Prüfung der antibakteriellen Aktivität boviner Immunzellen und Chemokine in vitro
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet )
vorgelegt von Annika Bogusch
Nordenham
Hannover 2015
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. H.-J. Schuberth
2. Gutachter: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Tag der mündlichen Prüfung: 22.05.2015
Für meine Familie, ohne die das Leben keinen Sinn hätte.
2.1 Escherichia coli ... 14
2.2 Bakterienmarkierung durch Fluoreszenzfarbstoffe ... 15
2.3 Zellen des angeborenen Immunsystems ... 17
2.3.1 Monozyten ... 17
2.3.2 Neutrophile Granulozyten ... 18
2.3.3 Natürliche Killerzellen ... 19
2.3.3.1 Eigenschaften der NK-Zellen ... 19
2.3.3.2 NKp46 ... 20
2.3.3.3 NK-Zellen des Rindes ... 20
2.3.3.4 Bovine NK-Zell-Subpopulationen ... 21
2.3.3.5 Rolle der bovinen NK-Zellen bei Infektionen ... 22
2.4 Antimikrobielle Peptide ... 22
2.4.1 Antimikrobielle Chemokine ... 24
2.4.2 CXCL9, CXCL10 und CXCL11 ... 25
2.4.3 Defensine, Cathelicidine und Laktoferrin ... 26
2.4.4 Wirkungsweise antimikrobieller Proteine ... 29
2.4.5 Nachweisverfahren antimikrobieller Wirkung ... 31
2.4.6 Antimikrobielle Proteine im Vergleich zu konventionellen Antibiotika ... 33
2.5 Polymyxine ... 33
2.5.1 Polypeptidantibiotika ... 33
2.5.2 Wirkungsweise der Polymyxine ... 34
2.5.3 Therapeutischer Einsatz von Polymyxinen ... 35
3 Methoden ... 36
3.1 Blutentnahme bei den Versuchstieren ... 36
3.2 Gewinnung von Gesamtleukozyten ... 36
3.3 Gewinnung mononukleärer Zellen ... 36
3.4 Gewinnung neutrophiler Granulozyten ... 37
3.5 Zellzahlbestimmung ... 37
3.6.1 Direkte MACS ... 38
3.6.2 Indirekte MACS ... 39
3.6.3 Magnetische Zellseparation ... 40
3.7 Membranimmunfluoreszenz ... 41
3.8 Zellkultur und In-vitro-Stimulation ... 42
3.8.1 Stimulation mit LPS und E. coli ... 42
3.8.2 Priming mit IL-12 ... 42
3.8.3 Degranulation von Neutrophilen ... 43
3.8.4 MAC-T Zelle und Co-Kulturen ... 44
3.9 Wachstumsverhalten und Anzüchtung des Testkeims ... 46
3.10 Mikrobiologische Nachweisverfahren antimikrobieller Effekte ... 48
3.10.1 Essigsäure-Harnstoff Gele ... 48
3.10.2 Gel Overlay Assay ... 49
3.10.3 Agardiffusionstest ... 50
3.10.4 Mikrodilution ... 50
3.10.5 Durchflusszytometrie ... 51
3.10.6 Durchflusszytometrische Messungen ... 52
3.10.7 Schachbretttest ... 53
3.11 Statistische Auswertungen ... 55
4 Ergebnisse ... 56
4.1 Methodische Vorarbeiten ... 56
4.1.1 Anreicherung der bovinen Blut-NK-Zellen mittels MACS ... 56
4.1.2 Durchflusszytometrische Charakterisierung boviner NK-Zell-Subpopulationen .. ... 59
4.2 Durchflusszytometrische Darstellung von E. coli ... 61
4.2.1 Einfluss von Medium und Bakteriendichte auf die durchflusszytometrische Darstellung ... 61
4.2.2 Vitalfärbungen zur Abgrenzung der Bakterien im Durchflusszytometer ... 62
4.2.5 Einfluss der Antibiotikakonzentration auf die Membranintegrität von E. coli .. 68
4.3 Mikrobiologische Testverfahren... 69
4.3.1 Nachweis antimikrobieller Effekte im Durchflusszytometer ... 69
4.3.1.1 Antibakterielle Wirkung von Immunzell-Kulturüberständen und rekombinanten bovinen Chemokinen auf E. coli ... 69
4.3.1.2 Antibakterielle Wirkung von Immunzell-Bakterien-Co-Kulturen auf E. coli ... 69
4.3.2 Nachweis antimikrobieller Effekte in der Mikrodilution ... 72
