Neutralisierung

Nach Ablauf der zehnminütigen Inkubation in der Salzsäure wurden jeweils 100 µl einer 100 mM Tris-HCL-Lösung (pH 8,0; Neutralisierungslösung) den Salzsäuretropfen hinzugegeben, um eine sofortige Abschwächung der Denaturierung zu erzielen. Direkt im Anschluss erfolgte ein Überführen der Embryonen in 100 µl der Neutralisierungslösung, der je zwei Mikroliter Permeabilisierungslösung hinzugefügt

waren und in welcher die Embryonen für zehn Minuten bei Raumtemperatur verblieben. Dies sollte die denaturierende Wirkung der Salzsäure vollständig aufheben sowie wieder einen neutralen pH-Wert herstellen. Danach wurden die Zygoten dreimal für je zehn Sekunden in 100 µl PBS + zwei Mikroliter Permeabilisierungslösung gewaschen.

3.2.1.7 Zweite Fixierung

Der Neutralisierung schloss sich eine erneute Fixierung der Zellen in je 100 µl einer 3,7 %igen Paraformaldehydlösung (in Aqua bidestillata; pH 7,3) für 15 Minuten bei Raumtemperatur an. Zwei Minuten vor Beendigung der Inkubation wurden zwei Mikroliter Permeabilisierungslösung hinzugegeben, um auch hier das Pipettieren zu erleichtern.

3.2.1.8 Zweite Permeabilisierung

Die Zygoten wurden zur zweiten Permeabilisierung für zehn Minuten in je 100 µl der Permeabilisierungslösung bei Raumtemperatur inkubiert.

3.2.1.9 Blockierung

Die Inkubation der Zygoten in je 100 µl Blockierungslösung (BL), bestehend aus 1 % BSA + 0,1 % Triton® X-100 in PBS, diente der Blockierung unspezifischer Antikörper-Bindungsstellen. Dieser Schritt erfolgte über Nacht bei 4°C in einer Feuchtekammer (Abbildung 9). Diese bestand aus einer 94 x 16 mm

Kunststoffpetrischale, in welche der Deckel einer Plastikpetrischale mit den Maßen 35 x 10 mm mittig hineingelegt wurde. Der Boden des großen Gefäßes war mit vier Lagen fusselfreien Labortüchern ausgelegt, welche mit Aqua bidestillata befeuchtet wurden. Die Objektträger mit den Vertiefungen und den darin befindlichen Zygoten wurden auf dem Petrischalendeckel in der Mitte der Kammer platziert. Die Feuchtekammer wurde schließlich durch das Auflegen des großen Petrischalendeckels nach oben hin abgedeckt. Dies sollte ein Verdunsten der Blockierungslösung während der Inkubation über Nacht verhindern. Im Anschluss an die Blockierung wurden die Embryonen dreimal für je zehn Sekunden in 100 µl Blockierungslösung gewaschen.

Abbildung 9: Feuchtekammer zur Inkubation der Zygoten

3.2.2 Inkubation mit dem Anti-5-Methylcytidine-Antikörper (Primärantikörper)

Für den Nachweis des 5-Methylcytosins wurde ein in der Maus erzeugter aufgereinigter IgG1/λ-Antikörper (Monoclonal Antibody 5-Methylcytidine, BI-MECY-0100, Eurogentec) verwendet (LEPIKHOV et al. 2008). Er besteht aus zwei identischen schweren Ketten vom Typ γ1 sowie zwei identischen leichten Ketten vom Typ λ. Dieser wurde entwickelt, um zwischen der Base Cytosin in der DNA von Vertebraten und deren modifizierter Form, dem 5-Methylcytosin, zu unterscheiden.

Der Antikörper richtet sich gegen das methylierte Nukleosid Cytidin, welches aus der Base Cytosin und einem Zucker (Ribose) besteht.

