Somatischer Zellkerntransfer („Klonen“)

Um die für eine Entwicklung notwendige Totipotenz wiederzuerlangen, muss eine differenzierte Zelle im Rahmen des Somatischen Kerntransfers „reprogrammiert“

werden. Die Reprogrammierung des somatischen Zellkerns beinhaltet die transkriptionelle Stilllegung desselben, das Auslöschen des differenzierten zellulären Gedächtnisses, eine angemessene Aktivierung des in die Oozyte transferierten Genoms sowie eine geeignete embryonale Genexpression in späteren Entwicklungsstadien. Jeder dieser Schritte beinhaltet epigenetische Modifikationen des transferierten Erbgutes (DEAN et al. 2003). Es wird angenommen, dass die Entwicklungsprobleme geklonter Embryonen durch epigenetische Defekte verursacht werden, da die Nachkommen der Klone normal erscheinen (ZHANG et al. 2004). Alle in geklonten Embryonen und adulten Individuen untersuchten epigenetischen Modifikationen wiesen Abnormalitäten auf. Außerdem unterschieden sich die geklonten Embryonen hinsichtlich ihres epigenetischen Profils, was für eine willkürliche epigenetische Reprogrammierung dieser Lebewesen spricht, dessen Ausgang nicht voraussehbar ist (DEAN et al. 2003; JOUNEAU u. RENARD 2003;

KANG et al. 2003; SANTOS et al. 2003; HOCHEDLINGER et al. 2004). Im Einzellstadium konnte anhand von Veränderungen in der Organisation der Methylierungen eine partielle Reprogrammierung festgestellt werden, was

wahrscheinlich auf eine aktive Demethylierung zurückzuführen war. Die fehlende passive Demethylierung und die unangemessene frühe De-novo-Methylierung im Vier- bzw. Achtzellstadium gaben jedoch Hinweise auf eine inadäquate nukleäre Reprogrammierung (KHOSLA et al. 2001). Im Blastozystenstadium konnten die Unterschiede im Methylierungsmuster, die in normalen Embryonen zwischen den Zellen des Embryonalknotens und den Zellen des Trophektoderms aufzufinden sind, nicht in gleichem Ausmaß festgestellt werden. Stattdessen konnte ein Anstieg der Methylierung aller Zellen nachgewiesen werden, was zu einer Hypermethylierung des Trophektoderms führte. Die Ergebnisse zeigen, dass es bei der Mehrzahl der geklonten präimplantatorischen Embryonen zu einer fehlerhaften epigenetischen Reprogrammierung kommt, welche durch ihren Einfluss auf die Genexpression für die abnorme Entwicklung dieser Individuen verantwortlich ist (BOIANI et al. 2002;

BYRNE et al. 2002; INOUE et al. 2002). So konnte im extraembryonalen Gewebe geklonter porciner Embryonen ein verändertes Expressionsmuster verschiedener Gene (PARK et al. 2013) sowie in geklonten bovinen Embryonen eine biallelische Expression geprägter Gene nachgewiesen werden (SMITH et al. 2012).

2.2.5 Methoden zur Analyse der DNA-Methylierung

Zahlreiche Methoden zur Analyse der DNA-Methylierung sind in den letzten Jahren entwickelt worden und schematisch in Abbildung 4 dargestellt. Vier unterschiedliche Techniken, welche bereits in Gameten bzw. Embryonen angewandt wurden, liegen diesen Verfahren zugrunde:

1. Digestion der DNA mit Methylierungssensitiven Restriktionsendonukleasen 2. Affinitätsreinigung durch Methylierte DNA Immunopräzipitation oder Methyl-

bindende Domänen enthaltende Proteine 3. Bisulfitsequenzierung

4. Immunzytochemie

Abbildung 4: Schematische Darstellung der genspezifischen und globalen DNA-Methylierungsanalyse (ZILBERMAN u. HENIKOFF 2007)

DNA-Methylierung

Globale Analyse Genspezifische Analyse

Bisulfit-Behandlung

Immun-zytochemie

→ Methylierungssensitive Restriktions- endonukleasen

→ Affinitätsreinigung methylierter DNA

→ Bisulfit-Behandlung

→ Mikroarrays

→ Sequenzierung

2.2.5.1 Methylierungssensitive Restriktionsendonukleasen

Die Analyse des Methylierungsmusters der DNA durch den Einsatz von Isoschizomeren bakterieller methylierungssensitiver Restriktionsendonukleasen (MSREs) mit unterschiedlichen Sensitivitäten für das 5-Methylcytosin ist in der Literatur zahlreich beschrieben (DAHL u. GULDBERG 2003; SULEWSKA et al.

2007; ZILBERMAN u. HENIKOFF 2007; ZUO et al. 2009; PIPERI u.

