Einfluss der In-vitro-Maturation auf die Methylierung der DNA

Das Ziel der In-vitro-Maturation ist es, der unreifen Oozyte Umgebungsbedingungen zu schaffen, die es ihr ermöglichen die Meiose fortzusetzen und schließlich das Stadium der Metaphase II zu erreichen (ABELE et al. 2012). Nach einer Eizellreifung in vitro werden durchschnittlich Blastozystenraten von 30-40 % erreicht. Eine Maturation in vivo hingegen, gefolgt von einer Fertilisation in vitro, erhöht den Prozentsatz der Oozyten, welche das Stadium der Blastozyste erreichen, auf 60%.

Dies macht den großen Einfluss der Eizellreifung auf die Blastozystenentwicklung deutlich (RIZOS et al. 2002).

Es existieren zahlreiche unterschiedliche Protokolle für die In-vitro-Maturation, -Fertilisation und -Kultur. Die In-vitro-Reifung wird größtenteils unter atmosphärischen Bedingungen (ca. 20 % O2) durchgeführt. Zellen im Säugetierorganismus sind allerdings zu keinem Zeitpunkt atmosphärischen Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt (BAVISTER 1995). Die in einer Studie ermittelte präovulatorische intrafollikuläre O2-Konzentration des Rindes lag bei ca.

7 % (DE CASTRO et al. 2008) und daher sollte diese auch für die In-vitro-Reifung eingesetzt werden. In der In-vitro-Kultur hat sich hingegen eine Sauerstoffkonzentration von 5-10 % als vorteilhaft erwiesen (TERVIT et al. 1972;

THOMPSON et al. 1990; YUAN et al. 2003).

In der vorliegenden Studie konnten morphologische Unterschiede zwischen den bei 5 % Sauerstoff und den bei 20 % Sauerstoff in vitro gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexen erkannt werden. So wiesen die KOK der 5 % O2-Reifungsgruppe im Vergleich zu den bei 20 % O2 maturierten KOK nach der 24-stündigen In-vitro-Reifung einen kompakteren, weniger expandierten Kumulus auf. Eine optimale Expansion der die Oozyte umgebenen Kumuluszellen ist für die Fertilisation essentiell (BALL et al. 1983; SIRARD u. LAMBERT 1985; VANDERHYDEN u.

ARMSTRONG 1989). Es konnte bereits eine Korrelation zwischen dem Ausmaß der Kumulusexpansion und der Befruchtungsrate sowie der Entwicklungsrate zum Zweizellstadium bei der Maus nachgewiesen werden (CHEN et al. 1993). Weiterhin stellt der Grad der Kumulusexpansion einen Indikator für die Entwicklungskompetenz

boviner Oozyten dar (FURNUS et al. 1998). Ergebnisse einer weiteren Studie zeigen, dass die Anzahl an Oozyten, die das Stadium der meiotischen Metaphase II erreichten, nach einer In-vitro-Reifung boviner Oozyten bei 20 % O2 größer war als nach einer Reifung in vitro bei 5 % O2 (MINGOTI et al. 2011). Andere Autoren konnten wiederum keine Unterschiede in der Anzahl der Oozyten, welche die meiotische Metaphase II erreichten, nach einer In-vitro-Reifung boviner Oozyten bei 5 % O2 bzw. bei 20 % O2 feststellen (PEREIRA et al. 2010).

Der Anteil nicht ausgewerteter Oozyten an der Gesamtanzahl immunzytochemisch analysierter Zygoten war in dieser Studie in der 5 % O2-Reifungsgruppe mit ca. 77 % (5mC-Färbung + DNA-Färbung) höher als in der 20 % O2-Reifungsgruppe, in welcher ca. 59 % der insgesamt gefärbten Zygoten nicht ausgewertet werden konnten.

Besonders der Prozentsatz an Embryonen, in denen mittels Fluoreszenzmikroskopie (5mC-Färbung und DNA-Färbung) keine Vorkerne sichtbar waren, war in der Gruppe der bei 5 % Sauerstoff gereiften Embryonen mit ca. 12 % in der DNA-Färbung und ca. 18 % in der 5mC-Färbung im Vergleich zu den bei 20 % O2 maturierten Zygoten (ca. 6 % DNA-Färbung; ca. 6% 5mC-Färbung) größer. Ebenso war mit ca. 48 % (DNA-Färbung) sowie ca. 32 % (5mC-Färbung) ein größerer Anteil der Oozyten nach einer In-vitro-Reifung bei 5 % O2 im Vergleich zu den bei 20 % O2 maturierten Eizellen (ca. 18 % DNA-Färbung; ca. 12 % 5mC-Färbung) nicht befruchtet.