Der Antikörper wurde in einer Konzentration von 1 mg/ml in PBS geliefert, direkt nach dem Erhalt in 10 µl Aliquots bei -20°C eingefroren und bis zur Verwendung so gelagert. Um ein optimales Antigen-Antikörper-Verhältnis zu erzielen und damit sowohl eine bestmögliche Darstellung des 5-Methylcytosins zu erreichen als auch unspezifische Bindungen des Primärantikörpers auf ein Minimum zu reduzieren, wurde zunächst mit einer Verdünnungsreihe die geeignete Konzentration des primären Antikörpers ermittelt. Dazu erfolgte eine Erprobung der Verdünnungen 1:200, 1:500 und 1:1000. Dreißig Minuten vor der Inkubation der Zygoten mit dem Antikörper wurde dieser bei Raumtemperatur aufgetaut, in der Blockierungslösung entsprechend verdünnt und die Embryonen über Nacht bei 4°C in einer Feuchtekammer in 50 µl des verdünnten Proteins inkubiert. Am nächsten Morgen fand ein dreimaliges Waschen der Zygoten für je 15 min in je 100 µl der Blockierungslösung bei Raumtemperatur statt, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

3.2.3 Inkubation mit dem Sekundärantikörper

Als Sekundärantikörper wurden in der Ziege produzierte aufgereinigte Antikörper eingesetzt (Alexa Fluor^® 488 goat anti-mouse IgG (H+L), A-11001, Invitrogen/Life Technologies), die mit schweren Ketten vom Typ γ (Immunglobulin G) sowie leichten Ketten vom Typ κ und λ der Maus reagieren. Diese Proteine sind mit dem grün-fluoreszierenden Farbstoff Alexa Fluor 488 konjugiert, welcher vom Licht einer Wellenlänge von 495 nm maximal angeregt wird und Licht einer Wellenlänge von 519 nm emittiert (HAUGLAND 2010a). Die Antikörper wurden in einer Konzentration von 2 mg/ml geliefert, direkt nach der Ankunft in Aliquots à 10 µl bei -20°C eingefroren und so bis zur Verwendung gelagert. Der Einsatz einer zu hohen Konzentration des Sekundärantikörpers kann zu einer hohen Anzahl an unspezifischen Bindungen desjenigen und damit auch zu einer starken Hintergrundfluoreszenz führen. Um dieses zu vermeiden, erfolgte die Überprüfung der Eignung einer 1:100-, 1:500- und einer 1:1000-fachen Verdünnung des Alexa Fluor 488-gekoppelten Antikörpers in der Blockierungslösung. Dreißig Minuten vor der Inkubation der Embryonen mit dem Sekundärantikörper wurde dieser bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss aufgetaut und entsprechend in der Blockierungslösung verdünnt. Die Zygoten wurden in 50 µl des verdünnten Immunglobulins für 60 min bei Raumtemperatur im Dunkeln in einer Feuchtekammer inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal für je 15 Minuten in 100 µl Blockierungslösung bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen und somit unspezifische Fluoreszenzsignale zu vermeiden. Der Lichtausschluss sollte ein Ausbleichen des lichtempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffes verhindern. Eine optimale Konzentration des sekundären Antikörpers zeigte sich nicht nur in einer Sichtbarmachung der Vorkerne der Zygoten und in einer möglichst geringen Fluoreszenz des Zytoplasmas der Embryonen sondern auch in einer ausbleibenden Fluoreszenz der ersten Negativkontrolle (siehe Kapitel 3.2.4).

Schließlich fand das Verbringen der Embryonen in Gruppen von zwei bis fünf auf einen sauberen, zuvor noch nicht verwendeten Objektträger statt. Danach erfolgte unter mikroskopischer Kontrolle deren Überschichtung mit ca. zwei Mikrolitern Mounting Medium (VECTASHIELD^® HardSet™ Mounting Medium). Anschließend wurde vorsichtig ein Deckglas aufgelegt und dessen Ränder nach fünf Minuten mit Nagellack versiegelt. Die Proben wurden horizontal unter Lichtausschluss bei 4°C gelagert. Die fluoreszenzmikroskopische Auswertung (Kapitel 3.6) erfolgte spätestens fünf Stunden nach Beendigung der Färbung.

3.2.4 Kontrollen

Jeder Versuchsdurchgang enthielt drei Kontrollen, zu denen die erste und zweite Negativkontrolle sowie die Isotypkontrolle gehörten. Sie dienten dem Ausschluss unspezifischer Bindungen sowohl des Primär- als auch des Sekundärantikörpers sowie der Bestimmung einer Autofluoreszenz der Zellen.

