thelzellen von Jaffe et al. selektiv untersucht werden (50). Diese In-vitro-Untersuchungen sind zur Inter- pretation und Komplettierung von In-vivo-Studien essentiell, da In-vivo-Versuche meist schwierig durch- zuführen sind und auf Grund der komplexen Immun- antwort in vivo selten hoch selektiv und auf molekularer Ebene analysiert werden können. Eine wichtige Beobachtung für die Bedeutung und die Inter- pretation der in vitro Experimente mit Endothelzellen war, daß in mehreren Studien die jeweils in vitro beob- achtete endotheliale Immunantworten mit den in vivo gemessenen des gleichen Organes übereinstimmten bzw. vergleichbar waren (9, 20, 44).

Als Prototyp der In-vitro-Kultur von Endothelzellen humanen Ursprungs wurden und werden nach wie vor Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) verwendet, da sie leicht zu isolieren und in Reinkultur zu züchten bzw. zu kultivieren sind.

Aufgrund der heutigen Kenntnisse, daß Mikrozirkula- tionsstörungen und somit phänotypische Verände- rungen mikrovaskulärer Endothelzellen (MVEC) eine wesentliche Rolle in der Pathogenese der Sepsis und ihrer Organmanifestationen spielen, war es dringend erforderlich, Methoden zur Kultivierung dieser mikro- vaskulären Endothelzellen aus verschiedenen Or- ganen zu entwickeln (22, 36, 46, 66). Erst seit kurzer Zeit gelingt es mit sehr unterschiedlichem Erfolg, MVEC zu isolieren und zu kultivieren. Die Bezeich- nung "mikrovaskuläre Endothelzellen" bezieht sich dabei ausschließlich auf Zellen, welche in Arteriolen, präkapillären Sphinktern, Kapillaren, postkapillären Venolen und muskulären Venolen zu finden sind. Eine Zuordnung der isolierten Zellen in präkapillären, kapillären oder postkapillaren Ursprung ist dabei noch nicht möglich. Bisher gibt es Beschreibungen über mikrovaskuläre Zellkulturen hauptsächlich aus Lunge (34, 37, 43, 75), Retina (22, 53, 78), Herz (89), Haut (35) und Gehirn (66, 86). Die meisten Kulturen stammen dabei aber immer noch vom Tier und erst teilweise gelingt die Anzucht humaner MVEC.

Aus den Ergebnissen der bisherigen Studien mit HUVEC und MVEC konnte sicher abgeleitet werden, daß Endothelzellen in Abhängigkeit ihrer Herkunft und Lokalisation unterschiedliche morphologische und funktionelle Eigenschaften haben. Die Fähigkeit von Organen, auf einen einheitlichen Entzündungsreiz

unterschiedlich zu reagieren, könnte auch auf einer phänotypischen Heterogenität zwischen verschiedenen Endothelzellpopulationen basieren (15, 44, 65).

Trotz stabiler konstitutiv vorhandener Eigenschaften scheinen junge wie auch reife Endothelzellen in der Lage zu sein, ihre Funktionen reversibel entsprechend den Veränderungen ihrer Umgebung anzupassen. Es ist jedoch noch unklar, auf welcher Grundlage sich diese unterschiedlichen Eigenschaften der Endothel- zellen entwickeln (21). Bisher wird angenommen, daß die speziellen Eigenschaften von Endothelzellen während ihrer Entwicklungsphase induziert werden und je nach Stimulus reversibel abrufbar sind (74).