Das geringere Ausmaß der Kumulusexpansion sowie der höhere Anteil nicht befruchteter Oozyten nach einer In-vitro-Reifung bei 5 % O2 verglichen mit einer Reifung bei 20 % O2 lassen eine Beeinträchtigung des Befruchtungsvorgangs in vitro im Anschluss an eine Maturation in vitro bei reduzierten Sauerstoffkonzentrationen (5%) vermuten.

Der Einfluss einer reduzierten O2-Konzentration während der In-vitro-Maturation boviner Oozyten wurde bereits mehrfach vergleichend mit einer Reifung unter atmosphärischen Bedingungen hinsichtlich diverser Qualitätsparameter der Eizellen bzw. Embryonen untersucht, jedoch mit unterschiedlichen Ergebnissen: So erwies sich eine O2-Konzentration von 5 % während der In-vitro-Maturation boviner Oozyten im Vergleich zu atmosphärischen Bedingungen im Hinblick auf den Anteil an Eizellen, der die meiotische Metaphase II erreichte, sowie die Befruchtungsraten als

nachteilig (PINYOPUMMINTR u. BAVISTER 1995). Die Teilungsraten und die Entwicklungsraten zum Blastozystenstadium waren nach einer In-vitro-Maturation boviner Oozyten bei 5 % O2 niedriger als nach einer Reifung bei 20 % O2

(OYAMADA u. FUKUI 2004). Eine andere Studie konnte hingegen einen Einfluss der Sauerstoffkonzentration (2, 5, 10 oder 20 %) während der In-vitro-Reifung muriner Oozyten weder auf die Maturation noch auf die Fertilisation sowie die Teilungsraten und die Entwicklung zum Blastozystenstadium nachweisen. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass eine steigende O2-Konzentration während der In-vitro-Maturation mit einer Verringerung der Zellzahl der Blastozysten, bedingt durch eine Reduktion der Anzahl an Zellen des Trophektodems, assoziiert war (BANWELL et al.

2007). In einer weiteren Studie hingegen war die Entwicklungsrate zum Stadium der Blastozyste nach einer In-vitro-Reifung boviner Oozyten bei 5 % O2 höher als nach einer Reifung bei 20 % O2 (HASHIMOTO et al. 2000). Weiterhin hatte eine reduzierte Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Maturation porciner Oozyten einen positiven Einfluss auf die Vorkernformation, die Ausschleusung des zweiten Polarkörpers sowie die totale Zellzahl der Blastozysten (IWAMOTO et al. 2005).

Unterschiede in der Qualität der eingesetzten Oozyten, der Herkunft, Konservierung, Aufbereitung und dadurch bedingten Qualität der verwendeten Spermien sowie der Zusammensetzung der Reifungs- und Fertilisationsmedien können mögliche Ursachen für die divergierenden Ergebnisse dieser Studien darstellen.

Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Studie ist zu erkennen, dass die In-vitro-Reifung boviner Oozyten bei 5 % O2 einen Einfluss auf die Methylierung des maternalen Pronukleus in den aus der In-vitro-Reifung und -Fertilisation resultierenden Zygoten hat. Eine In-vitro-Reifung bei 20 % O2 hingegen hatte vergleichsweise keine statistisch signifikanten Auswirkungen auf die Methylierung der parentalen Genome. Beim Vergleich der normalisierten Methylierung der parentalen Pronuklei der Zygoten innerhalb einer Reifungsgruppe (5 % O2 oder 20 % O2) konnte ein statistisch signifikanter Unterschied in der 5 % O2-Gruppe festgestellt werden. Die väterlichen Vorkerne wiesen einen statistisch signifikant höheren normalisierten Methylierungsgrad als die mütterlichen Vorkerne auf.

Zwischen den normalisierten Methylierungen der elterlichen Vorkerne der 20 % O2

-Gruppe war hingegen kein signifikanter Unterschied vorhanden. Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den normalisierten Methylierungsgraden der maternalen Vorkerne der 5 % O2- und der 20 % O2-Gruppe war existent. Die maternalen Pronuklei der 20 % O2-Gruppe wiesen einen signifikant höheren normalisierten Methylierungsgrad als die mütterlichen Vorkerne der 5 % O2-Gruppe auf. Zwischen den väterlichen Vorkernen beider Reifungsgruppen konnte ein solcher Unterschied nicht festgestellt werden. Die normalisierte relative Methylierung der paternalen Pronuklei beider Reifungsgruppen unterschied sich statistisch signifikant voneinander. Die normalisierte relative Methylierung der paternalen Pronuklei der 5 % O2-Gruppe war signifikant höher als die der väterlichen Vorkerne der 20 % O2 -Gruppe.

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass eine reduzierte O2-Konzentration während der In-vitro-Maturation boviner Oozyten eine Reduktion der globalen Methylierung des maternalen Vorkerns in den 20-21 Stunden nach der In-vitro-Fertilisation immunzytochemisch untersuchten Zygoten bewirkte.