Für die erste Negativkontrolle wurden pro Versuchsdurchlauf ein bis zwei Zygoten verwendet, die dem oben beschriebenen Protokoll zur immunzytochemischen Darstellung des 5-Methylcytosins unterzogen wurden. Statt mit dem Primärantikörper wurden die Embryonen allerdings in 100 µl Blockierungslösung bei 4°C über Nacht inkubiert. Das Waschen in der Blockierungslösung und die Inkubation mit dem Sekundärantikörper erfolgten dann wieder wie oben aufgeführt. Durch das Fehlen des primären Antikörpers wurde sichergestellt, dass der sekundäre Antikörper keine unspezifischen Bindungen einging.

Die zweite Negativkontrolle diente der Ermittlung bzw. dem Ausschluss einer Autofluoreszenz der Embryonen und verhinderte somit Verfälschungen bei der Messung der Fluoreszenzintensitäten der Vorkerne. Ein bis zwei Embryonen wurden pro Versuchsdurchlauf nach obigem Protokoll bis einschließlich des Blockierungsschrittes behandelt. Anstelle der Inkubation mit dem Primärantikörper erfolgte eine Inkubation in 100 µl Blockierungslösung bei 4°C über Nacht in einer

Feuchtekammer. Dem dreimaligen Waschen für je 15 Minuten in 100 µl Blockierungslösung bei Raumtemperatur schloss sich statt der Inkubation mit dem Sekundärantikörper eine Inkubation in 100 µl Blockierungslösung für 60 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln an. Es folgte ein erneutes dreimaliges Waschen à 15 min in je 100 µl Blockierungslösung bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss.

Schließlich wurden die Embryonen mit der gleichen Lichtwellenlänge wie die gefärbten Zygoten angeregt.

Der Einsatz eines Isotypkontrollantikörpers diente der Ermittlung bzw. dem Ausschluss unspezifischer Bindungen des Primärantikörpers. Bezüglich der Spezies, in welcher diese Immunglobuline produziert werden, sowie des Isotyps stimmen sie mit dem eingesetzten Primärantikörper überein, d.h. sie weisen auch dessen unspezifische Bindungseigenschaften auf. Die Isotypkontrolle bestand pro Versuchsdurchlauf aus ein bis zwei Embryonen, welche mit Ausnahme der Inkubation mit dem Primärantikörper dem oben aufgeführten Protokoll unterzogen wurden. Anstatt in dem Primärantikörper erfolgte eine Inkubation in einem aufgereinigten in der Maus erzeugten IgG1-Antikörper (Mouse IgG1, MG100, Invitrogen/Life Technologies), welcher keine der auf den zu untersuchenden Zellen vorhandenen Antigene band. Da die eingesetzte Konzentration des Isotypkontrollantikörpers mit der des primären Antikörpers übereinstimmen muss, um die Bindungscharakteristika gleichsetzen zu können, wurde das Protein vor der Anwendung auf 5 µg/ml in der Blockierungslösung verdünnt. Die Inkubation erfolgte ebenfalls über Nacht bei 4°C in einer Feuchtekammer.

3.3 Etablierung eines Färbeprotokolls zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes in vitro produzierter

präimplantatorischer Embryonen des Rindes

Im Anschluss an die Etablierung der immunzytochemischen Färbung erfolgte die Etablierung eines Protokolls, mit welchem der Gesamt-DNA-Gehalt der zuvor

immunzytochemisch gefärbten Zygoten mittels eines Fluoreszenzfarbstoffes dargestellt werden konnte. Das Ziel bestand in der Entwicklung einer Methode, die eine gleichzeitige Darstellung des 5-Methylcytosins sowie des Gesamt-DNA-Gehaltes in den Vorkernen einer Zygote ermöglichte. Das durch den Farbstoff hervorgerufene DNA-Signal diente später der Normalisierung des 5-Methylcytosin-Signals (Kapitel 3.6).