Phänotypische Eigenschaften ver- schiedener mikro- und makrovaskulä- rer Endothelzellen unter Inflamma- tionsbedingungen

Zu den Funktionen von Endothelzellen gehören die Aufrechterhaltung einer antithrombogenen Ober- fläche durch Wahrung des Gleichgewichtes zwischen der Synthese von Koagulations- und Fibrinolysefakto- ren sowie der Produktion ihrer Inhibitoren. Zusätzlich wird der Transport von Nahrungsbestandteilen und Hormonen, die Produktion vasoaktiver Substanzen, die Metabolisierung von Hormonen, Medikamenten und Blutabbauprodukten sowie die Produktion einer Reihe von Glykoproteinen und Proteoglykanen sichergestellt (33, 82). Neben diesen allgemeinen Funktionen haben Endothelzellen im Rahmen physiologischer, aber vor allem pathophysiologischer Pro- zesse, wie z.B. Inflammation, Diabetes, Transplantat- abstoßung oder Tumorpathogenese, spezielle Eigen- schaften, welche sich in Abhängigkeit ihrer Lokali- sation deutlich voneinander unterscheiden können und wahrscheinlich die jeweiligen organspezifischen Erfordernisse unter den entsprechenden Bedingungen widerspiegeln.

Unterschiedliche Charakteristika sind dabei nicht nur zwischen den Endothelzellen verschiedener Spezies und verschiedener Körper- und Organregionen einer Spezies zu finden, sondern es konnten auch interor- ganspezifische Unterschiede zwischen den einzelnen Endothelzelltypen verschiedener Kompartimente eines Organes beschrieben werden. Es sind Modu- lationen der interzellulären Verbindungsmoleküle (tight junctions) zwischen verschieden lokalisierten zerebralen Kapillaren beschrieben (87, 89), und es wurde eine differente Immunantwort von Endothel- zellen unterschiedlicher Leber-Kompartimente doku- mentiert (29, 65). Weiter wird auf Unterschiede in der Adhäsionsmolekülsynthese und Expression des Thrombospondin- und Kollagenrezeptors CD36 zwischen dem oberflächlichen und tiefer liegenden Gefäßbett der Haut nach proinflammatorischer Stimulation hingewiesen (69).

Anästhesiologie & Intensivmedizin 2003, 44: 275-284

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In einer zunehmenden Zahl von Untersuchungen wird heute vor allem die Bedeutung der Heterogenität zwischen mikro- und makrovaskulären Endothelzellen unterschiedlichen, aber auch solchen gleichen Organ- ursprunges hervorgehoben. Es konnte gezeigt werden, daß sich mikro- und makrovaskuläre Zellen nicht nur in ihrer Fähigkeit, auf gleiche Stimulationsbedin- gungen mit einer unterschiedlichen Immunantwort zu reagieren unterscheiden, sondern bereits in ihrer Morphologie und ihren Wachstumseigenschaften nach Isolierung als Primärkultur stark voneinander abwei- chen. MVEC können je nach der lokal erforderlichen physiologischen Permeabilität "kontinuierlich", d.h.

mit einem einheitlichen Zytoplasma (z.B. ZNS) vorkommen. Sie existieren aber auch in "gefensterter"

Form, d.h. mit unterbrochenem, gelöchertem Zyto- plasma (Niere oder Gastro-Intestinaltrakt) (74).

MVEC können in vivo und auch in vitro recht schnell gefäßähnliche Strukturen bilden, weshalb sie im Gegensatz zu MEC hauptsächlich in Neovaskulari- sierungsprozesse involviert sind (6, 20, 74). MVEC reagieren sensitiver und mit stärkerem Proliferations- verhalten als MEC auf Wachstumsfaktoren (57).

In der nachfolgenden Übersicht sind einige Unter- schiede zwischen mikro- und makrovaskulären Endothelzellen aufgeführt, welche für den Verlauf eines Entzündungsprozesses relevant sind.

