Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
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Johanna Bennemann Hannover 2013
Deutschen Nationalbibliografie;
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1. Auflage 2013
© 2013 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-159-2
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
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Experimentelle Untersuchungen zur Ermittlung des Einflusses der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Maturation boviner Oozyten auf die globale DNA-
Methylierung in Zygoten nach In-vitro-Fertilisation (IVF)
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Johanna Bennemann
Eckernförde
Hannover 2013
Klinik für Rinder, Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
1. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Christine Wrenzycki
2. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. med vet. Sabine Meinecke-Tillmann
Tag der mündlichen Prüfung: 02.05.2013
in Liebe und Dankbarkeit
2.1 In-vitro-Produktion von Embryonen ... 3
2.1.1 Bedeutung des Sauerstoffs in der In-vitro-Produktion von Embryonen ... 5
2.1.1.1 Auswirkungen unterschiedlicher Sauerstoffkonzentrationen während der In-vitro-Maturation von Oozyten auf die Qualität der Eizellen und Embryonen ... 8
2.1.1.2 Auswirkungen unterschiedlicher Sauerstoffkonzentrationen während der In-vitro-Fertilisation und der In-vitro-Kultur auf die Qualität der resultierenden Embryonen ... 13
2.2 Epigenetik ... 18
2.2.1 DNA-Methylierung ... 19
2.2.1.1 DNA-Methylierung in Gameten ... 20
2.2.1.2 DNA-Methylierung während der präimplantatorischen Embryonalentwicklung ... 23
2.2.1.2.1 DNA-Methylierung in Zygoten... 23
2.2.1.2.2 DNA-Methylierung in embryonalen Furchungsstadien... 28
2.2.1.3 Ausgewählte Studien zur immunzytochemischen Analyse der globalen DNA-Methylierung in Keimzellen und präimplantatorischen Embryonen verschiedener Säugetierspezies... 30
2.2.2 Histon-Modifikationen ... 35
2.2.3 Nicht-kodierende RNAs ... 36
2.2.4 Veränderungen des Epigenoms ... 36
2.2.4.1 Beeinflussung epigenetischer Modifikationen durch Umweltbedingungen ... 37
2.2.4.2 Beeinflussung der DNA-Methylierung durch assistierte Reproduktionstechnologien ... 41
2.2.4.2.1 In-vitro-Kultur ... 41
2.2.4.2.1.1 Medien für die In-vitro-Kultur... 43
2.2.4.2.2 Somatischer Zellkerntransfer („Klonen“) ... 44
2.2.5.2 Affinitätsreinigung methylierter DNA durch Methylierte DNA Immunopräzipitation oder Methyl-CpG-bindende Domänen
enthaltende Proteine... 49
2.2.5.3 Bisulfit-Behandlung ... 51
2.2.5.4 Mikroarrays und Sequenzierungsverfahren ... 54
2.2.5.5 Ausgewählte Beispiele zur genomweiten DNA- Methylierungsanalyse in Gameten und präimplantatorischen Embryonen ... 56
2.2.5.6 Immunzytochemische Analyse ... 57
2.2.5.7 Ausgewählte Beispiele zur genspezifischen DNA- Methylierungsanalyse in Gameten und präimplantatorischen Embryonen ... 59
2.2.5.8 Nachweis de 5-Hydroxymethylcytosins... 61
3 Material und Methoden ... 63
3.1 In-vitro-Produktion von Rinderembryonen ... 63
3.1.1 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen ... 63
3.1.2 In-vitro-Maturation... 66
3.1.3 In-vitro-Fertilisation ... 67
3.1.4 Denudierung ... 68
3.2 Etablierung eines Protokolls zur immunzytochemischen Darstellung des 5-Methylcytosins in in vitro produzierten präimplantatorischen Embryonen des Rindes... 69
3.2.1 Vorbehandlung der Embryonen ... 70
3.2.1.1 Verdau der Zona pellucida... 71
3.2.1.2 Handhabung der Embryonen... 72
3.2.1.3 Erste Fixierung... 74
3.2.1.4 Erste Permeabilisierung... 74
3.2.1.5 Denaturierung der DNA ... 75
3.2.1.6 Neutralisierung... 75
3.2.1.9 Blockierung ... 76 3.2.2 Inkubation mit dem Anti-5-Methylcytidine-Antikörper
(Primärantikörper) ... 78 3.2.3 Inkubation mit dem Sekundärantikörper ... 79 3.2.4 Kontrollen... 80 3.3 Etablierung eines Färbeprotokolls zur Darstellung des Gesamt-
DNA-Gehaltes in vitro produzierter präimplantatorischer
Embryonen des Rindes... 81 3.3.1 Prüfung verschiedener Farbstoffe auf ihre Eignung zur Darstellung
des Gesamt-DNA-Gehaltes in vitro produzierter Zygoten des
Rindes... 82 3.3.1.1 Versuche zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole ... 85 3.3.1.2 Versuche zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit
Propidiumiodid ... 87 3.3.1.3 Versuche zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit
Hoechst 33258... 89 3.3.1.4 Versuche zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit
Hoechst 33342... 91 3.3.1.5 Versuche zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit
Ethidium Homodimer-1 ... 94 3.3.1.6 Versuche zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit
Ethidium Homodimer-2 ... 96 3.4 Einfluss der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Reifung
boviner Oozyten auf die globale DNA-Methylierung in vitro
produzierter Zygoten... 98 3.4.1 In-vitro-Maturation boviner Oozyten bei unterschiedlichen
Sauerstoffkonzentrationen ... 98
3.4.2.1 Vorbehandlung der Embryonen ... 99
3.4.2.2 Inkubation mit dem Primär- und Sekundärantikörper... 101
3.4.2.3 Kontrollen... 102
3.4.3 Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes boviner Embryonen mit Hoechst 33342... 102
3.5 Fluoreszenzmikroskopie ... 103
3.6 Auswertung der Fluoreszenzbilder mit ImageJ ... 106
3.7 Statistische Auswertung... 109
3.8 Allgemeiner Versuchsaufbau ... 110
3.8.1 Versuchsanordnung... 110
3.8.1.1 Etablierung eines immunzytochemischen Protokolls zur Darstellung des 5-Methylcytosins in in vitro produzierten präimplantatorischen Embryonen des Rindes... 110
3.8.1.2 Etablierung eines Färbeprotokolls zur Darstellung des Gesamt- DNA-Gehaltes in bovinen in vitro produzierten Zygoten ... 111
3.8.1.3 Untersuchung des Einflusses der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Reifung boviner Oozyten auf die DNA-Methylierung in vitro produzierter Zygoten ... 112
4 Ergebnisse... 114
4.1 In-vitro-Produktion boviner Embryonen... 114
4.2 Etablierung eines immunzytochemischen Protokolls zur Darstellung des 5-Methylcytosins in in vitro produzierten präimplantatorischen Embryonen des Rindes... 114
4.2.1 Vorbehandlung der Embryonen ... 117
4.2.1.1 Verdau der Zona pellucida... 117
4.2.1.2 Handhabung der Embryonen... 120
4.2.1.3 Erste Fixierung... 121
4.2.2 Inkubation mit dem Anti-5-Methylcytidine-Antikörper (Primärantikörper) ... 122
4.3 Etablierung eines Färbeprotokolls zur Darstellung des Gesamt- DNA-Gehaltes in in vitro produzierten präimplantatorischen bovinen
Embryonen ... 125
4.3.1 Eignung verschiedener Farbstoffe zur Darstellung des Gesamt- DNA-Gehaltes in bovinen in vitro produzierten Zygoten ... 125
4.3.1.1 Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole ... 125
4.3.1.2 Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit Propidiumiodid... 126
4.3.1.3 Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit Hoechst 33258 ... 128
4.3.1.4 Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit Hoechst 33342 ... 130
4.3.1.5 Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit Ethidium Homodimer-1 . 132 4.3.1.6 Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit Ethidium Homodimer-2 . 134 4.4 Auswirkungen der Sauerstoffkonzentrationen während der In-vitro- Reifung boviner Eizellen auf die DNA-Methylierung in vitro produzierter Zygoten... 137
4.4.1 In-vitro-Reifung boviner Eizellen bei unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen ... 137
4.4.2 Nicht ausgewertete Embryonen... 139
4.4.3 Vergleich des Ausmaßes der Methylierung des Cytosins in den maternalen und paternalen Vorkernen innerhalb einer Versuchsgruppe sowie zwischen beiden Versuchsgruppen ... 141
4.4.3.1 Normalisierte 5mC-Signale der elterlichen Pronuklei (Reifung bei 5 % O2) ... 142
4.4.3.2 Normalisierte 5mC-Signale der elterlichen Pronuklei (Reifung bei 20 % O2) ... 143
4.4.3.3 Normalisierte 5mC-Signale der maternalen Pronuklei (Reifung bei 5 % O2 und bei 20 % O2) ... 144
4.4.3.4 Normalisierte 5mC-Signale der paternalen Pronuklei (Reifung bei 5 % O2 und bei 20 % O2) ... 145
5 Diskussion ... 147
5.1 Die Immunzytochemie als Nachweismethode der globalen DNA- Methylierung in präimplantatorischen Embryonen ... 148
5.2 Einfluss der In-vitro-Maturation auf die Methylierung der DNA ... 154
5.3 Schlussfolgerungen ... 161
6 Zusammenfassung ... 162
7 Summary ... 167
8 Verzeichnis der Medien und Einzeldaten... 171
8.1 Medien für die In-vitro-Produktion ... 171
8.1.1 Medien für die In-vitro-Maturation ... 171
8.1.2 Medien für die In-vitro-Fertilisation... 175
8.1.3 Medien für die In-vitro-Kultur... 179
8.2 Materialien für die In-vitro-Produktion ... 182
8.3 Medien für die Immunzytochemie ... 184
8.4 Medien für die Färbung der DNA ... 186
8.5 Materialien für die Färbung der Zygoten ... 188
8.6 Einzeldaten aus dem Versuchsteil... 190
8.6.1 Anzahl der in den Vorversuchen verwendeten Embryonen ... 190
8.6.2 Anzahl gefärbter sowie ausgewerteter Embryonen nach In-vitro- Reifung bei 5 % O2 und bei 20 % O2... 190
8.6.3 Ergebnisse der Auswertungen mit ImageJ ... 191
9 Verzeichnis der Abkürzungen ... 193
10 Verzeichnis der Abbildungen ... 199
11 Verzeichnis der Tabellen ... 202
12 Literaturverzeichnis... 206
1 Einleitung
Die In-vitro-Produktion von Embryonen stellt ein etabliertes biotechnologisches Verfahren dar. Trotz stetiger Verbesserungen ihrer Teilschritte, der In-vitro- Maturation, In-vitro-Fertilisation und In-vitro-Kultur, sind die mit dieser Technik gewonnenen Embryonen im Vergleich zu in vivo entwickelten Individuen gleicher Entwicklungsstadien von minderer Qualität (LONERGAN 2007; RIZOS et al. 2008).
