Die Immunzytochemie als Nachweismethode der globalen DNA-

Die immunzytochemische Darstellung des 5-Methylcytosins stellt eine weit verbreitete Methode zur Untersuchung des Genoms auf Methylierungen dar.

In der vorliegenden Arbeit wurde das 5-Methylcytosin in präimplantatorischen Embryonen des Rindes mithilfe einer indirekten Immunzytochemie dargestellt. Um das Antigen 5-Methylcytosin für die Antikörper zugänglich zu machen, war zunächst ein Verdau der Zona pellucida der Zygoten essentiell. Dreißig Minuten nach der Entfernung der Kumuluszellen erfolgte die Überführung von maximal fünf Zygoten gleichzeitig in die saure Tyrode-Lösung. Es war im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen nicht möglich, eine Inkubationszeit zu identifizieren, die eine vollständige Digestion der Zona pellucida bei gleichzeitig optimaler immunzytochemischer Darstellung des 5-Methylcytosins ermöglichte. In der Mehrheit der Fälle war die Zona pellucida nach einer fünfminütigen Inkubationszeit in dem sauren Milieu noch nicht vollständig verdaut. Auch nach einer Inkubation von zehn Minuten waren einige Zygoten immer noch von einer, wenn auch dünner gewordenen, Zona umgeben. Die erschwerte Digestion der Zona pellucida war vermutlich durch die In-vitro-Kultur der Oozyten bedingt. In Folge der Fertilisation kommt es zu einer erhöhten Widerstandsfähigkeit der Zona pellucida gegenüber Proteasen und verschiedenen chemischen Reagentien. Dieses Phänomen des

„zona-hardenings“ wird durch die Freisetzung des Inhalts der kortikalen Granula der

Oozyte zum Zeitpunkt der Befruchtung hervorgerufen (SCHMELL u. GULYAS 1980).

Eine progressive Resistenz der Zona pellucida gegenüber einer Digestion mit Chymotrypsin konnte in in vitro maturierten murinen Oozyten beobachtet werden. Es wurde als spontanes „zona-hardening“ bezeichnet, da es weder während der Maturation in vivo noch während einer Oozytenkultur unter anaeroben Bedingungen oder im Beisein von Kumuluszellen auftrat und unabhängig von der Freisetzung des Inhaltes der kortikalen Granula beobachtet wurde (DE FELICI u. SIRACUSA 1982).

In der vorliegenden Studie waren die Oozyten während der InvitroMaturation und -Fertilisation jedoch von Kumuluszellen umgeben. Eine weitere Studie berichtet von einer um einige Sekunden oder Minuten verlängerten Digestion der Zona pellucida des Rindes nach einer In-vitro-Maturation und -Fertilisation (IWAMOTO et al. 1999).

Andere Studien wiederum konnten kein Zona-Hardening in vitro gereifter porciner (COY et al. 2002) und boviner (COY et al. 2005) Oozyten nach einer In-vitro-Fertilisation beobachten. Die Diskrepanz der Ergebnisse kann durch Unterschiede in der Qualität der Oozyten, die Verwendung verschiedener Kulturmedien oder auch geringfügige Unterschiede in der Gasatmosphäre während der In-vitro-Kultur bedingt sein. In der vorliegenden Arbeit war kein Vergleich zu in vivo entwickelten Embryonen möglich, weshalb lediglich vermutet werden kann, dass die hohe Widerstandsfähigkeit der Zona pellucida gegenüber der sauren Tyrode-Lösung durch die In-vitro-Kultur bedingt war.

Da das Fluoreszenzsignal des 5-Methylcytosins schon nach einer vorangegangenen fünfminütigen Digestion der Zona pellucida nicht mehr spezifisch, sondern durch eine grüne Fluoreszenz der gesamten Zelle gekennzeichnet war, wurden die getesteten Inkubationszeiten einer Dauer von fünf Minuten oder länger für eine Durchführung in Kombination mit dem in diesem Protokoll verwendeten, spezifisch gegen das 5-Methylcytosin gerichteten Antikörper als ungeeignet eingestuft. Eine zweiminütige Inkubationszeit der Zygoten in der sauren Tyrode-Lösung führte größtenteils nur zu einem partiellen Verdau der Zona pellucida, stellte sich aber dennoch für eine spezifische Bindung des Primär- und Sekundärantikörpers als ausreichend heraus.

Vermutlich ist die fehlende Spezifität der Bindung der Immunglobuline bei längeren Inkubationszeiten durch eine zu starke Schädigung der DNA und somit auch ihres

Bestandteils, des 5-Methylcytosins, durch die saure Tyrode-Lösung bedingt. Es kann angenommen werden, dass die ausgeprägte unspezifische Fluoreszenz, welche die gesamten Zellen erfasste, ebenfalls durch eine starke Schädigung der Zellstrukturen und eine dadurch bedingte unspezifische Bindung der Antikörper hervorgerufen wurde. Gleichzeitig muss eine hohe Konzentration an ungebundenen Immunglobulinen in den Zellen, bedingt durch ein unzureichendes Auswaschen aufgrund der noch erheblichen Dicke der Zona pellucida, als Ursache der ausgeprägten, jedoch unspezifischen Fluoreszenz der Zygoten in Betracht gezogen werden.