3.3.1 Prüfung verschiedener Farbstoffe auf ihre Eignung zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes in vitro produzierter Zygoten des Rindes

Um einen geeigneten Farbstoff zu finden, der auch nach einer für die Darstellung des 5-Methylcytosins essentiellen Denaturierung die Nukleinsäuren der Zygoten in ihrer Gesamtheit darzustellen vermochte, wurden insgesamt sechs Fluoreszenzfarbstoffe getestet. Die verschiedenen Farbstoffe wurden in Zygoten getestet, welche bereits das etablierte immunzytochemische Protokoll durchlaufen hatten, jedoch noch nicht mit Mounting Medium überschichtet waren. Es erfolgte sowohl die Erprobung unterschiedlicher Farbstoffkonzentrationen als auch unterschiedlicher Inkubationszeiten- und temperaturen sowie verschiedener Waschschritte. Um eine optimale Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes zu gewährleisten, wurden im Rahmen der Etablierung des DNA-Färbeprotokolls weitere Modifikationen des immunzytochemischen Protokolls vorgenommen, welche vorwiegend die Denaturierung der DNA betrafen. Somit erfolgte die Erprobung der Farbstoffe sowohl ohne eine vorherige Denaturierung der DNA als auch nach einer Denaturierung der Nukleinsäuren. Desweiteren wurden unterschiedliche Salzsäurekonzentrationen bei unterschiedlichen Inkubationszeiten- und temperaturen getestet. Einzelne Farbstoffe wurden zudem in Embryonen getestet, welche zuvor lediglich fixiert wurden. Nach Abschluss der einzelnen Färbungen wurden die Embryonen auf saubere, zuvor noch nicht verwendete Objektträger verbracht und mit ca. zwei Mikrolitern Mounting

Medium überschichtet. Anschließend wurde vorsichtig ein Deckglas aufgelegt und dessen Ränder nach fünf Minuten mit Nagellack versiegelt. Die Lagerung der Proben erfolgte horizontal bei 4°C unter Lichtausschluss. Die Proben wurden bis maximal fünf Stunden nach Beendigung der Färbungen fluoreszenzmikroskopisch untersucht (Kapitel 3.5). Eine Übersicht über die getesteten Farbstoffe ist in Abbildung 10 dargestellt.

Abbildung 10: Schematische Darstellung der Etablierung eines Färbeprotokolls zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes

boviner in vitro produzierter Embryonen

In-vitro-Produktion boviner Embryonen •Fixierung •1. Permeabilisierung Denaturierung der DNA •Neutralisierung •2. Fixierung •2. Permeabilisierung •Blockierung DAPI PIHoechst 33258Hoechst 33342Ethidium Homodimer-1Ethidium Homodimer-2

Verdau der Zona pellucida Fixierung Ethidium Homodimer-2 Hoechst 33342

3.3.1.1 Versuche zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole

Um seine Eignung zur Darstellung des Gesamtgehaltes der DNA zu ermitteln, wurde der blau fluoreszierende Farbstoff 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) geprüft.

Dabei handelt es sich um eine semi-membranpermeable Substanz (HAUGLAND 2010b), welche sich vorzugsweise an Adenin-Thymin-reiche Regionen in der kleinen Furche der DNA anlagert (KUBISTA et al. 1987). Mit RNA geht DAPI eine Adenin-Uracil-selektive interkalierende Bindung ein (DIELEMAN et al. 2002). Der Farbstoff weist jedoch eine größere Bindungsselektivität zu doppelsträngiger im Vergleich zu einzelsträngiger DNA auf (KAPUSCINSKI u. YANAGI 1979). Das Exzitationsmaximum liegt bei 358 nm, das Emissionsmaximum bei 461 nm (HAUGLAND 2010b). Die Zygoten wurden zunächst dem bereits etablierten Protokoll zur Darstellung des 5-Methylcytosins (siehe Kapitel 3.2; LEPIKHOV et al. 2008) unterzogen und anschließend mit DAPI (MINHAS et al. 1984; LEPIKHOV et al. 2008) in unterschiedlichen Ausführungen gefärbt, um den Gesamt-DNA-Gehalt zu ermitteln. Die getesteten Konzentrationen von DAPI, die Inkubationszeiten- und temperaturen, die Waschschritte, sowie die vorherige, im Rahmen des immunzytochemischen Protokolls (LEPIKHOV et al. 2008) durchgeführte, Denaturierung der DNA sind in Tabelle 11 genannt.