Chemokine und Chemokinrezeptoren

Chemokine besitzen hauptsächlich die Funktion, bei definierten Zellpopulationen ein chemotaktisches Verhalten zum Inflammationsort auszulösen. Zusätz- lich haben Chemokine die Fähigkeit, angiogenetische Effekte zu induzieren, wobei Endothelzellen nach ent- sprechender Stimulation befähigt werden, in das umliegende Gewebe zu migrieren, dort zu proliferie- ren, neue Basalmembranen und Gefäße zu bilden und mit den vorhandenen zu kommunizieren (5, 83). Für die Induktion dieser Effekte werden vor allem die Chemokine der CXC-Chemokinfamilie, wie Interleu- kin-8 (IL-8), "epithelial neutrophil activating protein- 78" (ENA-78) oder "growth-related factor-α" (Gro-α) verantwortlich gemacht. Die entsprechenden Rezep- toren dieser Chemokine, die CXCR 1 - 4, waren alle vermehrt auf der Oberfläche von MVEC nachzuweisen. Dagegen wird von HUVEC nur der CXCR4- Rezeptor exprimiert, ein Fakt, worauf das verminderte angiogenetische Verhalten von MEC zurückzuführen sein könnte (34, 49, 79).

Adhäsionsmoleküle

Viele Studien beschäftigten sich mit der Analyse der Synthese von Adhäsionsmolekülen auf unterschiedlichen Endothelzellpopulationen, da die Interaktion zwischen Endothel und rekrutierten Entzündungs- zellen typisch für die initiale Phase und entscheidend für den Verlauf einer Entzündung ist. Proinflamma- torische Stimulation z.B. mit Endotoxin (LPS), Inter- leukin-1 (IL-1) oder Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) führt zur vermehrten Synthese von Adhäsions- molekülen wie z.B. E-Selectin und "intercellular adhesion molecule" (ICAM-1) auf der Endothelzellober-

fläche (54). Diese Adhäsionsmoleküle binden mit Liganden auf korrespondierenden Entzündungszellen und aktivieren diese ihrerseits (12, 55). In einem Rattenmodell konnte gezeigt werden, daß die mikro- vaskuläre ICAM-1-Expression unter basalen Bedin- gungen signifikant gegenüber MEC erhöht ist, unter Stimulationsbedingungen aber keine deutlichen Unterschiede nachweisbar waren (84). In anderen Untersuchungen und Modellen dagegen konnte auch unter Stimulationsbedingungen eine erhöhte mikro- vaskuläre Expression von ICAM-1 und zusätzlich die vermehrte Expression von "major histocompatibility protein" (MHC) nachgewiesen werden (7, 68). Die Expression von VLA-1 Integrin ("very late activation antigen"), verantwortlich für eine enge interzelluläre Adhäsion, wurde auf MVEC in vivo und in vitro gefunden, nicht dagegen bei Zellen größerer Gefäße (23, 80). Dies ist insofern von Bedeutung, da eine Stimulation von Endothelzellen zu einer erhöhten VLA-1-Expression führt und somit der entzündungs- bedingt erhöhten mikrovaskulären Permeabilität ent- gegenwirken kann (71). Weitere Unterschiede konnten in bezug auf die L-Selectin-abhängige Adhäsion an Endothelzellen beobachtet werden. L-Selectin-positi- ve Zellen adhärieren nach Stimulation mit TNF-α besser an mikrovaskulären als an makrovas- kulären koronaren Endothelzellen, da die MVEC im Unterschied zu MEC verschiedene Liganden für die auf den meisten Leukozyten anwesenden L-Selectine exprimieren (89). Dies könnte vor allem für die Leukozytenrekrutierung im Rahmen entzündlicher Erkrankungen von Bedeutung sein.