Einen weiteren kritischen Schritt in der Etablierung des Protokolls stellte die Ermittlung einer Salzsäurekonzentration dar, die eine für die Bindung des Anti-5-Methylcytosin-Antikörpers essentielle Denaturierung der DNA bewirkte, gleichzeitig aber auch eine Anfärbung der Gesamtheit an Nukleinsäuren mit einem Fluoreszenzfarbstoff ermöglichte. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es nicht, die DNA nach vorangegangener Denaturierung mit einem der getesteten Farbstoffe anzufärben. Die Visualisierung der Nukleinsäuren boviner Zygoten mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI ist sowohl ohne (MINHAS et al. 1984) als auch im Anschluss (DEAN et al. 2001; LEPIKHOV et al. 2008) an eine erfolgte Denaturierung bereits beschrieben worden. Dass die Sichtbarmachung der DNA auch nach Einsatz verschiedener Farbstoffkonzentrationen in den durchgeführten Versuchen nicht möglich, sondern ein unspezifisches, die gesamte Zelle erfassendes Fluoreszenzsignal erkennbar war, kann verschiedene protokollbedingte Ursachen haben. So stellen die Verwendung von Medienzusätzen verschiedener Hersteller genauso wie die Durchführung des Protokolls in einem anderen Labor und die damit einhergehenden unterschiedlichen Voraussetzungen mögliche Gründe für die Diskrepanz der Ergebnisse dar. DAPI weist eine größere Bindungsselektivität zu doppelsträngiger im Vergleich zu einzelsträngiger DNA auf (KAPUSCINSKI u.

YANAGI 1979). Da die DNA in diesem Protokoll durch die Denaturierung jedoch nicht mehr doppelsträngig sondern einzelsträngig vorlag, könnte diese Tatsache ebenfalls als Ursache für eine geringe Bindungsaffinität von DAPI zur DNA in Betracht kommen.

Weiterhin wurde der rote Fluoreszenzfarbstoff Propidiumiodid auf seine Eignung zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes getestet. Nach einer Denaturierung der DNA war es auch mit diesem Farbstoff nicht möglich, ein reproduzierbares spezifisches Fluoreszenzsignal in den Vorkernen der Zygoten zu erzeugen. Da eine Färbung der Nukleinsäuren jedoch ohne eine vorherige Denaturierung möglich war, ist es sehr wahrscheinlich, dass dieser Reaktionsschritt und die dadurch bedingte Einzelsträngigkeit der DNA eine Bindung des Farbstoffes an das Genom erschwerte bzw. unmöglich machte. PI bindet sowohl an DNA (WARING 1965) als auch an RNA (HAUGLAND 2010b). Mit diesem Farbstoff gelang es bereits, den Gesamtgehalt an DNA nach einer Denaturierung der Nukleinsäuren in bovinen in vitro produzierten Zygoten darzustellen (BEAUJEAN et al. 2004a; LEPIKHOV et al. 2008).

Geringfügige Unterschiede in der Durchführung der Protokolle, der Zusammensetzung und Anfertigung der verwendeten Medien sowie die differierenden Laborbedingungen können Gründe für die nicht übereinstimmenden Ergebnisse sein. Weiterhin ist nicht außer Acht zu lassen, dass die Untersuchung einer anderen Spezies, aber auch Unterschiede in der Qualität der verwendeten Oozyten und Spermien die Ergebnisse beeinflussende Faktoren darstellen. Die in dieser Studie beobachtete mangelnde Reproduzierbarkeit der Anfärbung der Pronuklei mit Propidiumiodid kann bei unveränderter Protokolldurchführung durch eine unterschiedliche Qualität der aus Schlachthofovarien gewonnenen Oozyten bedingt sein.

Im Rahmen dieser Studie war nach erfolgter Denaturierung eine Darstellung der Nukleinsäuren in ihrer Gesamtheit mit den Bisbenzimiden Hoechst 33258 sowie Hoechst 33342 nicht möglich. Da diese Farbstoffe selektiv an doppelsträngige DNA binden (HAUGLAND 2010b), ist die nicht erfolgte Anlagerung der Bisbenzimide an das Genom mit großer Wahrscheinlichkeit auf die durch die Denaturierung hervorgerufene Einzelsträngigkeit der Nukleinsäuren zurückzuführen. Die im Rahmen dieser Arbeit gelungene Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes ohne zuvor erfolgte Denaturierung ist ein weiterer Hinweis auf den Denaturierungsschritt als Ursache für die nicht stattgefundene Bindung der Bisbenzimide an die DNA. Die Sichtbarmachung der Nukleinsäuren mit Hoechst 33342 in bovinen in vitro

produzierten Zygoten nach einer Denaturierung ist bereits beschrieben worden (RACEDO et al. 2009). Weiterhin gelang es mit Hoechst 33258, die DNA porciner präimplantatorischer Embryonen nach einer Denaturierung darzustellen (DESHMUKH et al. 2011). Neben dem Speziesunterschied können hier ebenso Abweichungen in der Durchführung der Protokolle, wie z.B. die Verwendung verschiedener Salzsäurekonzentrationen zur Denaturierung, sowie Unterschiede in der Zusammensetzung der Medien als Ursachen für die Diskrepanz der Ergebnisse in Betracht kommen. Auch die Qualität der eingesetzten Oozyten spielt eine große Rolle.