Neben Veränderungen im Metabolismus (KHURANA u. NIEMANN 2000b;
THOMPSON 2000), der Kryotoleranz (POLLARD u. LEIBO 1994; RIZOS et al. 2002) und hinsichtlich morphologischer Kriterien (VAN SOOM et al. 1992; POLLARD u.
LEIBO 1994) konnten auch auf molekularer Ebene Differenzen zwischen den Embryonen beider Herkünfte festgestellt werden. So weisen in vitro produzierte Embryonen ein verändertes Expressionsmuster einer Vielzahl von Genen auf (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003; WRENZYCKI et al. 2005; LONERGAN et al. 2006;
WRENZYCKI et al. 2007).
Die Methylierung der DNA stellt eine epigenetische Modifikation dar, die in die Regulation der Genexpression involviert und für die normale Entwicklung eines Säugetiers essentiell ist (LI et al. 1992; BIRD 2002). Der Begriff Epigenetik umfasst alle vererbbaren, reversiblen Vorgänge, die Veränderungen am genetischen Material hervorrufen, ohne dabei die Basensequenz der DNA zu verändern (SHI et al. 2003).
Die Methylierung der DNA verändert die Chromatin-Struktur und führt meist zu einer Unterdrückung der Gen-Expression (DENNIS 2003). Die mit der Methylierung des Cytosins in der DNA einhergehende transkriptionelle Stilllegung von Genen ist in die X-Chromosom-Inaktivierung (BEARD et al. 1995), Prägung von Genen (LI 2002), Hemmung der Transkription endogener Retroviren (WALSH et al. 1998) sowie in die Entstehung von Tumoren (JONES u. BAYLIN 2002) involviert. Ein Einfluss der In- vitro-Kulturbedingungen auf das Methylierungsmuster von Genen wurde bereits sowohl auf globaler Ebene (SHI u. HAAF 2002; ZAITSEVA et al. 2007; YOSHIZAWA et al. 2010; REIS E SILVA et al. 2012) als auch locusspezifisch (KHOSLA et al.
2001; THOMPSON et al. 2001) nachgewiesen.
Die Bedingungen während der In-vitro-Reifung müssen es der Oozyte ermöglichen, die Meiose fortzusetzen, um schlussendlich das Stadium der Metaphase II zu erreichen. Oozyten werden in vitro meist unter annähernd atmosphärischen Sauerstoff (O2)-konzentrationen gereift (COMBELLES et al. 2009), während sie in vivo zu keinem Zeitpunkt ihrer Entwicklung atmosphärischen O2-Konzentrationen ausgesetzt sind (BAVISTER 1995). Über den Einfluss einer reduzierten O2- Konzentration auf diverse Qualitätsparameter der Oozyten und Embryonen (PINYOPUMMINTR u. BAVISTER 1995; HASHIMOTO et al. 2000; OYAMADA u.
FUKUI 2004; BANWELL et al. 2007), konnten bisher keine übereinstimmenden Ergebnisse erzielt werden. Von einer Beeinflussung der Genexpression bestimmter Loci durch unterschiedliche Sauerstoffkonzentrationen während der In-vitro- Maturation wird hingegen berichtet (BERMEJO-ALVAREZ et al. 2010; KANG et al.
2011). Durch verschiedene O2-Konzentrationen in der In-vitro-Kultur ist auch die Expression von Genen auf globaler Ebene verändert (RINAUDO u. SCHULTZ 2004;
RINAUDO et al. 2006).
Von besonderem Interesse ist die Frage, ob die Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Reifung von Oozyten auch die DNA-Methylierung verändert. Zur Klärung dieser Frage erfolgte in dieser Arbeit die In-vitro-Maturation boviner Oozyten bei unterschiedlichen O2-Konzentrationen (5 % und 20 %). Die aus der In-vitro-Reifung sowie -Befruchtung hervorgegangenen Zygoten wurden nachfolgend einer immunzytochemischen Färbung des 5-Methylcytosins unterzogen. Schließlich erfolgte ein Vergleich der globalen DNA-Methylierung der Zygoten beider Reifungsgruppen.
2 Literatur
2.1 In-vitro-Produktion von Embryonen
Die In-vitro-Produktion (IVP) gliedert sich methodisch in drei Schritte (Abbildung 1):
die In-vitro-Maturation oder -Reifung (IVM), In-vitro-Fertilisation oder -Befruchtung (IVF) und In-vitro-Culture oder -Kultur (IVC; NIEMANN u. MEINECKE 1993).
Die für die IVP benötigten Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) können durch Follikelpunktion im Rahmen des „Ovum pick up“ (PINYOPUMMINTR u. BAVISTER 1995) vom lebenden Tier oder aus Schlachttier-Ovarien isoliert werden. Hier werden die KOK mittels Aspiration aus der Follikelflüssigkeit gewonnen oder durch die sogenannte Slicing-Methode, bei der die Oberfläche der Ovarien mithilfe von Rasierklingen eingeschnitten und die Follikelhöhle eröffnet wird (ECKERT u.
NIEMANN 1995). Anschließend erfolgt die Einteilung der KOK nach Abbildung 1: Schematische Darstellung der In-vitro-Produktion
(mod. nach NIEMANN u. MEINECKE 1993) Morulae/Blastozysten
Unreife Eizellen
In-vitro-Befruchtung, 6-24 Stunden
Spermien
In-vitro-Reifung, 18-27 Stunden
In-vitro- Kapazitation
In-vitro-Kultivierung, 6-8 Tage
morphologischen Kriterien in für die IVP taugliche und nicht taugliche Zellen (KHURANA u. NIEMANN 2000a; KELLY et al. 2007). Die selektierten KOK werden nun gewaschen und in das Reifungsmedium überführt, in welchem sie für 18-27 Stunden verbleiben (NAGAI 2001; LANE u. GARDNER 2004; SIRARD u.
COENEN 2006). Während der In-vitro-Reifung kommt es zur Fortsetzung der Meiose, in deren Prophase (Diplotän) die Eizellen zuvor arretiert waren (NIEMANN u.
MEINECKE 1993; SIRARD u. COENEN 2006). In vitro durchlaufen ungefähr 90 % unreifer Oozyten eine Reifung von der Prophase I bis zur Metaphase II (LONERGAN et al. 2006; RIZOS et al. 2008). Vor der In-vitro-Fertilisation erfolgt die Aufbereitung der Spermien (PARRISH 1991) mittels einer Dichtegradientenzentrifugation. Diese dient der Erhöhung des Anteils an motilen Spermien für die IVF (PARRISH et al.