Die Ergebnisse verschiedener immunzytochemischer Untersuchungen weisen nach, dass es kurz nach der Fertilisation boviner Oozyten im Rahmen einer Reprogrammierung des Genoms zu einer Demethylierung des paternalen Genoms kommt, welche an einem im Vergleich zum maternalen Genom schwächeren Fluoreszenzsignal im väterlichen Vorkern erkennbar ist (BOURC'HIS et al. 2001;

DEAN et al. 2001; BEAUJEAN et al. 2004a; PARK et al. 2007; LEPIKHOV et al.

2008). So wiesen bovine in vitro produzierte Zygoten (Interphase-Nuklei) nach der Befruchtung einen demethylierten paternalen Pronukleus auf, wohingegen der maternale Vorkern seinen Methylierungsgrad aufrechterhielt (DEAN et al. 2001).

Zudem konnte eine immunzytochemische Analyse der DNA-Methylierung boviner Zygoten 14 Stunden nach der In-vitro-Befruchtung im Vergleich zur Untersuchung acht Stunden nach der Fertilisation eine Abschwächung des Fluoreszenzsignals des dekondensierten paternalen Pronukleus nachweisen (BOURC'HIS et al. 2001). Eine partielle asymmetrische Demethylierung des paternalen Pronukleus konnte von anderen Autoren ebenfalls in bovinen Zygoten festgestellt werden (BEAUJEAN et al.

2004a). Der durchschnittliche Methylierungsgrad der paternalen Pronuklei in vitro

produzierter boviner Zygoten zehn Stunden nach der In-vitro-Befruchtung lag relativ zu den mütterlichen Vorkernen bei ungefähr 84 %, zwanzig Stunden post fertilisationem war dieser Wert signifikant auf ca. 50 % reduziert. Der durchschnittliche Methylierungsgrad des paternalen Vorkerns 25 Stunden post fertilisationem lag bei 75,0 %, was einen signifikanten Anstieg im Vergleich zu den gemessenen Werten 20 Stunden nach der Befruchtung darstellte (PARK et al. 2007).

Eine weitere Studie berichtet von einer deutlichen Asymmetrie des immunzytochemischen 5mC-Signals zwischen den parentalen Pronuklei boviner in vitro produzierter Zygoten mehr als sechs Stunden nach der Befruchtung. Die väterlichen Vorkerne wiesen im Vergleich zu den maternalen Pronuklei eine deutliche Reduktion ihres Fluoreszenzsignals auf (LEPIKHOV et al. 2008).

Sofern angegeben, fand die In-vitro-Maturation der bovinen Oozyten in den genannten Studien bei 5 % CO2 unter atmosphärischen Bedingungen (≙ ca. 20 % O2) statt (BEAUJEAN et al. 2004a; PARK et al. 2007; LEPIKHOV et al.

2008). Im Gegensatz zu den übereinstimmenden Ergebnissen der oben genannten Studien, welche von einer durch eine Demethylierung des paternalen Genoms bedingten Asymmetrie der 5mC-Fluoreszenzsignale in den Zygoten berichten, ist in der vorliegenden Studie zwar auch eine Asymmetrie der Methylierungen zwischen den parentalen Vorkernen nach einer In-vitro-Maturation bei 5 % O2 zu erkennen, jedoch in umgekehrtem Verhältnis: Die maternalen Vorkerne weisen einen niedrigeren Methylierungsgrad als die paternalen auf. Da dieser statistisch signifikante Unterschied des normalisierten Methylierungsgrades zwischen den elterlichen Vorkernen jedoch ausschließlich bei der 5 % O2-Maturationsgruppe vorhanden ist und die Oozyten bzw. Embryonen beider Gruppen ansonsten gleichartig behandelt wurden, ist der Verlust an Methylierungen im maternalen Genom der Zygoten der 5 % O2-Gruppe wahrscheinlich durch die reduzierte Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Reifung bedingt. Die fehlende statistische Signifikanz der Unterschiede der Methylierungsgrade der elterlichen Vorkerne der 20 % O2-Reifungsgruppe kann durch eine wie bei PARK et al. (2007) beschriebene 25 Stunden post fertilisationem ermittelte Zunahme an Methylierungen im paternalen Genom bedingt sein. Eine weitere mögliche Erklärung ist ein ebenso

wie bei der 5 % O2-Gruppe beobachteter, wenn auch in deutlich geringerem Umfang stattgefundener, Verlust an Methylierungen im maternalen Genom. Dies würde auf eine Beeinflussung der DNA-Methylierung durch die Methodik der In-vitro-Produktion an sich hindeuten, die durch eine reduzierte Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Maturation noch verstärkt wird. Unterschiede in der Dynamik (REIS E SILVA et al. 2012) sowie im Ausmaß der Demethylierung der DNA (YOSHIZAWA et al. 2010) zwischen in vitro produzierten sowie in vivo entwickelten Embryonen konnten bereits genomweit mittels Immunzytochemie nachgewiesen werden.