4.3.2.1 Antibakterielle Wirkung mononukleärer Zellen auf E. coli ... 72
4.3.2.2 Antibakterielle Wirkung von Monozytenüberständen auf E. coli ... 74
4.3.2.3 Antibakterielle Wirkung von neutrophilen Granulozyten und deren Degranulationsprodukten auf E. coli ... 76
4.3.2.4 Antibakterielle Wirkung von NK-Zell-Überständen auf E. coli ... 79
4.3.2.5 Antibakterielle Wirkung von MAC-T Zell-Co-Kulturen auf E. coli ... 84
4.3.2.6 Antibakterielle Wirkung von ausgewählten bovinen Chemokinen auf E. coli ... 85
4.3.3 Prüfung antimikrobieller Substanzen auf synergistische Wirkung ... 87
4.3.4 Vergleich der Sensitivität zwischen Mikrodilution und durchflusszytome- trischen Messungen bezüglich der Erfassung antimikrobieller Effekte ... 89
5 Diskussion ... 91
5.1 Magnetische Zellseparation zur Anreicherung von NK-Zellen ... 91
5.2 Durchflusszytometrische Messungen von E. coli... 94
5.3 Wirkungsnachweise antimikrobieller Effekte ... 96
5.4 Antimikrobielle Effekte der zellfreien Kulturüberstände ... 101
5.5 ERL-negative bovine Chemokine ... 111
5.6 Konklusion und Ausblick ... 113
6 Zusammenfassung ... 115
7 Summary ... 118
8 Literaturübersicht ... 121
9 Abbildungsverzeichnis ... 146
12.1 Geräte ... 155
12.2 Material ... 157
12.2.1 Klinikbedarf ... 157
12.2.2 Laborbedarf ... 158
12.2.3 Reagenzien ... 159
12.2.4 Bovine Antikörper ... 163
12.2.5 Kits ... 163
12.2.6 Biologisches Material ... 164
12.2.7 Versuchstiere ... 164
12.2.8 Zusammensetzung der Lösungen, Medien und Puffer ... 165
12.2.8.1 Lösungen für Zellseparation ... 165
12.2.8.2 Lösungen für Zellkultur ... 165
12.2.8.3 Lösungen und Puffer für molekularbiologische Verfahren ... 168
12.2.8.4 Lösungen und Puffer für proteinbiochemische Methoden ... 168
12.2.9 Plasmide ... 170
12.3 CCL20 ... 172
12.3.1 Zellbiologische Methoden ... 172
12.3.1.1 Kultivierung der HEK 293-Zellen ... 172
12.3.1.2 HEK-Zell-Transfektion ... 173
12.3.2 Molekularbiologische Methoden... 174
12.3.2.1 mRNA-Extraktion aus MNC ... 174
12.3.2.2 cDNA Synthese mittels SuperScript™ II ... 175
12.3.2.3 Polymerase-Kettenreaktion ... 175
12.3.2.4 Primerdesign und -optimierung ... 176
12.3.2.5 Agarosegelelektrophorese ... 177
12.3.2.6 Gelextraktion ... 178
12.3.2.7 Klonierung ... 178
12.3.2.8 Plasmidextraktion ... 179
12.3.2.12 Ligation ... 182
12.3.2.13 BL21(DE3)-Transformation ... 183
12.3.3 Proteinbiochemische Methoden ... 183
12.3.3.1 Proteinexpression in E. coli mittels IPTG-Induktion ... 183
12.3.3.2 Proteinbestimmung ... 184
12.3.3.3 SDS-PAGE ... 184
12.3.3.4 Coomassie-Färbung ... 185
12.3.3.5 Silberfärbung ... 185
12.3.3.6 Westernblot ... 186
12.3.3.7 Immunblot ... 186
12.3.4 Ergebnisse der CCL20-Versuche ... 187
13 Danksagung ... 188
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1 Einleitung und Zielsetzung
Die bovine Euterentzündung (Mastitis) ist die häufigste und teuerste Einzeltiererkrankung der Milchviehwirtschaft (BRADLEY 2002), die typischerweise eine antibiotische Therapie nach sich zieht. Da es neben dem peripartalen Zeitraum oftmals während der Trockenstehphase zu Infektionen kommt, werden Antibiotika zudem präventiv zum Trockenstellen verabreicht. Bis zu 80 % der eingesetzten Antibiotika bei Milchkühen dienen der Prävention und Therapie von Mastitiden (POL u. RUEGG 2007).