1995). Für die Aufreinigung des Spermas hat sich die Verwendung diskontinuierlicher Dichtegradienten im Vergleich zum Swim-Up-Verfahren als effizienter erwiesen, was an höheren Prozentzahlen motiler Spermien mit guter Befruchtungsfähigkeit erkennbar war (MCCLURE et al. 1989; ENGLERT et al. 1992;
NG et al. 1992; ZIEBE u. ANDERSEN 2002). Früher wurde zu diesem Zweck häufig Percoll, ein aus PVP (Polyvinylpyrolidon)-beschichteten Siliziumdioxidpartikeln bestehendes Dichtegradientenmedium, verwendet. Dieses wurde 1996 jedoch aufgrund fehlender klinischer Prüfung vom Markt genommen und ist seither nicht mehr für die IVP in der Human- und Veterinärmedizin zugelassen. Der Endotoxingehalt einiger Percoll-Chargen war zehn- bis 100-fach höher als von der Food and Drug Administration der Vereinigten Staaten von Amerika zugelassen (SVALANDER et al. 1995). Heute werden kommerzielle Silikate verwendet (Spermfilter®, Cryos International, Dänemark; PureSperm® und BoviPure®, Nidacon, Schweden). Heparin löst in bovinen Spermien die für die Befruchtungsfähigkeit essentielle Akrosomreaktion aus (HANDROW et al. 1982; LENZ et al. 1982;
PARRISH et al. 1985) und führte in vitro zu einer Erhöhung der Befruchtungsraten (PARRISH et al. 1985). Nach der 6-24-stündigen In-vitro-Fertilisationsphase folgt die Umsetzung der vermeintlichen Zygoten in ein Kulturmedium (LANE u. GARDNER 2004). In der In-vitro-Produktion boviner Embryonen erreichen selten mehr als 40 % der Embryonen das Stadium der Blastozyste (LONERGAN u. FAIR 2008). Die
Zusammensetzung der für die In-vitro-Kultur verwendeten Medien hat in den letzten Jahren einige Veränderungen erfahren. Anfangs wurden vorwiegend komplexe Medien wie das Tissue Culture Medium 199 (TCM 199) verwendet (EYESTONE u.
FIRST 1989), denen undefinierte (z.B. Serum), semidefinierte (z.B. Bovines Serum Albumin (BSA)) oder definierte (z.B. Polyvinylalkohol (PVA)) Stoffe zugesetzt wurden (PINYOPUMMINTR u. BAVISTER 1995). Um die Qualität der Embryonen sowie die Entwicklungsraten bis zum Blastozytenstadium zu verbessern, erfolgte eine Entwicklung weiterer In-vitro-Kultursysteme (FARIN et al. 2001). Das Synthetic Oviduct Fluid (SOF; SHALGI et al. 1972; TERVIT et al. 1972) diente dabei als Grundlage für die Entwicklung einfacher Medien (KESKINTEPE u. BRACKETT 1996). So wurde, um ein definiertes Medium zu schaffen, das BSA im SOF-Medium unter anderem durch PVA (SAEKI et al. 1991; FONTES et al. 1992; KESKINTEPE et al. 1995; KESKINTEPE u. BRACKETT 1996) oder PVP (SAEKI et al. 1991; FONTES et al. 1992; KESKINTEPE et al. 1995) ersetzt.
2.1.1 Bedeutung des Sauerstoffs in der In-vitro-Produktion von Embryonen
Trotz stetiger Fortschritte in der In-vitro-Produktion innerhalb der letzten Jahre weisen in vitro generierte Embryonen qualitative Unterschiede zu ihren in vivo entwickelten Gegenstücken auf (GARDNER u. LANE 2005; WRENZYCKI et al.
2005; LONERGAN et al. 2006; WRENZYCKI et al. 2007; RIZOS et al. 2008).
Veränderungen der physiologischen Prozesse in den Embryonen können durch zahlreiche Faktoren in der In-vitro-Kultur, wie die Formulierung der verwendeten Medien (FLEMING et al. 2004; GARDNER u. LANE 2005; THOMPSON et al. 2007) und die Sauerstoffkonzentrationen im Inkubator (HARVEY 2007; TAKAHASHI 2012), hervorgerufen werden und stellen mögliche Ursachen für die qualitative Minderwertigkeit der in vitro produzierten Embryonen dar.
Im Rahmen einer Studie wurden bovine Oozyten vergleichend bei 5 % CO2 und 5 % O2, 10 % O2 oder 20 % O2 in vitro maturiert. Eine reduzierte atmosphärische Sauerstoffkonzentration verminderte den Anteil an Eizellen, die die meiotische Metaphase II erreichten, deutlich. Die Befruchtungsraten der bei 5 % O2 gereiften Oozyten waren niedriger als die der anderen Gruppen (PINYOPUMMINTR u.
BAVISTER 1995). Im Ovidukt von Kaninchen und im Uterus von Kaninchen und Hamstern lag die O2-Konzentration bei 8,7 % (60 mmHg; FISCHER u. BAVISTER 1993). Die O2-Konzentration in der Follikelflüssigkeit von Frauen im Alter von 41-51 Jahren lag nach einer hCG (Humanes Choriongonadotropin)-Stimulation durchschnittlich bei 8 % (54 mmHg; SHALGI et al. 1972). In einer weiteren Studie konnte in der Follikelflüssigkeit des Menschen eine O2-Konzentration von ≤ 1 % bis ca. 5,5 % gemessen werden (VAN BLERKOM et al. 1997). Die O2-Konzentration in porcinen Follikeln betrug in vivo durchschnittlich 8 % (51 mmHg), in den Follikeln von Schlachthof-Ovarien im Durchschnitt 7 % (44 mmHg; KNUDSEN et al. 1978). Die präovulatorische intrafollikuläre O2-Konzentration laktierender Rinder lag in einer Studie bei 6,9 % ± 0,4 % und tendierte zu einer negativen Korrrelation mit dem Follikeldurchmesser (DE CASTRO et al. 2008).
Zellulärer Sauerstoff wird hauptsächlich von der Atmungskette in den Mitochondrien verbraucht (RICHTER 1992; AMBROSIO et al. 1993). Reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) stellen Nebenprodukte des aeroben Stoffwechsels einer Zelle dar. Zu diesen gehören u.a. das Superoxid-Anion (O2·-), Hydrogenperoxid (H2O2) und das Hydroxyl-Radikal (OH·). Sie sind sehr reaktiv und dazu bestrebt, ein Elektron eines anderen Moleküls auf sich zu übertragen. Der initiale Schritt der Bildung von ROS stellt die Synthese des Superoxid-Anions durch die Übertragung eines Elektrons auf ein Sauerstoffmolekül dar (MCCORD u. FRIDOVICH 1969). Die Enzymfamilie der Superoxid-Dismutasen schützt vor Schädigungen durch das Superoxid-Anion, indem sie dessen Umwandlung zu H2O2 und Sauerstoff katalysiert (FRIDOVICH 1978). Oozyten weisen eine hundertfach höhere Anzahl an Mitochondrien als somatische Zellen auf (MICHAELS et al. 1982), was ihren hohen Energiebedarf für Wachstum und Differenzierung widerspiegelt (TAKAHASHI 2012).
Die Toxizität einer hohen O2-Konzentration ist vorwiegend bedingt durch die Bildung
freier Radikale und reaktiver Spezies (FRIDOVICH 1976; FREEMAN u. CRAPO 1982; HALLIWELL u. GUTTERIDGE 1984). So konnte nach einer In-vitro-Kultur von Embryonen bei 20 % O2 die Bildung von ROS, wie z.B. Hydrogenperoxid, nachgewiesen werden (NASR-ESFAHANI et al. 1990; GOTO et al. 1993). Auch eine weitere Studie berichtet von einer 15- bis 22-fachen Erhöhung der H2O2- Konzentration nach einer In-vitro-Kultur boviner Embryonen bei 20 % O2 verglichen mit einer Inkubation bei 5 % O2 (FAVETTA et al. 2007). Zudem induzierten ROS DNA-Strangbrüche (RHAESE u. FREESE 1986; TAKEUCHI et al. 1996). Weiterhin führte eine Supplementation der Kulturmedien mit freien Radikalfängern (NODA et al.
1991; GOTO et al. 1993) oder Reduktionsmitteln (TAKAHASHI et al. 1993;
TAKAHASHI et al. 2002) zu einer Verbesserung der Entwicklungsraten zum Blastozystenstadium auch unter atmosphärischen Bedingungen (20 % O2). Auch über eine protektive Wirkung von Kumuluszellen bei oxidativem Stress während der In-vitro-Maturation porciner Oozyten (TATEMOTO et al. 2000) sowie der In-vitro- Fertilisation boviner Eizellen wurde bereits berichtet (FATEHI et al. 2005). Die Messung der Aktivitäten der antioxidativ wirkenden Enzyme Superoxid-Dismutase, Catalase und Glutathion-Peroxidase in bovinen Oozyten und Kumuluszellen im Rahmen eine Studie konnte zeigen, dass die Enzymaktivitäten vor der In-vitro- Maturation in Kumuluszellen signifikant höher waren als in denudierten Oozyten.
Nach der Reifung in vitro konnten hinsichtlich der Aktivitäten dieser Enzyme jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen Oozyten und Kumuluszellen festgestellt werden, bedingt durch einen Anstieg der Enzymaktivitäten in Oozyten sowie eine Reduktion der Aktivität der antioxidativen Enzyme in Kumuluszellen (CETICA et al.
2001).
Die Fähigkeit von Zellen auf Veränderungen der O2-Konzentration in ihrer Umgebung zu reagieren, ist von der Aktivierung der zu einer Transkriptionsfaktorfamilie gehörenden Hypoxia-inducible-factors (HIFs) abhängig (SEMENZA 1998, 2000). Ihr Hauptkomplex besteht aus den zwei Proteinuntereinheiten HIF1β und HIF1α.