Tabelle 11: Übersicht über die verwendeten Protokolle zur Darstellung des 5-Methylcytosins in bovinen Zygoten und die dafür essentielle Denaturierung

der DNA sowie zur Färbung ihrer Nukleinsäuren mit DAPI, die eingesetzten Konzentrationen von DAPI, die Inkubationszeiten- und temperaturen sowie

Waschschritte

RT: Raumtemperatur; BL: Blockierungslösung

Protokoll 5mC-Färbung Denaturierung Protokoll Darstellung der Gesamt-DNA mit DAPI Eingesetzte Konzentration von DAPI Inkubationszeit Inkubations- temperatur Waschen

LEPIKHOV

3.3.1.2 Versuche zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit Propidiumiodid

Propidiumiodid ist ein in die DNA interkalierender Farbstoff, der intakte Zellmembranen nicht durchdringen kann und daher nur tote Zellen anfärbt (HAUGLAND 2010b). Er weist keine oder nur eine sehr geringe Sequenzspezifität auf und bindet sowohl an DNA (WARING 1965) als auch an RNA. Der rot fluoreszierende Farbstoff hat ein Exzitationsmaximum von 530 nm und ein Emissionsmaximum von 625 nm (HAUGLAND 2010b). Die Färbung der DNA mit PI (PETERS et al. 2009) in unterschiedlichen Konzentrationen, die Inkubationszeiten- und temperaturen, die Waschschritte, sowie die vorangegangene Anfärbung des 5-Methylcytosins (LEPIKHOV et al. 2008), auch mit einer Modifikation, sind in Tabelle 12 dargestellt.

Tabelle 12: Übersicht über die verwendeten Protokolle zur Darstellung des 5-Methylcytosins in bovinen Zygoten und die dafür essentielle Denaturierung

der DNA sowie zur Färbung ihrer Nukleinsäuren mit PI, die eingesetzten Konzentrationen von PI, die Inkubationszeiten- und temperaturen sowie

Waschschritte

RT: Raumtemperatur; BL: Blockierungslösung

Protokoll 5mC-Färbung Denaturierung Protokoll Darstellung der Gesamt-DNA mit PI Eingesetzte Konzentration von PI Inkubationszeit Inkubations- temperatur Waschen

LEPIKHOV

3.3.1.3 Versuche zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit Hoechst 33258

Das an die kleine Furche der DNA bindende Bisbenzimid Hoechst 33258 ist ein blau fluoreszierender membranpermeabler Farbstoff, der selektiv an doppelsträngige DNA bindet (HAUGLAND 2010b). Zudem weist dieser eine sequenzspezifische DNA-Affinität auf, die in einer vermehrten Anlagerung an Adenin-Thymin-Sequenzen deutlich wird (LOONTIENS et al. 1990). Hoechst 33258 weist unterschiedliche Bindungsmodi und Emissionsspektra auf, welche von dem Farbstoff-Basenpaar-Verhältnis abhängig sind (STOKKE u. STEEN 1985). Das Anregungsmaximum liegt bei 352 nm, das Emissionsmaximum bei 461 nm (HAUGLAND 2010b). Der immunzytochemischen Darstellung des 5-Methylcytosins (LEPIKHOV et al. 2008) mit verschiedenen Modifikationen schloss sich eine Färbung der DNA mit Hoechst 33258 an (Tabelle 5; DESHMUKH et al. 2011). Einzelheiten zu den durchgeführten Protokollen zur Färbung der Nukleinsäuren mit Hoechst 33258 sind Tabelle 13 zu entnehmen. Aufgrund einer fehlenden Konzentrationsangabe des Farbstoffes in der Beschreibung des Protokolls (DESHMUKH et al. 2011) wurde eine Konzentration von 1 μg/ml gewählt, welche bereits für das Bisbenzimid Hoechst 33342 zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes boviner Oozyten beschrieben wurde (RACEDO et al. 2009).

Tabelle 13: Übersicht über die verwendeten Protokolle zur Darstellung des 5-Methylcytosins in bovinen Zygoten und die dafür essentielle Denaturierung

der DNA sowie zur Färbung ihrer Nukleinsäuren mit Hoechst 33258, die eingesetzten Konzentrationen von Hoechst 33258, die Inkubationszeiten- und

temperaturen sowie Waschschritte

RT: Raumtemperatur; BL: Blockierungslösung

Protokoll 5mC-Färbung Denaturierung Protokoll Darstellung der Gesamt-DNA mit Hoechst 33258 Eingesetzte Konzentration von Hoechst 33258 Inkubationszeit Inkubations- temperatur Waschen

LEPIKHOV

3.3.1.4 Versuche zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit Hoechst 33342

Die Eigenschaften der Bisbenzimide Hoechst 33258 und Hoechst 33342 sind weitestgehend identisch (HAUGLAND 2010b) und unter Kapitel 3.3.1.3 zu finden.