Die Deutsche Antibiotika-Resistenzstrategie aus dem Jahre 2011 steht dem Antibiotikaeinsatz kritisch gegenüber, weshalb nach therapeutischen Alternativen für das Trockenstellen und zur Behandlung klinischer Mastitiden gesucht wird. Als Ersatztherapeutika für Antibiotika kom- men antimikrobielle Peptide (AMP) in Frage, die in der Lage sind, mehrfach arzneimittelre- sistente Bakterienstämme abzutöten (GIULIANI et al. 2007) und als „natürliche Antibiotika“
bezeichnet werden. Zu dieser Gruppe von kleinen, amphipathischen Molekülen gehören bei- spielsweise viele Chemokine, wie CXCL9, CXCL10 und CXCL11. Diese Peptide interagie- ren mit der Zellwand von Pathogenen und führen auf vielfältige Weise zur Membranlyse (A.
M. COLE et al. 2001). Interessanterweise führt der Kontakt von Escherichia coli (E. coli) mit bovinen Milchdrüsenepithelzellen in vitro und in vivo zur präferentiellen Expression von sol- chen Chemokinen (PETZL et al. 2012), für die im Humansystem eine antimikrobielle Aktivi- tät gezeigt werden konnte (CHAN et al. 2008; LINGE et al. 2008). Ein Ziel dieser Arbeit be- steht darin, die antibakterielle Wirkung dieser drei bovinen Chemokine zu charakterisieren.
Zudem soll versucht werden, ein putativ beim Rind vorkommendes antibakterielles Chemokin (CCL20) zu klonieren und zu exprimieren sowie auf seine Funktion zu überprüfen.
Dazu sollen im Rahmen der Dissertation verschiedene mikrobiologische Vitalitätsnachweise durchgeführt werden, um antimikrobielle Wirkungen erfassbar zu machen. Wesentliches Au- genmerk soll auf die Entwicklung von durchflusszytometrischen Verfahren gelegt werden. Es soll geprüft werden, ob diese Analysen den entscheidenden Vorteil eines schnelleren und sen- sitiveren Nachweises eines antimikrobiellen Effektes gegenüber herkömmlichen Verfahren wie der Mikrodilution bieten. Die analytischen Testverfahren sollen ebenfalls zur Prüfung
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einer direkten antibakteriellen Wirkung von leukozytären Zellsubpopulationen eingesetzt werden. Neben neutrophilen Granulozyten, mononukleären Zellen (MNC) und Monozyten sollen insbesondere natürliche Killerzellen (NK-Zellen) auf ihre Fähigkeit geprüft werden, direkt oder stimulationsabhängig E. coli zu töten. Dafür soll eine Methode zur Anreicherung boviner NK-Zellen mittels magnetischer Zellseparation erarbeitet werden.
Viele dieser Zellen sind mit antimikrobiellen Substanzen ausgestattet oder können sie nach Aktivierung bilden (AGERBERTH et al. 2000). Die Fähigkeit der Zellen schnell und ausrei- chend antibakterielle Substanzen zu sezernieren und damit bereits im Frühstadium einer In- fektion Bakterien zu eliminieren, stellt ein lohnendes Ziel für einen präventiven immunmodulatorischen Ansatz dar. Im weitesten Sinne soll diese Arbeit mithelfen, über die- sen Ansatz den präventiven Einsatz von Antibiotika bei Milchkühen mittel- und langfristig zu reduzieren.
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2 Literaturübersicht
Gegen die bovine Mastitis gibt es bis dato kein wirklich überzeugendes Impfkonzept und nach Krankheitsausbruch wird die Euterentzündung derzeit am häufigsten mit Antibiotika therapiert. Präventiv werden den Kühen zudem zu Beginn der Trockenstehphase Antibiotika verabreicht, da die Tiere zu dieser Zeit besonders mastitisanfällig sind (HOGAN u. LARRY SMITH 2003; BERRY u. HILLERTON 2007).