Hypoxia-inducible-factor 1β wird konstitutiv, HIF1α hingegen nur bei niedrigen O2- Konzentrationen exprimiert (WANG et al. 1995; SEMENZA 2001). Auch weitere Alpha-Untereinheiten, zu denen die HIF2α und die HIF3α gehören, sind bereits
bekannt (GU et al. 1998; WIESENER et al. 1998). Hypoxia-inducible-factor α- Proteine werden zwar unter physiologischen O2-Konzentrationen kontinuierlich synthetisiert, erfahren jedoch schnell eine Degradierung durch das Ubiquitin- Proteasom-System (BRUICK u. MCKNIGHT 2001; LANDO et al. 2002). Hypoxia- inducible-factors modulieren die Expression zahlreicher Gene und regulieren die Adaption von Zellen an unterschiedliche O2-Konzentrationen (SEMENZA 1998).
Auch die O2-sensitiven Glucose-Transporter GLUT1 und GLUT3 werden transkriptionell durch die HIF1-Proteine reguliert (SEMENZA et al. 1994). Die Kultur boviner Embryonen bei 2 % O2 führte im Vergleich zu einem 7- bzw. 20 %igen O2- Gehalt während der Kultur zu einer signifikant erhöhten Expression des GLUT1- Gens. Weiterhin war die Expression des O2-sensitiven VEGF (vascular endothelial growth factor)-Gens in den bei 2 % O2 kultivierten Embryonen höher als in denjenigen, die bei 20 % O2 inkubiert wurden. Die mRNA-Expression von HIF1α und HIF2α wurde durch unterschiedliche O2-Konzentrationen in der Kultur hingegen nicht beeinflusst. Weiterhin waren keine Unterschiede zwischen den VEGF-, HIF1α- sowie HIF2α-Expressionsmustern in vivo- und in vitro produzierter Embryonen erkennbar (HARVEY et al. 2004).
2.1.1.1 Auswirkungen unterschiedlicher Sauerstoffkonzentrationen während der In-vitro-Maturation von Oozyten auf die Qualität der Eizellen und Embryonen
Einen Ansatzpunkt zur Optimierung der In-vitro-Produktion bietet die In-vitro- Maturation. Dass diese noch verbesserungswürdig ist, zeigen die Ergebnisse von Studien, in denen der Anteil an Oozyten, welche das Blastozystenstadium erreichten, nach einer Maturation in vivo größer war als nach einer Reifung in vitro (GREVE et al. 1987; LEIBFRIED-RUTLEDGE et al. 1987; MARQUANT-LE GUIENNE et al.
1989). In einer weiteren Arbeit führte der Einsatz in vivo gereifter Eizellen acht Tage nach der In-vitro-Fertilisation und einer In-vitro-Kultur zu Blastozystenraten von
58,2 %, eine Maturation der Oozyten in vitro hingegen resultierte in reduzierten Entwicklungsraten von bis zu 46,5 % (RIZOS et al. 2002). In vitro produzierte bovine Embryonen wiesen hingegen keine Unterschiede im mRNA-Expressionsmuster ausgewählter entwicklungsrelevanter Gene im Vergleich zu ihren in vivo gereiften und in vitro produzierten Gegenstücken auf (KNIJN et al. 2002).
Eizellen von Rindern und anderen Säugetieren sind in vivo im Diplotän-Stadium der ersten meiotischen Prophase arretiert. Werden meiotisch kompetente Oozyten aus der Follikelflüssigkeit entfernt, können sie in vitro in einem geeigneten Medium die Meiose fortsetzen, indem sie zunächst die Anaphase sowie die Telophase 1 durchlaufen und schließlich die zweite meiotische Metaphase (KOBAYAKAWA et al.
2007) erreichen, in welcher sie größtenteils bis zum Zeitpunkt ihrer Befruchtung verbleiben (PAVLOK et al. 2005). Kumuluszellen fördern die In-vitro-Reifung von Oozyten bis zum MII-Stadium und sind an der zytoplasmatischen Reifung beteiligt (HASHIMOTO et al. 1998). In vivo führt ein starker Anstieg der Konzentration des Luteinisierenden Hormons zu einem fortschreitenden Wachstum des dominanten Follikels sowie zu einer Vollendung der Reifung der Oozyte, welche schließlich das Stadium der meiotischen Metaphase II erreicht (HYTTEL et al. 1986; HYTTEL et al.
1989; HYTTEL et al. 1997). Das Wachstum der Follikel von 1,2 bis 4 mm (speziesspezifisch) auf die präovulatorische Größe (> 14 mm beim Rind) erstreckt sich in vivo über mehrere Tage. Die Maturation der Oozyten in vitro, die bei bovinen Eizellen meist 24 Stunden andauert, umfasst also einen vergleichsweise kürzeren Zeitraum (DE MATOS et al. 1996; LEDDA et al. 1997).
Der Einfluss unterschiedlicher Sauerstoffkonzentrationen während der In-vitro- Maturation auf ausgewählte Qualitätsparameter der Oozyten und der aus der In-vitro- Kultur hervorgegangenen Embryonen wurde bereits in zahlreichen Studien untersucht. Arbeiten, die einen positiven Einfluss einer reduzierten (≤ 10 %) O2- Konzentration während der IVM auf die Qualität der Embryonen nachweisen konnten, sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 2 enthält eine Übersicht über Studien, die einen positiven Effekt einer annähernd atmosphärischen O2-Konzentration während der IVM auf verschiedene Qualitätsmerkmale der Embryonen darstellen konnten. In Tabelle 3 sind Untersuchungen gelistet, in denen kein signifikanter bzw.
kein eindeutiger Einfluss der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Maturation auf diverse Qualitätsparamteter der aus der In-vitro-Kultur hervorgegangenen Embryonen und Feten erkennbar war.
Tabelle 1: Studien zum positiven Einfluss einer reduzierten (≤ 10 %) O2- Konzentration während der In-vitro-Maturation (IVM) von Oozyten auf
ausgewählte Qualitätsparameter der aus der In-vitro-Kultur (IVC) hervorgegangenen Embryonen
Quelle Tierart
O2- Konzen- tration in
der IVM
Untersuchter Parameter
Einfluss der O2- Konzentra-
tion HASHIMOTO
et al. (2000) Rind 5 % Entwicklungsrate zum
Blastozystenstadium Positiv KIKUCHI et al.
(2002) Schwein 5 % Gesamtzellzahl der
Blastozysten Positiv Gesamtzellzahl der
Blastozysten Positiv IWAMOTO et
al. (2005) Schwein 5 % Vorkernformation und Ausschleusung des zweiten Polarkörpers
Positiv PREIS et al.
(2007) Maus 5 % Gesamtzellzahl der
Blastozysten Positiv Blastozystenrate
Durchschnittliche Zellzahl der Blastozysten KARJA et al.
(2004) Schwein
8-10 % (in IVM, In-vitro- Fertilisa-
tion, IVC) DNA-Fragmentation der Blastozysten
Positiv
Tabelle 2: Studien zum positiven Einfluss einer annnähernd atmosphärischen (20%) O2-Konzentration während der In-vitro-Maturation (IVM) von Oozyten auf
ausgewählte Qualitätsparameter der Eizellen sowie der aus der In-vitro-Kultur hervorgegangenen Embryonen
Quelle Tierart
O2- Konzen- tration in
der IVM
Untersuchter Parameter
Einfluss der O2- Konzentra-
tion OYAMADA u.
FUKUI (2004) Rind 20 % Furchungsrate,
Blastozystenrate Positiv PARK et al.
(2005) Schwein 20 % Blastozystenrate Positiv
Tabelle 3: Studien zum nicht signifikanten oder nicht eindeutigen Einfluss unterschiedlicher O2-Konzentrationen während der In-vitro-Maturation (IVM)
auf ausgewählte Qualitätsparameter von Embryonen und Nachkommen
Quelle Tierart
O2- Konzen- tration in
der IVM
Untersuchter Parameter
Einfluss der O2- Konzentra-
tion
Teilungsrate Entwicklungsrate Lebend-Tot-Zell-Ratio
der expandierten Blastozysten ABELE,
STINSHOFF et al. (2012)
Rind 5 % und 20 %
Totale Zellzahl der Blastozysten
Nicht signifikant
2 %, 5 %, 10 % und
20 % (IVM)
Maturation, Fertilisation, Teilungs- und Entwicklungsraten
Nicht signifikant
2% (IVM) Trophektoderm-Zellzahl Positiv 2% (IVM) Prozentsatz an
apoptotischen Zellen Positiv 2 %, 5 %,
10 % und 20 % (IVM)
Implantation und Entwicklungsraten zu
lebensfähigen Feten
Nicht signifikant BANWELL et
al. (2007) Maus
5 % (IVM) Gewicht der Feten Negativ
2.1.1.2 Auswirkungen unterschiedlicher Sauerstoffkonzentrationen während der In-vitro-Fertilisation und der In-vitro-Kultur auf die Qualität der resultierenden Embryonen
Studien, die einen positiven Einfluss einer reduzierten (≤10 %) O2-Konzentration während der In-vitro-Fertilisation von Oozyten auf die Qualität der Embryonen nach einer In-vitro-Kultur nachweisen konnten, sind in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 5 enthält eine Übersicht über Untersuchungen, die positive Auswirkungen einer reduzierten (≤10 %) O2-Konzentration während der In-vitro-Kultur von Embryonen auf deren Qualität belegen.
Tabelle 4: Studien zum positiven Einfluss einer reduzierten (≤ 10 %) O2- Konzentration während der In-vitro-Fertilisation (IVF) von Oozyten auf
ausgewählte Qualitätsparameter der aus der In-vitro-Kultur (IVC) hervorgegangenen Embryonen
Quelle Tierart
O2- Konzen- tration in
der IVF
Untersuchter Parameter
Einfluss der O2- Konzentra-
tion TAKAHASHI u.