Hoechst 33342 weist jedoch eine geringfügig höhere Membranpermeabilität (ARNDT-JOVIN u. JOVIN 1989) sowie ein Exzitationsmaximum von 350 nm und ein Emissionsmaximum von 461 nm auf (HAUGLAND 2010b). Die Zygoten wurden zunächst dem Protokoll zur Darstellung des 5-Methylcytosins (LEPIKHOV et al.

2008) mit verschiedenen Modifikationen unterzogen. Anschließend erfolgte zur Ermittlung des Gesamt-DNA-Gehaltes der Zygoten eine Färbung mit Hoechst 33342 (STINSHOFF et al. 2011) in unterschiedlichen Ausführungen (Tabelle 14).

Tabelle 14: Übersicht über die verwendeten Protokolle zur Darstellung des 5-Methylcytosins in bovinen Zygoten und die dafür essentielle Denaturierung

der DNA sowie zur Färbung ihrer Nukleinsäuren mit Hoechst 33342, die eingesetzten Konzentrationen von Hoechst 33342, die Inkubationszeiten- und

temperaturen sowie Waschschritte

RT: Raumtemperatur

Protokoll 5mC-Färbung Denaturierung Protokoll Darstellung der Gesamt-DNA mit Hoechst 33342 Eingesetzte Konzentration von Hoechst 33342 Inkubationszeit Inkubations- temperatur Waschen in Polyvinylalkohol (PVA)

LEPIKHOV

Fortsetzung Tabelle 14: Übersicht über die verwendeten Protokolle zur Darstellung des 5-Methylcytosins in bovinen Zygoten und die dafür essentielle

Denaturierung der DNA sowie zur Färbung ihrer Nukleinsäuren mit Hoechst 33342, die eingesetzten Konzentrationen von Hoechst 33342, die

Inkubationszeiten- und temperaturen sowie Waschschritte

RT: Raumtemperatur; PFA: Paraformaldehyd

Protokoll 5mC-Färbung Denaturierung Protokoll Darstellung der Gesamt-DNA mit Hoechst 33342 Eingesetzte Konzentration von Hoechst 33342 Inkubationszeit Inkubations- temperatur Waschen in Polyvinylalkohol (PVA)

LEPIKHOV

3.3.1.5 Versuche zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit Ethidium Homodimer-1

Ethidium Homodimer-1 (EthD-1) ist ein in die DNA interkalierender Farbstoff, der mit hoher Affinität an einzelsträngige und doppelsträngige DNA, RNA und Oligonukleotide bindet (HAUGLAND 2010b). Ein Molekül EthD-1 bindet an 4 Basenpaare einer doppelsträngigen DNA (GAUGAIN et al. 1978). Der rot fluoreszierende Farbstoff weist keine sequenzspezifische Bindung auf (MARKOVITS et al. 1979) und ist membranimpermeabel. Das Exzitationsmaximum liegt bei 528 nm, das Emissionsmaximum bei 617 nm (HAUGLAND 2010b). Der Färbung des 5-Methylcytosins (LEPIKHOV et al. 2008) in unterschiedlichen Ausführungen und der damit einhergehenden Denaturierung der DNA folgte eine Färbung der DNA der bovinen Zygoten mit Ethidium Homodimer-1 (STINSHOFF et al. 2011). Es erfolgte ebenfalls die Erprobung einer Farbstoffkonzentration, welche für die Anfärbung der DNA präimplantatorischer Embryonen des Kaninchens mit Ethidium Homodimer-2 beschrieben ist (REIS E SILVA et al. 2012). Die eingesetzten Konzentrationen, die verschiedenen Inkubationszeiten- und temperaturen sowie die Waschschritte sind in Tabelle 15 dargestellt.