Der hohe Antibiotikaeinsatz in der Mastitisbekämpfung wird zunehmend kritisch bewertet, da es durch diesen zu ständig erhöhtem Selektionsdruck auf die Erreger kommt, was zu der Aus- bildung von resistenten Keimen führt (ASAI et al. 2005). E. coli ist einer der am häufigsten isolierten Keime bei Erkrankungen der Milchdrüse und des Urogenitaltraktes in der peripartalen Phase von Rindern (HOGAN u. LARRY SMITH 2003; KAPER et al. 2004;
HERATH et al. 2006). Außerdem ist E. coli in der Lage, durch horizontalen Gentransfer schnell Resistenzen gegen die üblicherweise eingesetzten Antibiotika auszubilden (SELBITZ et al. 2011). Aus diesem Grund werden Mittel und Wege gesucht, welche die Antibiotikatherapie ersetzen könnten. Ein Ansatz besteht darin, durch epigenetische Beein- flussung der Immunzellen den Körper in die Lage zu versetzen, die Pathogene selbst zu eli- minieren, indem die Zellen vermehrt antimikrobiell wirksame Substanzen generieren (ISSA 2003; GALLI et al. 2011).
Im Folgenden soll näher auf das Pathogen E. coli, die Wirkungsweise antimikrobieller Pepti- de auf bakterielles Wachstum und bovine Immunzellen eingegangen werden. Ferner spielen die durch Immunzellen freigesetzten Mediatoren eine Rolle für den Entzündungsverlauf, wo- bei der Fokus auf den NK-Zellen wegen ihrer wichtiger werdenden Rolle am bakteriellen In- fektionsgeschehen liegen soll.
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Abbildung 1: Aktivierung von NK-Zellen bei bakteriellen Infektionen.
NK-Zellen werden durch ein Netzwerk von akzessorischen Zellen, die bakterielle Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) erkennen, aktiviert. Die Aktivierung der akzessorischen Zellen führt zur Produktion von Zytokinen, die wiederum zur Aktivierung von NK-Zellen beitragen, wobei die NK- Zellen selber auch in der Lage sind PAMPs zu erkennen. Negative Signale, wie z.B. Glukokortikoide oder IL-10, wirken direkt auf NK-Zellen. PGN = Peptidoglykan, OmpA = Außenmembranprotein A, Mø = Makrophagen, PMN = neutrophile Granulozyten, B = B-Lymphozyten, MAST = Mastzellen, EPITH. = Epithelzellen, TREG = regulierende T-Zellen, PGE2 = Prostaglandin E2, PGD2 = Prostaglandin D2, NK = NK-Zellen. Nach SOUZA-FONSECA-GUIMARAES et al. (2012).
2.1 Escherichia coli
Der in dieser Arbeit verwendete Testkeim gehört zur Familie der Enterobacteriaceae, bei denen es sich um fakultative Anaerobier mit > 30 dazugehörigen Genera handelt. Eines davon ist Escherichia und die wichtigste Art innerhalb dieser Gattung ist E. coli, die anhand der An- tigenstrukturen auf der Oberfläche wiederum in verschiedene Serotypen eingeteilt werden kann. E. coli sind meist bewegliche gramnegative gerade Stäbchen, die 1-1,5 µm breit und 2-6 µm lang sind und Laktose spalten können. Die Bakterien sind anspruchslos in der Kulti- vierung und wachsen als mittelgroße, gewölbte, grau-weiße Kolonien. Es gibt avirulente und virulente Stämme, die sich durch die Akquirierung von Virulenz- und Fitnessgenen aus den erstgenannten entwickeln. Aufgrund von horizontalem Gentransfer weisen E. coli nur ein ge- meinsames Genom von 30 % auf und sind deshalb sehr anpassungsfähig sowie in der Lage,
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schnell Resistenzen zu entwickeln. Sie kommen als Kommensalen der Dickdarmflora in einer Dichte von bis zu 1010 Bakterien/g Kot vor (LUKJANCENKO et al. 2010; SELBITZ et al.