Eicosanoide

Aktivierte Phospholipase A₂ (PLA₂) spaltet Mem- branphospholipide, aus welchen Arachidonsäure (AA) als Vorstufe der Eicosanoide sowie "platelet- activating-factor" (PAF) gebildet werden. AA kann über verschiedene Wege metabolisiert werden, wobei via Cyclooxygenase die Prostaglandine (PG) und Thromboxan (ThX) und via Lipoxygenase die Leuko- triene (LT) als wichtige chemotaktisch und vasoaktiv wirksame Mediatoren synthetisiert werden können (76). Es konnte gezeigt werden, daß unter gleichen Stimulationsbedingungen humane und auch MVEC von Tieren hauptsächlich PGF₂α (Kontraktion der glatten bronchialen Gefäßmuskelzellen, Vasodila- tation in der Niere) und PGE₂ (Kontraktion der Gehirn- und Coronargefäße, Relaxation glatter Ge- fäßmuskelzellen der Bronchien) produzieren, wogegen makrovaskuläre Zellen vorrangig PGI₂ (Vaso- dilatation und Inhibition von Thrombozytenadhärenz- und aggregation) synthetisieren (18, 33). PGI₂ kann wiederum ausschließlich von MEC, nicht aber von MVEC in Ketosäuren umgewandelt werden (26).

Redoxsystem

In den letzen Jahren konnte gezeigt werden, daß endothelial freigesetztem Stickstoffmonoxid (NO) bedeu- tende biologische Aktivitäten wie die Regulation des Vasotonus, die Inhibition der Plättchenaggregation und die Anheftung von PMN an das Endothel sowie

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Intensivmedizin

eine bakteriostatische und Tumor-lysierende Wirkung zukommen (62, 63, 69, 70). NO wird mittels NO- Synthetase aus L-Arginin gebildet und schnell zu den Endprodukten Nitrat und Nitrit metabolisiert, wobei zwischen induzierbarer (iNOS) und konstitutiv auf Endothelzellen nachweisbarer (eNOS) NO-Synthe- tase unterschieden wird (11, 75). In einem Ratten- modell konnte gezeigt werden, daß makrovaskuläre Aortenzellen dieser Tiere nach proinflammatorischer Stimulation deutlich mehr Nitrit als mikrovaskuläre Lungenendothelzellen produzieren und daß diese verminderte mikrovaskuläre NO-Produktion ein physiologischer Mediator für die Produktion von Adhäsions- molekülen zu sein scheint (43).

Gerinnung

Endothelzellen haben im allgemeinen eine Oberfläche mit antikoagulativen Eigenschaften. Unter Inflamma- tionsbedingungen wird diese Fähigkeit vermindert und Endothelzellen haben vorrangig prokoagulatorische Funktionen, was durch eine vermehrte Synthese von "tissue factor" (TF) (beeinflußt das extrinsische Gerinnungssystem über Aktivierung von Faktor X) (14, 64) und Plasminogen-Aktivator-Inhibitor (PAI) zum Ausdruck kommt (19, 27).

Das Ausmaß der Synthese von Gerinnungsfaktoren und Inhibitoren der Gerinnung ist zwischen Endo-

thelzellen verschiedener Organe sehr heterogen. Zum Beispiel wird der "von-Willebrand-Faktor" (vWF) von allen Endothelzellen außer den Leber-Endothelzellen synthestisiert (48). Organspezifische Unterschiede sind auch für die endotheliale Produktion von Plasminogen-Aktivator (PA), welcher entscheidend für die Synthese des Fibrinolyseenzymes Plasmin verantwortlich ist, und für PAI beschrieben (45).

Ebenfalls TF wird nur von einigen Endothelzellen, darunter Endothelzellen der Lunge, gebildet (38).

Thrombin, eine Serinprotease, welche Fibrinogen zu Fibrin konvertiert, stimuliert die Thrombozyten- aktivierung und die endotheliale Freisetzung von Eicosanoiden wie PGI₂(21, 47). Thrombin-Bindungs- stellen sind auf verschiedenen Endothelzellen in sehr unterschiedlicher Menge nachzuweisen und dadurch verändert sich die Wachstumsempfindlichkeit der jeweiligen Zellen auf eine Thrombinstimulation (10).