Die DNA-Methylierung hat einen Einfluss auf die Genexpression (BIRD 2002; LI 2002). Veränderungen im DNA-Methylierungsmuster können also auch zu einer veränderten Genexpression führen und sind mit bestimmten Erkrankungen, wie z.B.

dem Beckwith-Wiedemann-Syndrom (WEKSBERG et al. 2003) sowie dem Prader-Willi- und dem Angelman-Syndrom (HORSTHEMKE u. WAGSTAFF 2008) assoziiert.

Weiterhin werden Dysregulationen der DNA-Methylierung sowie Modifikationen des Chromatins mit der Entstehung von Tumoren in Verbindung gebracht (CAIRNS 2001;

ROBERTSON 2001; WOLFFE 2001; LUND u. VAN LOHUIZEN 2004; YANG 2004;

ROBERTSON 2005).

Der Einfluss unterschiedlicher Sauerstoffkonzentrationen (5 % und 20 %) während der In-vitro-Kultur auf die Genexpression wurde bereits in murinen Embryonen untersucht. So wiesen die Embryonen nach einer In-vitro-Kultur bei 5 % O2 im Vergleich zu einer Kultur in vitro bei 20 % O2 größere Übereinstimmungen im Genexpressionsmuster mit in vivo erzeugten Embryonen auf (RINAUDO et al. 2006).

Eine aktuelle Studie konnte eine verstärkte Expression Oozytenmetabolismus-assoziierter sowie Oozytenkompetenz-bezogener Gene nach einer In-vitro-Maturation boviner Oozyten unter reduzierten Sauerstoffkonzentrationen feststellen.

Ein Einfluss auf die Teilungsraten, die Entwicklung zum Blastozystenstadium sowie die Transkriptmengen einiger mit der Qualität der Embryonen assoziierter Gene konnte hingegen nicht registriert werden (BERMEJO-ALVAREZ et al. 2010). Eine weitere Studie konnte ebenfalls eine erhöhte Expression Oozytenmetabolismus-assoziierter Gene in porcinen Kumuluszellen nach einer Reifung in vitro bei 5 % O2

beobachten. Die Transkriptmengen eines in den Metabolismus Reaktiver

Sauerstoffspezies involvierten Gens sowie eines Oozytenkompetenz-assoziierten Gens waren jedoch nach einer Reifung in vitro bei 20 % O2 in porcinen Kumuluszellen erhöht (KANG et al. 2011).

Anhand der Ergebnisse dieser Studien ist zu erkennen, dass die Sauerstoffkonzentration in der In-vitro-Maturation von Oozyten einen Einfluss auf die Expression spezifischer Gene hat. Der Mechanismus der veränderten Genexpression ist allerdings nicht untersucht worden. Ebenso fand in den erwähnten Studien ausschließlich die Untersuchung bestimmter Genloci statt, in der vorliegenden Arbeit ist hingegen die globale Methylierung ermittelt worden. Dennoch deutet sich die im Rahmen dieser Studien ermittelte Veränderung der Expression bestimmter Gene durch unterschiedliche O2-Konzentrationen während der In-vitro-Reifung anhand der Ergebnisse der vorliegenden Studie auch auf globaler Ebene an.

Um zu belegen, dass die globale Verminderung des Methylierungsgrades des maternalen Genoms nach einer In-vitro-Reifung bei reduzierten Sauerstoffkonzentrationen auch tatsächlich mit veränderten Genexpressionsmustern vergesellschaftet ist, könnte eine vergleichende Analyse der globalen DNA-Methylierung der bei 5 % O2 und 20 % O2 in vitro gereiften Oozyten mithilfe von Mikroarrays oder Sequenzierungsverfahren vorgenommen werden. Gleichzeitig kann dadurch auch ermittelt werden, ob und in welchem Ausmaß das maternale Genom nach einer Reifung in vitro unter atmosphärischen Bedingungen von Methylierungsverlusten sowie Veränderungen der Genexpression betroffen ist. Diese Verfahren ermöglichen die Identifikation der von den Methylierungsverlusten betroffenen Sequenzen der DNA. Somit kann festgestellt werden, ob es sich dabei um kodierende Gene oder um nicht kodierende Abschnitte, wie z.B. Introns oder repetitive Sequenzen, handelt. Anschließend kann eine Genexpressionsanalyse der von Methylierungsveränderungen betroffenen Regionen, z.B. durch eine Messung der Transkiptmengen der betroffenen Gene, durchgeführt werden. So lässt sich erkennen, ob eine Veränderung des Methylierungsstatus der Gene auch mit Variationen in der Genexpression assoziiert ist.