2011). E. coli wird auch als Fäkalkeim bezeichnet und dient damit als Indikator für die Hygi- ene. Da dieser Erreger ubiquitär vorkommt, werden Tiere ihm leicht ausgesetzt, was z.B. dann zum Problem werden kann, wenn das Hygienemanagement ungenügend ist. Dann kommt es häufig zu einer extraintestinalen Besiedlung mit E. coli, wobei hauptsächlich das Euter und der Urogenitaltrakt bei Rindern betroffen sind, was bei einer nicht adäquaten Immunantwort zu Mastitiden und Metritiden führen kann – zwei sehr gängigen Infektionen bei Kühen vor allem in der peripartalen Periode (HOGAN u. LARRY SMITH 2003; KAPER et al. 2004).
2.2 Bakterienmarkierung durch Fluoreszenzfarbstoffe
Die Analyse der Bakterienvitalität mittels Durchflusszytometrie und Fluochrommarkierung ist ein schnelles und hochsensitives Verfahren, bei dem in kürzester Zeit viele Zellen untersucht werden (BREEUWER u. ABEE 2000; NEBE-VON-CARON et al. 2000; DAVEY 2002). Die Proben werden auf Einzelzellbasis untersucht, sodass die Heterogenität der Zellpopulation zum Tragen kommt, was bei konventionellen Methoden in der Regel nicht der Fall ist (SHAPIRO 2000). Bevor eine durchflusszytometrische Analyse erfolgen kann, müssen die Bakterien zuerst von anderen in der Probe enthaltenen Partikeln abgegrenzt werden. Die Ab- grenzung erfolgt hauptsächlich durch Nukleinsäurefärbung oder dem Nachweis gewisser Zell- funktionen, wie metabolische Aktivität und Membranintegrität, die den physiologischen Sta- tus der Bakterienvitalität näher charakterisieren (NEBE-VON-CARON et al. 2000; VEAL et al. 2000). Zu beachten ist, dass unterschiedliche Bakterien sehr verschieden auf die mannig- faltigen Färbungen reagieren, dieser Umstand könnte wiederum zur Differenzierung einzelner Populationen genutzt werden (STEEN 2000). Die Färbungen sind zudem von einer Vielzahl von Faktoren abhängig, wie den verwendeten Puffern, der Anzahl der Waschschritte, der Temperatur und dem Vorhandensein von Energiereserven. Aufgrund der sie umgebenden LPS-Schicht benötigen gramnegative Bakterien bei vielen Fluorochromen eine Vorbehand- lung mit Ethylendiamintetraacetat (EDTA) (12.2.3), bevor der Farbstoff die Membran passie- ren kann (NEBE-VON-CARON et al. 2000; ALSHARIF u. GODFREY 2002).
Die Membranintegrität kann durch zwei Methoden – Farbstoffretention oder -ausschluss – nachgewiesen werden. Bei der Retention werden nicht fluoreszierende Farbsubstanzen zu den
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Zellen gegeben, die erst durch intrazelluläre Enzyme, wie z.B. Esterasen, in ein fluoreszieren- des Produkt umgewandelt werden müssen, das nicht länger durch die intakte Zellmembran diffundieren kann. Diese Art der Färbung kann jedoch durch zu geringe Enzymaktivität, un- genügende Substrataufnahme und Effluxpumpen zu einer verminderten Fluoreszenz führen.
Auf der anderen Seite kann es selbst nach Verlust der Membranintegrität zum Verbleib von fluoreszierendem Farbstoff kommen, wenn er in Vakuolen akkumuliert, was ebenfalls zu in- akkuraten Ergebnissen führt. Zu dieser Gruppe zählen Fluorescein diacetate (FDA), Carboxyfluorescein diacetate (CFDA) und dessen Acetoxymethyl Ester (CFDA-AM), 2‘,7‘- bis-(2-carboxyethyl)-5-(und-6)-carboxyfluorescein-AM (BCECF-AM) und Calcein-AM (KING 2000). Farbstoffexklusion mit Propidiumjodid (PI) ist meist die Methode der Wahl, da hierbei der Einflussfaktor der Enzymaktivität umgangen wird (NEBE-VON-CARON et al.
2000). Zu den nukleinsäurebindenden Fluoreszenzfarbstoffen, die nur membrangeschädigte Zellen färben, gehören außerdem Ethidiumbromid, Ethidium-Homodimer-1, Ethidium- monoazide, 7-Aminoactinomycin D, SYTOX Green, YO-PRO-1 und TO-PRO-3 (KING 2000).