Am empfindlichsten gegenüber den verschiedenen biologischen Aktivitäten von Thrombin scheinen mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge zu sein, da sie auf Thrombinperfusion mit einer Permeabilitäts- steigerung und deutlich erhöhter Leukozytenbindung reagieren (40, 42). Dagegen zeigten sich Endothel- zellen vom Schaf und vom Schwein unempfindlich gegenüber Thrombinstimulation (37, 47).

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Tabelle 1: Die unterschiedliche Regulation von Inflammationsmediatoren durch mikrovaskuläre Lungenendo- thelzellen (LMVEC) und makrovaskuläre Endothelzellen (MEC).

Parameter LMVEC MEC

CXC-Chemokinsynthese hoch niedrig

CXC-Chemokinrezeptorenexpression CXCR1, 2, 3, 4 CXCR4

ICAM-1-Expression

basal hoch gering

nach Zytokinstimulation hoch schwach

nach Endotoxinstimulation schwach hoch

VCAM-1-Expression

basal negativ negativ

nach Zytokinstimulation hoch negativ

E-Selectin-Expression

nach Zytokinstimulation lange Expressionszeit kurze Expressionszeit

nach Endotoxinstimulation kurz lang

L-Selection-Liganden positiv negativ

MHCII-Expression hoch niedrig

CD36-Expression positiv negativ

Nitritbildung gering hoch

Thrombinsensitivität hoch gering

Plasminogenaktivator

uPA hoch niedrig

tPA niedrig hoch

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Intensivmedizin

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Vergleich phänotypischer Eigen- schaften mikrovaskulärer Endothel- zellen der Lunge mit makrovaskulären Endothelzellen unter Inflammations- bedingungen

Es ist bekannt, daß sich im Verlaufe einer Sepsis – un- abhängig von der auslösenden Ursache – neben einem akuten Nierenversagen am häufigsten ein ARDS entwickelt. In der Pathogenese des ARDS spielen mikro- vaskuläre Endothelzellen der Lunge (LMVEC) durch ihre große Anzahl (2,77 x 10¹¹Zellen), ihre exponierte Lage zum strömenden Blut sowie ihre Fähigkeit, PMN zu adhärieren und eine Reihe von Inflammations- mediatoren freizusetzen, eine aktive Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung der Entzündung.

Pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen zeichnen sich durch extrem dünne Zellwände (Zellschicht < 1 µm), kleinen Durchmesser und hohe kontinuierliche Dichte aus (9, 16, 59). Sie besitzen enge interzelluläre Verbindungen und bilden eine größere Barriere gegenüber Makromolekülen als eine makrovaskuläre Endothelzellschicht (52). Phänotypische Verände- rungen von LMVEC unter septischen Bedingungen sind bisher meist durch In-vitro-Studien an Endothelzellen, kultiviert aus Lungen verschiedener Tiere, beobachtet worden oder es wurde aus dem Phänotyp von MVEC anderer humaner Gewebe auf das Verhalten der LMVEC geschlossen (24, 25, 77).

Seit kurzem werden LMVEC von einigen Arbeits- gruppen, darunter auch unserer Arbeitsgruppe, aus gesundem humanem Lungengewebe, z.B. nach Opera- tionen bei Tumorgenese oder unmittelbar post mor- tem isoliert (16). Einige der speziellen Eigenschaften der LMVEC, welche bisher untersucht wurden und im Rahmen eines ARDS eine Rolle spielen, sollen im Folgenden dargestellt werden (Tab. 1).

Chemokine- und Chemokinrezeptoren

In eigenen Studien haben wir die Produktion und mRNA-Expression verschiedener Vertreter der CXC- (IL-8, ENA-78, Gro-α) sowie CC- (MCP-1) und CX3C- (Fraktalkine) Chemokinfamilie unstimulierter und stimulierter LMVEC im Vergleich zu HUVEC untersucht. Eine schwache basale Synthese war für fast alle Chemokine bei LMVEC, nicht aber bei HUVEC nachweisbar. Nach TNF-α-Stimulation konnte eine erhöhte makrovaskuläre Produktion der Chemokine MCP-1 und IL-8 im Vergleich mit LMVEC gefunden werden. Nach Stimulation mit IL-1 oder Endotoxin (LPS) aber synthetisierten wiederum LMVEC signifikant mehr MCP-1, IL-8, ENA-78, Gro-α sowie Fraktalkine als HUVEC und reagierten damit deutlich sensibler auf eine bakterielle Stimulation. Auch auf molekularer Ebene konnte dieses Ergebnis bestätigt werden (4).