KANAGAWA (1998)
Rind 5 % Blastozystenrate Positiv Blastozystenrate
Durchschnittliche Zellzahl der Blastozysten KARJA et al.
(2004) Schwein
8-10 % (in In-
vitro- Matura- tion, IVF,
IVC) DNA-Fragmentation der Blastozysten
Positiv
Tabelle 5: Studien zum positiven Einfluss einer reduzierten (≤10 %) O2- Konzentration während der In-vitro-Kultur (IVC) von Embryonen auf deren
Qualität
Quelle Tierart
O2- Konzen- tration in
der IVC
Untersuchter Parameter
Einfluss der O2- Konzentra-
tion
Schaf 8 % Positiv
THOMPSON et
al. (1990) Rind 4 %; 8 %
Durchschnittliche
Zellzahl pro Embryo Positiv FUJITANI et al.
(1997) Rind 5 % Blastozystenrate Positiv
Blastozystenrate OLSON u.
SEIDEL (2000) Rind 5 %
Zellzahl pro Embryo
Positiv
Blastozystenrate GARDNER u.
LANE (1996) Maus 7 %
Blastozystenzellzahl
Positiv
Rate geschlüpfter Blastozysten LI u. FOOTE
(1993) Kaninchen ≤10 %
Zellzahl der Embryonen
Positiv
Rate expandierter und/oder geschlüpfter
Blastozysten BATT et al.
(1991) Ziege 7 %
Durchschnittliche Zellzahl der Embryonen
Positiv
Morphologie (Durchmesser der
Embryonen) LINDENAU u.
FISCHER (1994)
Kaninchen ≤5 %
Zellproliferation
Positiv
Fortsetzung Tabelle 5: Studien zum positiven Einfluss einer reduzierten (≤10 %) O2-Konzentration während der In-vitro-Kultur (IVC) von Embryonen auf deren
Qualität
Quelle Tierart
O2- Konzen- tration in
der IVC
Untersuchter Parameter
Einfluss der O2- Konzentra-
tion
KATZ-JAFFE
et al. (2005) Maus 5 %
Übereinstimmung der Proteinprofile mit denen
in vivo entwickelter Embryonen
Positiv
KARJA et al.
(2006) Schwein 5 % Totale Zellzahl der
Blastozysten Positiv Blastozystenrate
Durchschnittliche Zellzahl der Blastozysten KARJA et al.
(2004) Schwein
8-10 % (in In-
vitro- Matura- tion, In- vitro- Fertilisa- tion, IVC)
DNA-Fragmentation der Blastozysten
Positiv
Rinaudo et al.
(2006) Maus 5 % Totale Zellzahl der
Blastozysten Positiv
Studien, in denen kein signifikanter oder kein eindeutiger Einfluss der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Kultur von Embryonen auf deren Qualität festgestellt werden konnte, sind in Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 6: Studien zum nicht signifikanten oder nicht eindeutigen Einfluss unterschiedlicher O2-Konzentrationen während der In-vitro-Kultur (IVC) auf ausgewählte Qualitätsparameter von Embryonen, Plazenta und Nachkommen
Experimentelle Untersuchungen zum Einfluss der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Kultur auf die Expression ausgewählter Gene in präimplantatorischen Embryonen sind in Tabelle 7 gelistet.
Quelle Tierart
O2- Konzen- tration in
der IVC
Untersuchter Parameter
Einfluss der O2- Konzentra-
tion 5 % (IVC) Geburtsgewicht Negativ 5 % (IVC)
Größenparameter (z.B.
Länge von Femur und Humerus)
Positiv FISCHER-
BROWN et al.
(2005)
Rind
5 % (IVC) Fläche der Kotyledonen Negativ Teilungsrate
KHURANA u.
NIEMANN (2000a)
Rind
5 % und 20 %
(IVC) Entwicklungsrate zur Morula und Blastozyste
Nicht signifikant Blastozystenrate Nicht
signifikant Gesamtzellzahlen der
Blastozysten
Nicht signifikant HARVEY et al.
(2004) Rind
2 %, 7 % und 20 % (IVC, ab
dem Morula- stadium)
Durchschnittliche Zellzahl von Trophektoderm und Innerer Zellmasse der
Blastozysten
Nicht signifikant
HARVEY et al.
(2007b) Rind
2 %, 7 % und 20 % (IVC, ab
dem Morula- stadium)
Blastozystenrate Nicht signifikant
Tabelle 7: Studien zum Einfluss unterschiedlicher O2-Konzentrationen während der In-vitro-Kultur (IVC) auf die Expression ausgewählter Gene in
präimplantatorischen Embryonen
Quelle Tierart
O2- Konzen- tration in
der IVC
Untersuchte Gene
Expres- sion der
Gene
Laktatdehydrogenase A
Erhöht nach IVC
bei 2 % O2
Aldose-Reduktase, Cyclooxygenase 2, Inducible Nitric Oxide
Synthase
Nicht signifikant
verändert Harvey et al.
(2007a) Rind
2 %, 7 % und 20 % (ab dem
Morula- stadium)
Superoxid Dismutase 1 und 2, Glutathion
Peroxidase
Nicht signifikant
verändert
Harvey et al.
(2007b) Rind
2 %, 7 % und 20 % (ab dem
Morula- stadium)
Myotrophin, Anaphase Promoting Complex 1
Vermindert nach IVC
bei 20 % O2
Rinaudo et al.
(2006) Maus 5 % und
20 %
Vergleich des Genexpressionsprofils
mit dem in vivo entwickelter Embryonen
Größere Überein- stimmung nach IVC bei 5 % O2
Kind et al.
(2005) Maus
2 %, 7 % und 20 % (ab dem
Morula- stadium)
GLUT-1, GLUT-3 und VEGF
Erhöht nach IVC bei 2 % O2
2.2 Epigenetik
Während der Gametogenese und der präimplantatorischen Entwicklung eines Individuums unterliegt das Epigenom Veränderungen in Form einer Reprogrammierung (Abbildung 2), welche die Entfernung epigenetischer Markierungen und eine sich anschließende Erstellung eines neuen Markierungsmusters beinhaltet (REIK et al. 2001; RIDEOUT et al. 2001; SURANI 2001). Zu den epigenetischen Modifikationen gehören die DNA-Methylierung, Histon- Modifikationen und nicht-kodierende RNAs (HALES et al. 2011), welche im Folgenden erläutert werden.
Abbildung 2: Epigenetische Reprogrammierung in Keimzellen und präimplantatorischen Embryonen (MORGAN et al. 2005)
2.2.1 DNA-Methylierung
Die DNA-Methylierung ist in die Regulation der Genexpression, die Prägung („Imprinting“) von Genen sowie die Inaktivierung des X-Chromosoms involviert (HALES et al. 2011). Die Methylierung der Cytosin-Reste der DNA wird als einer der bedeutendsten Mechanismen in der Kontrolle der Gen-Expression angesehen (SCHAEFER et al. 2007). Die Übertragung der Methylgruppen an die Position 5 des Cytosins innerhalb von Cytosin-phosphatidyl-Guanin (CpG)-Dinukleotiden resultiert in der Bildung des 5-Methylcytosins (5mC) und wird von den DNA- Methyltransferasen katalysiert (TRASLER 2009). Mehr als die Hälfte der CpG- Dinukleotide des Säuger-Genoms sind methyliert und liegen als Inseln in den Promotor-Regionen der DNA vor (LARSEN et al. 1992). Bisher wurden bei Säugetieren fünf DNA-Methyltransferasen (DNMTs) charakterisiert: Die DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b sowie die DNMT3L (DNMT3-like; GOLL u. BESTOR 2005). Nur die DNMT1, DNMT3a und DNMT3b sind in vivo in der Lage, die DNA aktiv zu methylieren. Die DNMT1 ist für die Aufrechterhaltung der Methylierungsmuster während der Replikation der DNA verantwortlich und wird daher auch als „Erhaltungs-Methyltransferase“ bezeichnet. Die oozytenspezifische Transkriptvariante der DNMT1, die oozytäre DNMT1 (DNMT1o), entsteht durch Alternatives Spleißen geschlechtsspezifischer 5’-Exone der DNMT1-mRNA und konnte bereits in bovinen Oozyten und präimplantatorischen Embryonen nachgewiesen werden (MERTINEIT et al. 1998). Die DNMT1o ist ausschließlich in Oozyten und präimplantatorischen Embryonen bis zum Blastozystenstadium exprimiert und wird schließlich durch die somatische Isoform (DNMT1s) ersetzt (CARLSON et al. 1992; MERTINEIT et al. 1998). Die DNMT1-mRNA wird ebenfalls in Spermatozyten im Pachytän-Stadium exprimiert (SINGER-SAM et al. 1990;
TRASLER et al. 1992; NUMATA et al. 1994), das DNMT1s-Protein konnte in diesem Stadium jedoch nicht nachgewiesen werden (MERTINEIT et al. 1998). Im Gegensatz zur DNMT1 sind die DNMT3a und DNMT3b für die „De-novo-Methylierung“ der DNA zuständig. Die DNMT3L ist nicht dazu in der Lage, die DNA selbstständig zu
methylieren, interagiert jedoch mit der DNMT3a und DNMT3b und verstärkt somit das Vorhandensein dieser DNA-Modifikation (OKANO et al. 1999).