Andere Substanzen, wie Thiazol Orange, färben sowohl lebende als auch tote Zellen, wobei der Grad der Substrataufnahme von der Vitalität der Bakterien abhängig ist (L. G. LEE et al.
1986; ALSHARIF u. GODFREY 2002).
Weiterhin gibt es spannungsabhängige Färbungen, deren Fluoreszenz auf dem Verlust der transmembranen Spannung beruht. Hierzu zählen kationische Farbstoffe, wie Rhodamine 123, und anionische, zu der die Oxonole gehören. Durch die negative Ladung der Membran vitaler Bakterien können Farbstoffe, die selbst eine negative Ladung aufweisen, nicht in die Zelle gelangen. Eine Depolarisierung zeigt zwar einen Abfall der Zellfunktionalität an, aber da nach Ausplattieren trotzdem Kolonien wachsen, ist es kein Zeichen für erfolgten Zelltod (DEERE et al. 1995; MASON et al. 1995; NEBE-VON-CARON et al. 2000).
Die Kombination von verschiedenen Fluorochromen wird oft angewendet, um eine genauere Charakterisierung der Bakterien zu erlauben. Eine dabei oft benutzte Färbung ist die bis- Oxonol, Ethidiumbromid und Propidiumjodid (BEP)-Färbung, die selbst für Zellen mit
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Effluxsystemen geeignet ist (NEBE-VON-CARON et al. 2000). Kommerziell erhältliche Kits, wie das LIVE/DEAD BacLight™ Bacterial Viability Kit von Molecular Probes Inc., erlauben durch die Kombination aus SYTO9™ (einem Fluorochrom, das alle Bakterien färbt) und PI eine klare Definierung sowohl lebender als auch toter Bakterien (BOULOS et al.
1999).
Abschließend bleibt trotz der vielfältigen und ausdifferenzierten Färbetechniken festzustellen, dass keine Färbung eine garantierte Aussage über die bakterielle Vitalität erlaubt, da selbst eine Membranpermeabilisierung bis zu einem gewissen Grad reversibel sein kann (NEBE- VON-CARON et al. 2000).
2.3 Zellen des angeborenen Immunsystems
Wenn Pathogene die mechanischen und physikalischen Barrieren des Körpers penetriert ha- ben, aktivieren sie dadurch Zellen des angeborenen Immunsystems. Zu diesen Zellen gehören Granulozyten, Makrophagen und NK-Zellen (K.M. MURPHY et al. 2009).
2.3.1 Monozyten
Monozyten sind ein Teil des angeborenen Immunsystems, gehören zum mononukleären Phagozytensytem und entwickeln sich aus hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmar- kes in Anwesenheit vom colony stimulating factor 1 (VAN FURTH et al. 1972; AUFFRAY et al. 2009). Ihr Durchmesser beträgt 5-20 µm und ihr Aussehen wird von einem großen oft bohnenförmigen Kern geprägt, der nur von wenig Zytoplasma umgeben ist (JONAS et al.
1990). Sie zirkulieren nach Freisetzung aus dem Knochenmark für einige Tage im Blut, bevor sie ins Gewebe einwandern und sich dort weiter zu Makrophagen oder Dendritischen Zellen differenzieren (AUFFRAY et al. 2009; ZIEGLER-HEITBROCK 2014).
Monozyten lassen sich aufgrund ihrer Oberflächenmoleküle (CD14, CD16 und CD163) in drei Subpopulationen einteilen. Nicht klassische Monozyten machen etwa 6 % der Monozyten aus und exprimieren kein CD14, viel CD16 und kein CD163. Dagegen ist CD163 sowohl bei den intermediären als auch den klassischen Monozyten vorhanden. Klassische Monozyten stellen die größte Fraktion mit 90 % dar und sind stark CD14 positiv und CD16 negativ.