Erste funktionelle Untersuchungen mittels Chemo- taxie-Assay zeigten, daß sich die vermehrte Chemo- kinsynthese durch LMVEC in einer erhöhten Zahl migrierender Entzündungszellen widerspiegelt (Abb. 1).

Es ist bekannt, daß es unter septischen Bedingungen zu einer signifikanten Erhöhung der Serumkate- cholaminspiegel kommt (42). Wir untersuchten daher, ob eine Katecholamintherapie zu möglichen phänoty- pischen Veränderungen von LMVEC führt und fan- den, daß die Stimulation von LMVEC mit Dopamin oder Dobutamin zu einer signifikanten Inhibition der ENA-78 und Gro-α- und zu einer Steigerung der IL-8- Synthese führte. Eine vergleichbare Regulation der Synthese der CXC-Chemokine konnte auch bei LPS- vorstimulierten LMVEC sowie ausgehend von gerin- geren Chemokinkonzentrationen auch bei HUVEC gezeigt werden. Diese Dopamin-induzierten Effekte sind wahrscheinlich durch die Induktion von oxidati- vem Streß vermittelt, da sie durch Supplementierung von Antioxidantien und Radikalfängern komplett zu antagonisieren waren (3).

Adhäsionsmoleküle

Für die Entwicklung eines ARDS spielt vor allem der durch PMN induzierte Endothelzellschaden eine wesentliche Rolle. Es konnte beobachtet werden, daß LMVEC wesentlich sensibler, d.h. mit größerem Zytotoxizitätspotential als Pulmonalarterien- oder venenzellen auf eine Inkubation mit stimulierten PMN

Abbildung 1:Chemotaxie-Assay

LMVEC und HUVEC wurden für verschiedene Zeiträume mit LPS (1µg/ml) stimuliert. Die Zellkulturüberstände wurden gesammelt und je 25µl in das untere Kompartiment einer Chemotaxiekammer gegeben, welche vom oberen Kompartiment durch eine semipermeable Membran getrennt ist. In das obere Kompartiment wird die Leuko- zytensuspension zugegeben und die Kammer für zwei Stunden inkubiert. Die in die Membran migrierten Leuko- zyten werden gefärbt und ausgezählt (Methode siehe 62). Die Daten sind arithmetische Mittelwerte von 3fach Messungen mit Standardabweichung (MW ± SD). Die Experimente wurden 3 x bestätigt. Die statistische Auswer- tung erfolgte mittels Mann-Whitney-Test.

* p<0,05 ist statistisch signifikant im Vergleich zum Ausgangswert LMVEC,

** p<0,05 ist statistisch signifikant im Vergleich zwischen LMVEC und HUVEC,

°° p<0,05 ist statistisch signifikant im Vergleich zum Ausgangswert HUVEC.

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reagierten (61). Im Vergleich zwischen HUVEC und LMVEC konnte gezeigt werden, daß eine Kurzzeit- stimulation der Zellen mit TNF-α(4 Stunden) zu einer um 32% vermehrten Adhäsion von PMN an LMVEC führte und eine Langzeitstimulation (12 Stunden) diese vermehrte Adhäsion von PMN bis auf 65% stei- gerte. Die basale Adhäsionsaktivität gegenüber PMN war dagegen bei beiden Zelltypen gleich (67).