Tabelle 15: Übersicht über die verwendeten Protokolle zur Darstellung des 5-Methylcytosins in bovinen Zygoten und die dafür essentielle Denaturierung

der DNA sowie zur Färbung ihrer Nukleinsäuren mit Ethidium Homodimer-1, die eingesetzten Konzentrationen von Ethidium Homodimer-1, die

Inkubationszeiten- und temperaturen sowie Waschschritte

RT: Raumtemperatur; BL: Blockierungslösung; PVA: Polyvinylalkohol

Protokoll 5mC-Färbung Denaturierung Protokoll Darstellung der Gesamt-DNA mit EthD-1 Eingesetzte Konzentration von EthD-1 Inkubationszeit Inkubations- temperatur Waschen

LEPIKHOV

3.3.1.6 Versuche zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit Ethidium Homodimer-2

Der rote membranimpermeable Fluoreszenzfarbstoff Ethidium Homodimer-2 interkaliert in die DNA und weist ein Exzitationsmaximum von 535 nm auf. Das Emissionsmaximum liegt bei 624 nm. EthD-2 bindet mit hoher Affinität an doppelsträngige und einzelsträngige DNA sowie an RNA und Oligonukleotide. Die Bindungsaffinität von EthD-2 zur DNA ist doppelt so hoch wie die von EthD-1. Die Bindung von Ethidium Homodimer-2 an doppelsträngige DNA verursacht eine doppelt so starke Fluoreszenz wie die Bindung an RNA (HAUGLAND 2010b). Im Anschluss an eine Denaturierung der DNA im Rahmen des Protokolls zur immunzytochemischen Darstellung des 5-Methylcytosins (LEPIKHOV et al. 2008) wurde eine Färbung der Embryonen mit Ethidium Homodimer-2 (REIS E SILVA et al.

2012) durchgeführt. Es folgten verschiedene Modifikationen des immunzytochemischen Protokolls, so dass die Färbung der Embryonen mit EthD-2 (REIS E SILVA et al. 2012) auch ohne eine vorherige Denaturierung der DNA erfolgte. Da ein Teil der Zygoten zuvor nicht dem Protokoll zur Darstellung des 5-Methylcytosins unterzogen wurden, erfolgte ihre Fixierung auf mit je zwei Vertiefungen versehenen Objektträgern, welche zuvor mit dem Repel-Silan Sylon CT^® beschichtet wurden. Es schloss sich eine Färbung mit EthD-2 (REIS E SILVA et al. 2012) an. Einige Zellen wurden vor der Färbung mit Ethidium Homodimer-2 (REIS E SILVA et al. 2012) in einem 4-Well-Dish fixiert, um Wechselwirkungen von EthD-2 mit dem Repel-Silan Sylon CT® auszuschließen. Weiterhin wurden einige Zygoten nach Abschluss der Denudierung in 4-Well-Dishes überführt und in diesen ohne eine vorherige Fixierung einer Färbung mit EthD-2 (REIS E SILVA et al. 2012) unterzogen. Dies sollte ermitteln, ob eine Wechselwirkung zwischen der Fixierung in vierprozentigem Paraformaldehyd und der Färbung der DNA mit EthD-2 (REIS E SILVA et al. 2012) vorliegt. Eine detaillierte Beschreibung der Versuchsdurchführung ist in Tabelle 16 aufgeführt.

Tabelle 16: Übersicht über die verwendeten Protokolle zur Darstellung des 5-Methylcytosins in bovinen Zygoten und die dafür essentielle Denaturierung

der DNA sowie zur Färbung ihrer Nukleinsäuren mit Ethidium Homodimer-2, die eingesetzten Konzentrationen von Ethidium Homodimer-2, die

Inkubationszeiten- und temperaturen sowie Waschschritte

RT: Raumtemperatur; BL: Blockierungslösung; PFA: Paraformaldehyd

Protokoll 5mC- Färbung Denatu- rierung Protokoll Darstellung der Gesamt- DNA mit EthD-2 Eingesetzte Konzentra- tion von EthD-2 Inkubations- zeit Inkubations- temperatur Waschen

LEPIKHOV

3.4 Einfluss der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Reifung boviner Oozyten auf die globale DNA-Methylierung in vitro produzierter Zygoten

3.4.1 In-vitro-Maturation boviner Oozyten bei unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen

Die Gewinnung und Verarbeitung der Kumulus-Oozyten-Komplexe erfolgte wie in

Die Gewinnung und Verarbeitung der Kumulus-Oozyten-Komplexe erfolgte wie in

Im Dokument Experimentelle Untersuchungen zur Ermittlung des Einflusses der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Maturation boviner Oozyten auf die globale DNA-Methylierung in Zygoten nach In-vitro-Fertilisation (IVF) (Seite 89-115)