Ethidium Homodimer-1 sowie Ethidium Homodimer-2 sind rote Fluoreszenzfarbstoffe, die mit hoher Affinität an einzelsträngige und doppelsträngige DNA, RNA und Oligonukleotide binden (HAUGLAND 2010b). In der vorliegenden Arbeit war es mit Ethidium Homodimer-1 weder ohne eine zuvor erfolgte Denaturierung der DNA noch im Anschluss an eine solche möglich, den Gesamtgehalt an Nukleinsäuren darzustellen. Mit Ethidium Homodimer-2 war die Darstellung der Pronuklei nicht reproduzierbar und zudem mit einer starken Hintergrundfluoreszenz des Zytoplasmas vergesellschaftet. Die Vermutung einer Wechselwirkung des Farbstoffes mit dem zur Beschichtung der Objektträger gebrauchten Reagenz, dem Repel-Silan Sylon CT^®, konnte durch die Umsetzung des Protokolls in 4-Well-Dishes ausgeschlossen werden. Ein Einfluss des Fixierungsreagens Paraformaldehyd (3,7 %) auf die Bindung des Ethidium Homodimers-2 an die DNA wurde ebenso wenig belegt. Ohne eine vorherige Fixierung der Zygoten war das rote Fluoreszenzsignal zwar deutlich abgeschwächt, jedoch ebenso wenig spezifisch. Ethidium Homodimer-2 ist bereits zur Ermittlung des Gesamt-DNA-Gehaltes in präimplantatorischen Embryonalstadien des Kaninchens erfolgreich verwendet worden (REIS E SILVA et al. 2012). Auch hier stellen neben der Speziesdifferenz Unterschiede im Ablauf der Protokolle, wie z.B. eine nicht durchgeführte Digestion der Zona pellucida sowie eine Fixierung der Embryonen für mindestens 48 Stunden bei 4°C (REIS E SILVA et al. 2012), mögliche Ursachen für die nicht übereinstimmenden Ergebnisse dar.

Da es im Rahmen dieser Studie mit keinem der geprüften Fluoreszenzfarbstoffe möglich war, den Gesamt-Gehalt der DNA in den parentalen Pronuklei der bovinen Zygoten im Anschluss an eine Denaturierung zu ermitteln, wurden die Embryonen schließlich in zwei Gruppen aufgeteilt, von denen eine dem immunzytochemischen Protokoll inklusive einer Denaturierung der DNA und die andere einer Färbung der Gesamtheit der Nukleinsäuren mit Hoechst 33342 unterzogen wurde. Das DNA-Signal diente der Normalisierung des 5-Methylcytosin-DNA-Signals. Die Tatsache, dass trotz der in der Literatur bereits beschriebenen erfolgreichen Darstellung der Nukleinsäuren mit den getesteten Farbstoffen, diese in der vorliegenden Arbeit für die Ermittlung des Gesamt-DNA-Gehaltes im Anschluss an eine Denaturierung nicht geeignet waren, lässt die Empfindlichkeit der Methode gegenüber einer Vielzahl von Einflussfaktoren erkennen. Es kann nur vermutet werden, dass neben Unterschieden im Ablauf der Protokolle sowie in der Art und Verwendung der verschiedenen Medien auch die Durchführung der Arbeitsschritte in unterschiedlichen Laboren und die damit einhergehenden abweichenden Umgebungsbedingungen einen Einfluss auf die spezifische Anfärbung der DNA haben.

Die immunzytochemische Darstellung des 5-Methylcytosins erlaubt eine Quantifizierung der globalen DNA-Methylierung. Sie stellt ein kostengünstiges, relativ einfach durchzuführendes Verfahren zur Identifizierung der methylierten Cytosinmoleküle dar. Ein Nachteil dieser Methode ist die Möglichkeit einer unspezifischen oder ausbleibenden Bindung der Antikörper an das 5-Methylcytosin und eine dadurch bedingte Fälschung der Ergebnisse. Daher ist die Auswahl von Kontrollen zum Ausschluss unspezifischer Bindungen der Antikörper sowie einer Autofluoreszenz der Zellen von größter Bedeutung. In dieser Arbeit wurde die erste Negativkontrolle für den Ausschluss unspezifischer Bindungen des Sekundärantikörpers eingesetzt. Die zweite Negativkontrolle diente dem Ausschluss einer Autofluoreszenz der Zellen. Der Einsatz eines Isotypkontrollantikörpers stellte sicher, dass keine unspezifischen Bindungen des Primärantikörpers auftraten.