LMVEC sind im Gegensatz zu vielen anderen Endo- thelzellen in der Lage, sechs verschiedene Adhäsions- moleküle, PCAM, VCAM, ICAM, ELAM, P-Selectin und E-Selectin, zu exprimieren. Für das große proin- flammatorische Potential dieser Zellen spricht dabei, daß außer ICAM-1 alle Adhäsionsmoleküle erst nach Stimulation produziert werden (9).

In klinisch orientierten Studien konnte beobachtet werden, daß LMVEC, isoliert von Patienten, die an einem ARDS verstarben, wesentlich sensibler als LMVEC gesunder Kontrollpatienten waren. Sowohl die basale Expression von ICAM-1 als auch die Synthese von IL-6 und IL-8 war bei ARDS-LMVEC deutlich erhöht und besonders nach Stimulation mit TNF-α wurden diese Mediatoren von LMVEC vermehrt synthetisiert. Es konnte auch gezeigt werden, daß in ein und derselben Lunge die LMVEC wesentlich mehr ICAM-1 als die makrovaskulären Pulmonal- arterienzellen exprimierten (39).

In eigenen Untersuchungen konnten wir wiederum zeigen, daß, ähnlich wie es für die Chemokinsynthese zu beobachten war, mittels Dopaminsupplementie- rung auch die Expression der Adhäsionsmoleküle VCAM-1 und E-Selectin auf LMVEC inhibiert werden konnte.

Eicosanoidsynthese

Ausgehend von der Beobachtung, daß es bei ARDS- Patienten zu einer signifikanten Erhöhung der Kon- zentration der "Inflammations"-PLA₂ (PLA₂-IIA) in Serum und Bronchiallavage-Flüssigkeit kommt, untersuchten wir, ob LMVEC zu diesen hohen PLA₂-IIA- Spiegeln beitragen können. Nach proinflammatorischer Stimulation der LMVEC und HUVEC mit Endotoxin, TNF-α oder IL-1 konnte keine sPLA₂- Aktivität gemessen werden. Nach Stimulation mit exo- genen supplementierten PLA₂war jedoch eine deutlich erhöhte sPLA₂-Aktivität und danach eine vermehrte Freisetzung von Arachidonsäure aus LMVEC gegenüber HUVEC zu messen (Abb. 2). Diese exoge- ne sPLA₂-Therapie induzierte neben der erhöhten AA-Freisetzung auch eine Steigerung der Chemokin- und Adhäsionsmolekülsynthese der LMVEC. Es konnte nachgewiesen werden, daß LMVEC zwar selbst keine sPLA₂synthetisieren, aber sensible Ziel- zellen der Aktionen exogener oder wahrscheinlich auch anderweitig endogen synthetisierter sPLA₂sind.

In Versuchen am Schwein konnten die früher bereits zitierten Ergebnisse bestätigt werden, daß LMVEC unter ruhenden Bedingungen mehr PGE₂als Pulmo- nalarterienzellen produzieren und daß diese erhöhte

Produktion auch nach Stimulation mit TNF-α oder IL-1 erhalten bleibt (85, 86, 10).

Redoxsystem

LMVEC haben unter Inflammationsbedingungen gegenüber HUVEC eine verminderte NO-Synthese- rate. Dies ist von Bedeutung, da kürzlich ein klarer Zusammenhang zwischen NO-Synthese und PMN- Adhäsion am Endothel gezeigt werden konnte. Eine Hemmung der iNOS-Aktivität führte zu einer vermehrten Adhäsion von PMN am Endothel, wogegen die Therapie mit NO diese Adhäsion verminderte (56).

Es wird heute postuliert, daß die geringe iNOS- Aktivität in LMVEC in Zusammenhang mit der induzierten ICAM-1-Expression zu stehen scheint (57).