Die Methylierung der DNA ist für den Vorgang des genomischen Imprintings von großer Wichtigkeit. Das genomische Imprinting („Prägung der Gene“) stellt einen epigenetischen Mechanismus dar, durch den ein elterliches Allel methyliert wird, was eine monoallelische Gen-Expression zur Folge hat, da die Methylierung des betroffenen Allels dessen Expression unterdrückt. Die unterschiedliche DNA- Methylierung beider elterlichen Allele erfolgt in ihren regulatorischen differentiell methylierten Regionen (DMRs; NEUMANN et al. 1995). Diese DMRs bestehen meist aus Cytosin-Guanin-reichen Sequenzen oder CpG-Inseln innerhalb von Promotorregionen (DELGADO et al. 1998; TILGHMAN 1999; REIK u. WALTER 2001). Geprägte Gene finden sich häufig nicht über das gesamte Genom verteilt, sondern in sogenannten „Clustern“ innerhalb der CpG-Inseln (NEUMANN et al. 1995;
REIK u. WALTER 2001). Die Zahl der geprägten Gene im Genom des Menschen und der Maus wird auf 100 bis 200 geschätzt (LUCIFERO et al. 2004a). Geprägte Gene unterliegen nach der Fertilisation keinem Demethylierungsvorgang, sondern erhalten ihr Methylierungsmuster aufrecht (OLEK u. WALTER 1997; LANE et al.
2002). Die DMRs insbesondere der paternal geprägten Gene werden während der präimplantatorischen Entwicklung vor allem in ihren peripheren Regionen partiell demethyliert, anschließend jedoch einer Remethylierung unterzogen, was eine dynamische Regulation offenbart (TOMIZAWA et al. 2011).
2.2.1.1 DNA-Methylierung in Gameten
Zum Zeitpunkt der Befruchtung weisen Spermien ein hohes Ausmaß an Methylierungen repetitiver Sequenzen sowie paternal geprägter Gene auf. Ihr globaler DNA-Methylierungsgrad ist jedoch niedriger als der somatischer Zellen (ADAMS et al. 1983). Spermien stellen hochdifferenzierte Zellen mit spezialisierten Funktionen dar. Dennoch ähnelt der genomweite Methylierungsstatus der
Promotoren im Spermiengenom dem der Promotoren in embryonalen Stamm- und Keimzellen (FARTHING et al. 2008). Dies lässt vermuten, dass die Promotoren des Spermien-Genoms keiner extensiven Reprogrammierung im Rahmen einer Demethylierung nach der Befruchtung bedürfen, und die genomweite Entfernung der Methylgruppen im väterlichen Vorkern der Zygote wahrscheinlich vorzugsweise Transposons sowie Intergene- und Intragene-Abschnitte der DNA betrifft (FARTHING et al. 2008). Tatsächlich konnte eine massive Demethylierung der zur Line1-Familie gehörigen Retrotransposons im Genom der Maus nach der Befruchtung nachgewiesen werden (LANE et al. 2003). Trotz der weitestgehenden Übereinstimmung des Methylierungsmusters des Spermiengenoms mit den Methylierungsmustern pluripotenter Zelltypen gibt es einige erwähnenswerte und wichtige Ausnahmen: Die Promotoren der Gene, welche für Nanog (homeobox transcription factor), Lefty1 (left-right determination factor 1) und Brd1 (bromodomain containing protein 1) kodieren, weisen einen hohen Methylierungsgrad in Mäuse- Spermien auf (FARTHING et al. 2008). In einer anderen Studie konnte gezeigt werden, dass die Gene Nanog, ECAT1 (embryonic stemcell-associated transcript 1), Fbx15 (F-box only protein 15) und Fgf4 (fibroblast growth factor 4), welche in embryonalen Stammzellen der Maus in hohem Maße exprimiert werden, in männlichen Keimbahn-Stammzellen der Maus nicht exprimiert werden. Ebenso konnte zwar ein hohes RNA-Expressions-Level der Gene Oct3/4 (octamer-binding transcription factors 3/4) und Sox2 (SRY (sex determining region Y)-box 2), welche Nanog, Fbx15 und Fgf4 aktivieren, nachgewiesen werden, der gemessene Proteingehalt war jedoch gering (IMAMURA et al. 2006). Die obengenannten Gene stellen Regulatoren der Pluripotenz dar. Daher sollten diese Gene in nicht pluripotenten Zellstadien, wie somatischen Zellen und späten Stadien der Spermatogenese, dauerhaft stillgelegt sein. Um jedoch eine Pluripotenz früher embryonaler Entwicklungsstadien zu gewährleisten, müssen diese Gene eine Reprogrammierung durch eine Demethylierung nach der Fertilisation durchlaufen.
Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass der Promotor des Nanog-Gens zügig nach der Befruchtung einer sowohl aktiven als auch passiven Demethylierung unterliegt und im Stadium der Morula, zu Beginn der Expression des Gens, sogar nahezu
unmethyliert vorliegt. Diese Demethylierung ist für die Expression des Nanog-Gens notwendig, was an einer transkriptionellen Stilllegung des Nanog-Promotors in embryonalen Stammzellen durch eine De-novo-Methylierung deutlich wurde (FARTHING et al. 2008).
Während des Wachstums muriner Oozyten kommt es zu einem Anstieg der globalen DNA-Methylierung (KAGEYAMA et al. 2007) sowie zu einer Methylierung der maternal geprägten Gene (LUCIFERO et al. 2004b). In reifen Eizellen der Maus sind repetitive DNA-Sequenzen vollständig methyliert (RIVERA 2010). So konnte eine Methylierung des repetitiven retrovirusähnlichen Intrazisternalen A Partikels während des Oozytenwachstums der Maus nachgewiesen werden (LUCIFERO et al. 2004b).
Zur Erläuterung des Ausmaßes der Promotor-Methylierung in Oozyten eignen sich die Ergebnisse einer Studie, die den Methylierungsgrad von fünf Pluripotenzgenen in bovinen Oozyten und Spermien vergleichend untersuchte. Das Gen Sox2 war in den Gameten weitestgehend unmethyliert. Die Promotoren der Gene Oct4 und Fgf4 waren hingegen in Spermien im Vergleich zu Oozyten hypermethyliert. Rex1 (reduced expression protein 1; zinc finger protein 42 (zfp42)) wies in beiden Gameten einen hohen Methylierungsgrad auf, war jedoch in Spermien im Vergleich zu Oozyten noch stärker methyliert. Nanog wiederum zeigte sowohl in Spermien als auch in Eizellen eine ähnlich niedrige Methylierung (LAN et al. 2010).
In einer weiteren Studie erfolgte die Untersuchung des geprägten IGF2 (insulin like growth factor 2)-Gens in bovinen Gameten. Die Methylierungsgrade der Introns 4 und 5 sowie des Exons 4 der Eizellen und Spermien unterschieden sich nicht signifikant voneinander. Das Ausmaß der Methylierung des Exons 10 zeigte hingegen signifikante Unterschiede zwischen den Gameten. So konnte in Spermien eine sechsfach höhere Methylierung im Vergleich zu in vitro maturierten Oozyten ermittelt werden, was auf das Vorhandensein einer differentiell methylierten Region im Exon 10 des bovinen IGF2-Gens hinweist (GEBERT et al. 2006).
2.2.1.2 DNA-Methylierung während der präimplantatorischen Embryonalentwicklung
2.2.1.2.1 DNA-Methylierung in Zygoten
Gameten müssen zum Zeitpunkt der Fertilisation eine Reprogrammierung ihres Genoms in Form von Veränderungen epigenetischer Modifikationen durchlaufen, um eine diploide Zygote zu formen. Diese Umgestaltungen betreffen das maternale und paternale Genom in unterschiedlicher Ausprägung (DEAN et al. 2003). Im Säugetierorganismus befindet sich die Oozyte zum Zeitpunkt der Ovulation in der zweiten meiotischen Metaphase und benötigt die Fertilisation als Auslöseimpuls zur Vollendung der Meiose, was schließlich in der Formation des maternalen Pronukleus und der Ausschleusung des zweiten Polarkörpers resultiert (DEAN et al. 2003). Das befruchtende Spermium hingegen ist bereits haploid und sein Genom wird durch Nukleoprotamine zusammengehalten (DEAN et al. 2003). Direkt im Anschluss an die Fertilisation erfolgt in den Spermien der Ersatz der Protamine durch Histone, eine Dekondensation des Chromatins sowie die Formation des männlichen Vorkerns (WRIGHT 1999).
Innerhalb weniger Stunden nach der Fertilisation kommt es nach der Dekondensation des Spermien-Chromatins zu einer raschen Demethylierung des paternalen Genoms (ROUGIER et al. 1998; MAYER et al. 2000; OSWALD et al.
2000; KHOSLA et al. 2001; LANE et al. 2002; SANTOS et al. 2002). Eine Reduktion des paternalen Methylierungsgrades nach der Befruchtung konnte sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten, Schweinen, Rindern und Menschen mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen werden (KHOSLA et al. 2001; BEAUJEAN et al.