Intermediäre Monozyten machen 4 % der Monozyten aus, die CD16 und viel CD14 exprimie-
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ren (HUSSEN et al. 2013; ZIEGLER-HEITBROCK 2014). Während einer Entzündung mig- rieren vor allem die nicht klassischen Monozyten schnell in das betroffene Gewebe entlang eines chemotaktischen Gradienten, der durch Lysate von neutrophilen Granulozyten entsteht (SOEHNLEIN et al. 2009). Dort modulieren Monozyten durch Zytokinsekretion die Immun- antwort und beseitigen die Pathogene durch Phagozytose sowie die Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder AMP (AGERBERTH et al. 2000; AUFFRAY et al. 2009;
SOEHNLEIN et al. 2009).
2.3.2 Neutrophile Granulozyten
Neutrophile Granulozyten, die auch als polymorphkernige Neutrophile (PMN) oder nur als Neutrophile bezeichnet werden, entstehen aus pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark, wobei täglich 5-10 x 1010 Neutrophile freigesetzt werden. Diese hohe Pro- duktionsrate ist nötig, da Neutrophile zu den kurzlebigsten Zellen des Körpers gehören und nur 6-8 Stunden im Blut zirkulieren, bevor sie apoptotisch werden. Die geringe Lebensdauer könnte ein Weg sein, um eine Schädigung des Körpers durch die in den Granula enthaltenen Inhaltsstoffe zu verhindern (SUMMERS et al. 2010; AMULIC et al. 2012). Die Apoptose kann jedoch durch proinflammatorische Zytokine verhindert werden, sodass diese Zellen im Falle einer Entzündung bei der Eliminierung der Pathogene helfen können (WILLIAMS et al.
2011).
Den PMN stehen zur Pathogenbekämpfung eine Vielzahl an Substanzen zur Verfügung, wie z.B. antimikrobielle Peptide, die in den Granula gespeichert vorliegen. Neutrophile beinhalten vier verschiedene Granulatypen (primäre, sekundäre, tertiäre Granula und sekretorische Vesikel), die während ihrer Maturation im Knochenmark gebildet werden. Die Degranulation erfolgt in entgegengesetzter Richtung zu ihrer Entstehung, sodass die sekretorischen Vesikel zwar als letztes gebildet aber als erstes sekretiert werden (GULLBERG et al. 1999; AMULIC et al. 2012). Neben der Degranulation können neutrophile Granulozyten die Pathogene auch phagozytieren, die dann in Phagolysosomen durch AMP oder ROS abgetötet werden. Darüber hinaus sind sie in der Lage Mikroorganismen durch neutrophil extracellular traps (NETs) zu eliminieren (MAYER-SCHOLL et al. 2004; AMULIC et al. 2012). AMP sind vorzugsweise in primären und sekundären Granula gespeichert und zu einem kleinen Anteil auch in den tertiären Granula enthalten. Primäre Granula enthält Myeloperoxidase, ein Enzym, das zur
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Generierung der ROS benötigt wird, und verschiedene AMP, wie Defensine, Lysozym, BPI (Bactericidal/Permeability Increasing Protein) und einige Serinproteasen. Die sekundäre Granula besteht aus Laktoferrin sowie hCAP-18 (human cathelicidin antimicrobial pepti- de 18) und Lysozym, wohingegen die tertiäre Granula vor allem Metalloproteinasen enthält (FAURSCHOU u. BORREGAARD 2003; AMULIC et al. 2012).
Des Weiteren haben PMN eine wichtige chemotaktische Wirkung. Durch Sekretion von Zytokinen oder Freisetzung anderer Mediatoren, die von apoptotischen Zellen stammen, sind Neutrophile in der Lage, andere Immunzellen, wie z.B. Monozyten, zu rekrutieren (SOEHNLEIN et al. 2009).
2.3.3 Natürliche Killerzellen
2.3.3.1 Eigenschaften der NK-Zellen
Bei NK-Zellen handelt es sich um große granuläre Lymphozyten des angeborenen Immunsys- tems. Durch die Produktion von Zytokinen und Interaktion mit antigenpräsentierenden Zellen modulieren NK-Zellen die angeborene Immunität (L. MORETTA et al. 2002b). Der Wirkme- chanismus der NK-Zellen wird durch die Hypothese des „missing self“ von Ljunggren und Kärre beschrieben. Sie zeigten erstmalig auf, dass Zellen, die kein oder nur vermindert MHC- Klasse-I Moleküle exprimieren, von NK-Zellen getötet werden (KARRE et al. 1986). Dane- ben gibt es weitere beschriebene Strategien der NK-Zell-Regulation wie inhibitorische Rezep- toren, welche die NK-Zellaktivierung über Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs (ITIMs) modulieren (VELY u. VIVIER 1997) oder die „stress-induced self recognition“ über NKG2D (natural-killer group 2, member D) (RAULET 2003). Zirkulierende NK-Zellen sind keine „steady-state killer“, es sei denn, sie durchlaufen zuvor den Prozess einer funktionellen Reifung – NK cell education. Dabei muss neben anderen bisher unbekannten Faktoren das eigene MHC-Klasse-I über inhibitorische Rezeptoren erkannt werden. Die Mehrheit der NK- Zellen im Blut ist daher nicht- oder hypoempfänglich (ANFOSSI et al. 2006; VIVIER 2006).