Gerinnung

LMVEC scheinen unter Inflammationsbedingungen eine deutlich erhöhte prokoagulatorische Aktivität und einen vermehrten Anteil an intrazellulärem PA und PAI im Vergleich zu mikrovaskulären Endo- thelzellen (MVEC) des Gehirns zu haben. Gleichzeitig wird auch Thrombomodulin, ein Protein C-Aktivator, welcher die aktivierten Faktoren V und VIII zerstört, vermehrt von LMVEC synthetisiert. Im allgemeinen scheinen LMVEC unter basalen Bedingungen weniger koagulatorisch, unter proinflammatorischer Stimula- tion aber mehr prokoagulatorisch als MVEC des Gehirnes zu sein (40).

Es ist bekannt, daß PA in zwei verschiedenen Formen vorkommen kann. Zum einen als Urokinase-Typ

Abbildung 2:Effekte humaner sPLA₂-IIA auf die ³H-Arachi- donsäure-Freisetzung in LMVEC und HUVEC

LMVEC und HUVEC werden für 24 Stunden mit 3H- Arachidonsäure inkubiert, danach gewaschen und für verschiedene Zeiteinheiten mit humaner sPLA₂-IIA stimuliert (Methode siehe 13). Die Arachidonsäurekonzen- tration in den Zellkulturüberständen wird anschließend in einem Szintillationszähler gemessen. Die Daten sind arithmetische Mittelwerte von 3fach Messungen mit Standard- abweichung (MW ± SD). Die Experimente wurden 3 x bestätigt. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-Test.

* p<0,05 im Vergleich zu Basalwerten LMVEC oder HUVEC

** p<0,05 im Vergleich zwischen LMVEC und HUVEC

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Intensivmedizin

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(uPA), welcher in die Gewebereorganisation nach proinflammatorischer Stimulation involviert ist und somit den Prozeß der Gewebereparation reguliert (1). Zum anderen als Gewebe-Typ (tPA), welcher die Fibrino- lyseaktivierung vermittelt (68). Es konnte beobachtet werden, daß LMVEC sowohl unter basalen Bedingungen als auch nach Stimulation mit IL-1 oder TNF-α signifikant mehr uPA als HUVEC oder auch hepatische MVEC synthetisieren. Dies bedeutet, daß LMVEC zur Aufrechterhaltung der normalen alveolären Funktion beitragen und daß diese Protek- tion bei einer Schädigung der Zellen, wie sie beim ARDS zu finden ist, entfällt (85).

In weiteren Studien konnte mittels immunhistochemi- schen Färbungen demonstriert werden, daß auch die Synthese von vWF in den einzelnen Endothelzellpo- pulationen der Lunge unterschiedlich stark ist (88).

Schlußfolgerung

Hauptschwerpunkt unserer Untersuchungen war die In-vitro-Analyse der phänotypischen Veränderungen humaner mikrovaskulärer Endothelzellen der Lunge unter proinflammatorischen Stimulationsbedin- gungen. Es konnte gezeigt werden, daß LMVEC in dieser Situation mit einer deutlich gesteigerten Immunantwort gegenüber makrovaskulären Endo- thelzellen reagieren. Die hohe Sensitivität der Lunge gegenüber multiplen Entzündungsmediatoren könnte erklären, warum das ARDS häufig eine der ersten Organmanifestationen im Rahmen einer Sepsis ist.

Die Möglichkeit, spezielle morphologische und funktionelle Veränderungen dieser Endothelzellen von Gesunden und von Patienten mit pulmonaler Inflam- mation analysieren zu können, ist ein wesentlicher Fortschritt im weiteren Studium der Pathomecha- nismen eines ARDS. Darauf aufbauend können Strategien entwickelt werden, um den peripheren Endothelzelldysfunktionen und -schäden entgegenzu- wirken bzw. sie zu therapieren.

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Korrespondenzadresse:

Dr. med.Grietje Beck

Institut für Anästhesiologie und Operative Intensivmedizin Universitätsklinikum Mannheim Theodor-Kutzer-Ufer 1 - 3 D-68167 Mannheim.