2004a; FULKA et al. 2004). Eine weitere Studie konnte mehr als sechs Stunden nach der Fertilisation in Zygoten des Rindes, der Maus sowie des Kaninchens eine deutliche Asymmetrie des 5-Methylcytosin-Fluoreszenzsignals zwischen beiden parentalen Vorkernen erkennen, welche durch ein im Vergleich zum maternalen Pronukleus schwächeres Signal im paternalen Vorkern gekennzeichnet war (LEPIKHOV et al. 2008).
Eine immunzytochemische Analyse der globalen DNA-Methylierung konnte eine deutliche Demethylierung des paternalen Pronukleus ungefähr 8-10 Stunden nach der Befruchtung in Zygoten des Kaninchens feststellen (LEPIKHOV et al. 2008).
Weiterhin konnte mittels Immunfluoreszenz eine globale Demethylierung der DNA in in vivo generierten Vier- bis 16-Zellstadien sowie in in vitro produzierten Zwei- bis Achtzellstadien des Kaninchens nachgewiesen werden (REIS E SILVA et al. 2012).
Im Rahmen einer Analyse des Methylierungsgrades des Single-Copy-Gens SP-A (surfactant protein A) sowie der Satellitensequenz RsatIIE (rabbit satellite sequence IIE) in vivo entwickelter Kaninchenembryonen mittels Bisulfitsequenzierung konnte hingegen in beiden Sequenzbereichen keine Demethylierung während der ersten beiden Furchungsteilungen festgestellt werden. Eine Demethylierung beider Sequenzen konnte erst zwischen dem Acht- und 16-Zellstadium und im SP-A-Gen auch im Morula- und Blastozystenstadium erfasst werden (CHEN et al. 2004). Die Veränderungen im DNA-Methylierungsmuster von Zygoten des Schafes weichen ebenfalls von denen der oben genannten Tierarten ab (BEAUJEAN et al. 2004a;
BEAUJEAN et al. 2004b; SANTOS u. DEAN 2004; YOUNG u. BEAUJEAN 2004).
Der ovine paternale Pronukleus weist nach der Fertilisation einen höheren Methylierungsgrad auf als die väterlichen Vorkerne von Maus und Mensch, ist aber dennoch relativ zum maternalen Pronukleus hypomethyliert. Ein Demethylierungsvorgang konnte jedoch weder im maternalen noch im paternalen Pronukleus des Schafes nachgewiesen werden. Lediglich im Blastozystenstadium war eine Demethylierung der Zellen des Trophektoderms erkennbar, wohingegen die Zellen der Inneren Zellmasse ihren Methylierungsstatus aufrecht erhielten (BEAUJEAN et al. 2004b; YOUNG u. BEAUJEAN 2004). Eine aktive globale Demethylierung des paternalen Genoms während der Vorkernentwicklung konnte auch in in vitro produzierten Zygoten der Ziege nicht nachgewiesen werden. Eine immunzytochemische Untersuchung der Zygoten erfolgte sechs, 12, 18 sowie 24 Stunden nach der In-vitro-Fertilisation und zeigte keine Veränderungen der Fluoreszenzintensitäten der Pronuklei (HOU et al. 2005).
Da der Verlust an Methylierungen im paternalen Vorkern vor der Replikation der DNA auftritt, wird dieser Prozess auch als aktive Demethylierung bezeichnet (MAYER et
al. 2000; OSWALD et al. 2000; SANTOS et al. 2002; DEAN et al. 2003; WOSSIDLO et al. 2010). Die Behandlung muriner Zygoten mit Aphidicolin, einer die DNA- Replikation blockierenden Substanz, hatte keine Auswirkungen auf die Verringerung des Methylierungsgrades des paternalen Genoms, was ebenfalls auf einen replikationsunabhängigen, aktiven DNA-Demethylierungsvorgang in Zygoten hinweist (MAYER et al. 2000; OSWALD et al. 2000; SANTOS et al. 2002;
WOSSIDLO et al. 2010).
Die immunzytochemisch nachgewiesene beträchtliche Demethylierung des paternalen Pronukleus muriner Zygoten vier Stunden post fertilisationem, welche sechs Stunden nach der Befruchtung in einem fast vollständigen Verlust der Fluoreszenzsignale des väterlichen Vorkerns resultiert (SANTOS et al. 2002), konnte mittels einer Bisulfitsequenzierung der Retrotransposons Line1 (long interspersed nuclear element 1) und ETn (early retrotransposons) in Mäusezygoten nur in geringerem Ausmaße festgestellt werden (WOSSIDLO et al. 2010). Im Rahmen einer weiteren Studie konnte mittels einer Bisulfit-Sequenzierung eine Demethylierung des Line1-Retrotransposons in Zygoten der Maus nachgewiesen werden, das Intrazisternale A Partikel-Retrotransposon hingegen hielt seinen hohen Methylierungsgrad in der Zygote aufrecht (LANE et al. 2003). In Mäuse-Zygoten, denen es an dem für die präimplantatorische Entwicklung essentiellen Stella (PGC7;
primordial germ cell protein 7)-Protein (PAYER et al. 2003) mangelte, konnte eine Abschwächung des Fluoreszenzsignals des 5-Methylcytosins im maternalen Genom nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass das mütterliche Erbgut normalerweise durch das Stella-Protein vor einer Demethylierung geschützt ist (NAKAMURA et al. 2007).
Neben einer mittels Bisulfit-Sequenzierung ermittelten Demethylierung der DNA zweier Retrotransposons konnte immunzytochemisch auch ein gehäuftes Auftreten von DNA-Strangbrüchen in Zygoten der Maus verzeichnet werden. Der DNA- Strangbruchmarker γH2A.X, welcher die am Serin 139-phosphorylierte Form des H2A.X (Histon H2A Isoprotein) darstellt, konnte direkt nach der Fertilisation in beiden Vorkernen der Maus mit gleicher Fluoreszenzintensität nachgewiesen werden. Vier Stunden post fertilisationem verschwand das Fluoreszenzsignal dann in beiden
Vorkernen vollständig, fünf bis sieben Stunden nach der Befruchtung konnten einige Foci lediglich im paternalen Pronukleus verzeichnet werden. Acht bis neun Stunden nach der Fertilisation war die Verteilung und starke Intensität des Signals zwar in beiden Pronuklei gleich, im väterlichen Vorkern waren jedoch mehr Signale vorhanden als im mütterlichen. Darauf folgend konnte eine Abschwächung der Fluoreszenz in beiden Vorkernen beobachtet werden, aber auch hier wies der paternale Pronukleus eine höhere Anzahl an Signalen auf. Schließlich konnte weder im mütterlichen noch im väterlichen Vorkern eine Fluoreszenz verzeichnet werden (WOSSIDLO et al. 2010). Weitere Studien weisen auf eine Beteiligung der Basen- Excisionsreparatur (BER) an der DNA-Demethylierung des paternalen Säugergenoms hin (ZIEGLER-BIRLING et al. 2009; HAJKOVA et al. 2010;
WOSSIDLO et al. 2010). Die BER stellt einen DNA-Reparaturmechanismus dar, der Basen-Fehlpaarungen in der DNA entfernt und für eine Wiederauffüllung der entstandenen Lücke durch die DNA-Polymerase sorgt. Die Poly (ADP-Ribose)- Polymerase 1 (PARP1), ein Indikator für Einzelstrangbrüche der DNA und eine Komponente des BER (DURKACZ et al. 1980; MALANGA u. ALTHAUS 2005;
GODON et al. 2008), konnte präreplikativ im paternalen Vorkern von Zygoten der Maus in Kolokalisation mit γH2A.X immunzytochemisch nachgewiesen werden (WOSSIDLO et al. 2010). Die Erkenntnisse dieser Studie lassen vermuten, dass die Demethylierung des paternalen Pronukleus in Zygoten zu einem großen Teil durch DNA-Reparatur-Mechanismen vermittelt wird. Die Kolokalisation von PARP1 und γH2A.X lässt zudem annehmen, dass BER an der Demethylierung der DNA beteiligt ist (WOSSIDLO et al. 2010). Eine Behandlung muriner Zygoten mit Methylmethansulfonat, einer Substanz, welche die BER induziert (LUNDIN et al.
2005) und als Zwischenschritt Einzelstrangbrüche der DNA generiert, führte zu einer Verstärkung der Fluoreszenzsignale von γH2A.X und PARP1 in präreplikativen Stadien (WOSSIDLO et al. 2010). Auch über eine Beteiligung der Elongator- Komplex-Proteine (ELP) 1, 3 und 4, welche allesamt Komponenten des Elongator- Komplexes darstellen, an der präreplikativen Demethylierung der DNA des murinen paternalen Genoms wurde in der Literatur bereits berichtet (OKADA et al. 2010). Der Elongator-Komplex stellt einen Protein-Komplex dar, welcher in der
Elongationsphase der Transkription mit der RNA-Polymerase II assoziiert ist (OTERO et al. 1999) und die Aktivität einer Histon-Acetyltransferase aufweist (WINKLER et al. 2002). Es ist derzeit jedoch noch nicht geklärt, über welchen Mechanismus der Elongator-Komplex in den Prozess der Demethylierung involviert ist (SAITOU et al. 2012).