PAPAVASSILIOU 2011). Die Schnittstellen-Spezifität und die Methylierungsabhängigkeit zahlreicher verfügbarer Restriktionsenzyme machen den Restriktionsverdau zu einem nützlichen Verfahren genomischer Fraktionierung (ZUO et al. 2009). Je nach verwendeten Restriktionsenzymen und deren Sensitivitäten kommt es zu einer Anreicherung methylierter oder unmethylierter DNA-Fragmente (ZILBERMAN u. HENIKOFF 2007). Eines der Enzyme des Isoschizomers weist üblicherweise keine Sensitivität gegenüber 5-Methylcytosin auf, wohingegen das andere Enzym des Paares die DNA nicht spaltet, wenn die Schnittstelle methylierte Cytosinmoleküle enthält (DAHL u. GULDBERG 2003). Ein in der Methylierungsanalyse häufig verwendetes Isoschizomer-Paar stellt HpaII (type-2 restriction enzyme HpaII)/MspI (type-2 restriction enzyme MspI) dar. Beide Enzyme spalten die DNA an CCGG-Sequenzen, HpaII ist jedoch im Falle einer Methylierung der Cytosine dieser Sequenzen nicht in der Lage, die DNA an dieser Lokalisation zu spalten (DAHL u. GULDBERG 2003; ZILBERMAN u. HENIKOFF 2007). Somit kommt es nach der Inkubation der Nukleinsäuren mit HpaII zu einer Anreicherung methylierter DNA-Fragmente. Der Verdau der Nukleinsäuren mit MspI hingegen resultiert in der Bildung kleinerer Fragmente, welche in weiterführenden Analysen, z.B. im Rahmen von Mikroarrays, nicht berücksichtigt werden. Das Enzym McrBC (5-methylcytosine restriction system component) wiederum spaltet spezifisch methylierte DNA. Somit resultiert der Verdau der Nukleinsäuren mit McrBC in einer Anreicherung unmethylierter Fragmente (ZILBERMAN u. HENIKOFF 2007). Die Wirkungsweise methylierungssensitiver Restriktionsendonukleasen ist in Abbildung 5 dargestellt.

Die Verwendung von methylierungssensitiven Restriktionsenzymen stellt eine sehr sensitive, einfach durchzuführende Methode dar, die sich für die Untersuchung spezifischer Sequenzen im Genom eignet. Eine entscheidene Limitierung der Restriktionsenzym-basierten Techniken zur DNA-Methylierungsanalyse ist ihre Beschränkung auf die Identifikation von Methylierungen innerhalb der Erkennungssequenzen der Enzyme (PIPERI u. PAPAVASSILIOU 2011). Zudem sind falsch-positive Ergebnisse durch eine unvollständige Digestion möglich (DAHL u.

GULDBERG 2003).

Abbildung 5: Wirkungsweise Methylierungssensitiver Restriktionsendonukleasen (ZILBERMAN u. HENIKOFF 2007)

2.2.5.2 Affinitätsreinigung methylierter DNA durch Methylierte DNA Immunopräzipitation oder Methyl-CpG-bindende Domänen enthaltende Proteine

Die Anreicherung methylierter DNA durch eine Affinitätsreinigung ist vielfach beschrieben worden (ZILBERMAN u. HENIKOFF 2007; FOUSE et al. 2010; HUANG et al. 2010; ACEVEDO et al. 2011; PIPERI u. PAPAVASSILIOU 2011). Die Anreicherung der methylierten Fraktion des Genoms kann durch eine Methylierte DNA Immunopräzipitation (MeDIP) oder eine Affinitätschromatographie mithilfe Methyl-CpG-bindender Domänen (MBD) von Proteinen bewirkt werden (Abbildung 6). Zur weiteren Analyse der Fragmente werden häufig verschiedene Mikroarrays oder Sequenzierungsverfahren verwendet (Kapitel 2.2.5.4).

Für eine Immunopräzipitation methylierter DNA können kommerziell erhältliche Antikörper, welche spezifisch gegen methylierte Cytosine gerichtet sind, eingesetzt werden. Auch MBD-enthaltende Proteine, zu denen u.a. MBD1, MBD2 und MBD4 gehören, können zur DNA-Methylierungsanalyse verwendet werden. Die MBD-Säule dient der Aufreinigung methylierter DNA, indem die Domänen methylierte CG-Sequenzen binden. Die Verwendung eines eine methylbindende Domäne enthaltenden Proteins zur Auftrennung von DNA-Fragmenten anhand ihrer Methylierung wurde erstmals 1994 beschrieben. Um das Methylierungsmuster humaner DNA männlicher Individuen zu analysieren, verwendeten die Autoren das chromosomale Protein MeCP2 (methyl-CpG-binding protein 2) der Ratte (CROSS et al. 1994). Auch MBD1 wurde bereits mehrfach zur Analyse von Veränderungen des globalen DNA-Methylierungsmusters in vivo verwendet (KIMURA et al. 2010). So konnte die mit einem grün fluoreszierenden Protein markierte MBD-Domäne des MBD1-Proteins in einer Studie Veränderungen der globalen DNA-Methylierung in murinen embryonalen Stammzellen sowie Mäuseembryonen nachweisen (YAMAGATA et al. 2007).

Diese Methode eignet sich besonders für die Analyse von Säugergenomen, da sie eine erhebliche Herabsenkung der Komplexität der zu untersuchenden Proben bewirkt. Desweiteren ist dieses Verfahren im Vergleich zu den

Restriktionsenzym-basierten Methoden nicht auf die Analyse der Schnittstellen-Sequenzen beschränkt (ZILBERMAN u. HENIKOFF 2007). Die Anreicherung methylierter DNA durch eine Affinitätsreinigung dient der Ermittlung der Methylierungsdichte innerhalb bestimmter Regionen der DNA. Daher ist es mit dieser Methode schwierig DNA-Sequenzen mit einer niedrigen Methylierungsdichte von unmethylierten Sequenzen zu unterscheiden. Dies betrifft v.a. Säugergenome, denn diese weisen eine niedrige CpG-Dinukleotid-Dichte auf und ihre CpG-dichten Sequenzbereiche sind typischerweise unmethyliert (WEBER et al. 2007).

Abbildung 6: Schematische Darstellung der MeDIP und der Anwendung von MBD-enthaltenden Proteinen (CROSS et al. 1994; WEBER et al. 2005;

ZILBERMAN u. HENIKOFF 2007)