In einer Studie, in der runde Spermatiden, deren DNA noch mit Histonen assoziiert war, in Mäuse-Oozyten injiziert wurden (ROSI = Round Spermatid Injection), konnte keine Demethylierung des paternalen Genoms festgestellt werden. Wurden hingegen reife Spermien, deren DNA hauptsächlich mit Protaminen assoziiert war, durch die sogenannte Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) in die Oozyten injiziert, erfolgte eine Demethylierung des paternalen Genoms (POLANSKI et al. 2008). Diese Beobachtungen lassen darauf schließen, dass der physiologischerweise nach der Fusion von Eizelle und Spermium statt findende Protamin-Histon-Austausch im Genom des Spermiums die Demethylierung der paternalen DNA verursacht. Dass allerdings sowohl die aus der ROSI hervorgegangenen als auch die aus der ICSI stammenden Embryonen keine Unterschiede bezüglich ihrer zeitgemäßen Entwicklung aufwiesen, könnte darauf hinweisen, dass die Demethylierung des paternalen Genoms keine funktionelle Bedeutung für die Entwicklung hat (POLANSKI et al. 2008). Da zur Ermittlung des 5-Methylcytosin-Gehaltes jedoch lediglich eine Immunfluoreszenzanalyse durchgeführt wurde, ist es möglich, dass eine funktionell bedeutsame Demethylierung des paternalen Genoms in den aus der ROSI stammenden Embryonen nicht detektiert wurde (SAITOU et al. 2012).
Die im Folgenden aufgeführten Studien bezüglich der epigenetischen Modifikation 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) sind einem aktuellen Review entnommen und diesem entsprechend zitiert (SAITOU et al. 2012). Der hydroxylierte Metabolit des 5-Methylcytosins, das 5-Hydroxymethylcytosin, wurde erstmals im Genom von Bakteriophagen identifiziert (WYATT u. COHEN 1953). In Neuronen sowie embryonalen Stammzellen der Maus konnte 5hmC ebenfalls bereits nachgewiesen werden (KRIAUCIONIS u. HEINTZ 2009; TAHILIANI et al. 2009).
Immunzytochemische Untersuchungen offenbaren, dass in Zygoten ein Anstieg des 5hmC-Signals mit einer Abschwächung des 5mC-Signals im paternalen Pronukleus
verbunden ist (GU et al. 2011; IQBAL et al. 2011; WOSSIDLO et al. 2011). Dies konnte sowohl in Zygoten der Maus (GU et al. 2011; IQBAL et al. 2011; WOSSIDLO et al. 2011) als auch in Zygoten des Rindes und Kaninchens (WOSSIDLO et al.
2011) nachgewiesen werden. Dieser Anstieg des 5hmC-Signals tritt unabhängig von einer Replikation der DNA auf und persistiert mindestens bis zum Zweizellstadium (IQBAL et al. 2011; WOSSIDLO et al. 2011).
Die Hydroxylierung des 5mCs zu 5hmC wird durch bestimmte Dioxygenasen, die sogenannten Tet (ten-eleven translocation)-1/2/3- Proteine, katalysiert (TAHILIANI et al. 2009; SZWAGIERCZAK et al. 2010; CIMMINO et al. 2011). In TET3-Knockout- Zygoten der Maus konnte im Vergleich zu Wildtyp-Zygoten ein Anstieg des 5mC- Gehaltes sowie verringerte 5hmC-Gehalte im paternalen Genom nachgewiesen werden.
2.2.1.2.2 DNA-Methylierung in embryonalen Furchungsstadien
Die postreplikative Demethylierung der DNA in Zygoten ist im Vergleich zur präreplikativen Entfernung der Methylgruppen beträchtlich. Dabei handelt es sich um eine passive Demethylierung, da dieser Vorgang replikationsabhängig ist und aus dem Ausschluss der DNMT1 aus dem Zellkern resultiert (HOWLETT u. REIK 1991;
CARLSON et al. 1992; HOWELL et al. 2001; RATNAM et al. 2002). Während der präimplantatorischen Entwicklung der Maus konnte der Ausschluss der DNMT1, nicht jedoch der DNMT3a und DNMT3b, aus dem Zellkern mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen werden (MERTINEIT et al. 1998; CARDOSO u. LEONHARDT 1999;
HIRASAWA et al. 2008). So war die DNMT1 in Zwei- und Vierzellstadien sowie in Blastozysten nur zytolasmatisch, im Achtzellstadium hingegen im Zellkern nachweisbar (MERTINEIT et al. 1998; CARDOSO u. LEONHARDT 1999). Eine weitere Studie konnte das Vorhandensein der DNMT1 im Zytoplasma präimplantatorischer Embryonen, jedoch nicht eindeutig in den Zellkernen von Achtzellstadien, immunzytochemisch darstellen (HIRASAWA et al. 2008).
Die DNA-Methylierungsmuster werden vom Einzellstadium an bis zum Stadium der Morula bzw. frühen Blastozyste passiv entfernt (MONK et al. 1987; HOWLETT u.
REIK 1991; KAFRI et al. 1992; ROUGIER et al. 1998; OKANO et al. 1999; LANE et al. 2003; ODA et al. 2006). Eine aktuelle Studie zeigt, dass CpG-Inseln, die in gereiften Oozyten methyliert sind, im Blastozystenstadium einen demethylierten Status aufweisen. Das Ausmaß der Demethylierung entspricht allerdings nicht demjenigen, welches erwartet werden könnte, wenn es im Rahmen einer jeden Furchungsteilung zu einer passiven Demethylierung käme (SMALLWOOD et al.
2011).
Bei der nachfolgenden De-novo-Methylierung der DNA, welche beim Rind zwischen dem 8- bis 16-Zellstadium beginnt (KHOSLA et al. 2001; SHI u. HAAF 2002;
SCHAEFER et al. 2007), kommt es zu einer asymmetrischen Verteilung der Methylgruppen. Diese äußert sich in einem hohen Methylierungsgrad der Zellen der Inneren Zellmasse, aus denen alle Gewebetypen des adulten Organismus hervorgehen. Die Zellen des Trophektoderms, aus denen die meisten extraembryonalen Gewebe einschließlich der Plazenta hervorgehen, weisen im Vergleich weniger Methylgruppen auf, ihr Methylierungsgrad ist mit dem des Morulastadiums gleichzusetzen (SANTOS et al. 2002). Dieses Verteilungsmuster der Methylgruppen stimmt mit dem der somatischen Zellen (hypermethyliert) und dem der extraembryonalen Gewebe (hypomethyliert) überein (DEAN et al. 2003).
2.2.1.3 Ausgewählte Studien zur immunzytochemischen Analyse der globalen DNA-Methylierung in Keimzellen und
präimplantatorischen Embryonen verschiedener Säugetierspezies
Der globale Methylierungsgrad der DNA wurde bereits mehrfach in Keimzellen sowie präimplantatorischen Embryonen verschiedener Säugetierspezies immunzytochemisch untersucht. Eine Übersicht über ausgewählte Studien zur immunzytochemischen Analyse der globalen DNA-Methylierung in Keimzellen und Embryonen verschiedener Spezies ist in Tabelle 8 dargestellt.
Tabelle 8: Ausgewählte Studien zur immunzytochemischen Analyse der globalen DNA-Methylierung in Keimzellen und präimplantatorischen
Embryonen verschiedener Säugetierspezies
Autor
Untersuchte Spezies;
Herkunft der Zellen;
untersuchte Entwicklungsstadien
Ergebnisse
COFFIGNY et al. (1999)
Maus: Keimzellen + Sertolizellen;
4 d post coitum und 4 d post partum
Mäusehoden entnommen
Sertoli-Zellen: stark methyliertes juxtazentromerisches
Heterochromatin; hypomethylierte Chromatiden (Vergleich mit kultivierten Fibroblasten);
Keimzellen: Hypomethylierung des Heterochromatins; stark
methyliertes Euchromatin zwischen d16 + d17 postcoitum
KHOSLA et al. (2001)
Maus, Ratte, Schwein:
Zygoten (in vivo);
Maus: Präimplantatorische Embryonalstadien (in vivo);
Rind: Zygoten + präimplantatorische Embryonalstadien (in vitro + nach somatischem Kerntransfer)
Maus, Ratte, Schwein, Rind:
Demethylierung des paternalen Pronukleus in Zygoten;
Maus: Zunahme der
Methylierungen erst in der Inneren Zellmasse der Blastoysten;
Rind: In 2- bis 8-Zellstadien weitere Reduktion der globalen Methylierung; 8- bis 16-Zellstadium Zunahme der Methylierung;
Geklonte bovine Embryonen:
reduzierte Fluoreszenzintensität in Zygoten und 2-Zellstadien;
Heterogenität der
Methylierungsmuster in Vier- und Achtzellstadien; starke Fluoreszenz in Morulae
BOURC’HIS et al. (2001)
Rind:
Präimplantatorische Embryonalstadien (in vitro + nach somatischem Kerntransfer)
Nach somatischem Kerntransfer:
Keine aktive Demethylieung des väterlichen Vorkerns; keine Unterschiede im Methylierungsgrad der parentalen Genome;
somatisches Methylierungsmuster in präimplantatorischen
Embryonalstadien beibehalten;
hypomethyliertes Euchromatin in Morulae und Blastozysten; höherer Methylierungsgrad im
zentromerischen Heterochromatin