Zusammenfassend bleibt zur Regulation der NK-Zellen zu sagen, dass sie aktivierende und inhibitorische Rezeptoren besitzen, von denen viele MHC-Klasse-I oder Klasse-I-ähnliche Liganden erkennen, sodass das Gleichgewicht zwischen den Rezeptoren maßgeblich das Er-
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gebnis der Interaktion von NK-Zellen mit möglichen Zielzellen bestimmt (STORSET et al.
2004).
2.3.3.2 NKp46
Um Untersuchungen an NK-Zellen durchzuführen, ist eine eindeutige Charakterisierung der Zellpopulation notwendig. Dazu wird in den meisten Fällen ein Oberflächenmolekül genutzt, das ausschließlich auf den nachzuweisenden Zellen vorkommt. Diesen Kriterien entspricht das NKp46-Protein (natural killer cell p46-related protein), das so benannt wurde, weil eine 46 kDa große Bande durch einen NKp46-spezifischen monoklonalen Antikörper (Ak) in NK- Zellen präzipitiert wurde. NKp46 wird auch als natural cytotoxicity triggering receptor 1 (NRC1) bezeichnet und ist Teil der Immunglobulin-Superfamilie (PESSINO et al. 1998).
NKp46-positive Zellen weisen kein CD3, CD4, WC1, keinen T-Zell Rezeptor 1 und keine B- Zell- oder Granulozytenmarker auf. Bovines NKp46 wird als Monomer exprimiert und die molekulare Masse (47 kDa) ist mit der von humanem NKp46 vergleichbar (STORSET et al.
2004). Das cluster of differentiation (CD) für NKp46 ist CD335. CD335 wird als Oberflä- chenmolekül dazu verwendet, NK-Zellen von anderen mononukleären Zellen des peripheren Blutes abzugrenzen, z.B. im Durchflusszytometer durch Fluorochrom-markierte Ak (SIVORI et al. 1997; STORSET et al. 2004).
2.3.3.3 NK-Zellen des Rindes
NK-Zellen kommen sowohl in lymphoiden als auch nicht lymphoiden peripheren Geweben vor, etwa im Blut, im Knochenmark, in der Milz, den Lymphknoten, der Leber, der Lunge, dem Omentum, dem Darm und der Plazenta (A. MORETTA et al. 2002a). Die Gewebevertei- lung beim Rind ist mit der bei anderen Spezies vergleichbar. Die NKp46-positiven peripheren Blutzellen haben einen Anteil von 1 % - 10 % an den bovinen MNC, wobei die Menge zwi- schen den Tieren und ihrem Alter variiert (STORSET et al. 2004), da eine signifikant negati- ve Korrelation zwischen der Menge an NK-Zellen und dem Alter besteht. Junge Kälber wei- sen die höchste Menge an NK-Zellen auf (3,5 %), deren Anzahl sukzessiv mit steigendem Alter abnimmt (2,2 %), bis ein Tiefpunkt bei Färsen erreicht wird (1,5 %). Bei adulten Rin- dern erfolgt ein moderater Anstieg auf einen Anteil von 2,1 % NK-Zellen an den peripheren Blutlymphozyten. Dennoch bleibt die relative NK-Zellmenge beim Rind geringer als beim
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Mensch, wobei der altersabhängige Verlauf bei beiden ähnlich ist. Davon ausgenommen sind neugeborene Kälber, denn bei Tieren, die jünger als acht Tage sind, ist der Prozentsatz sehr niedrig (0,1 % - 1,8 %), während beim Mensch um 20 % der Lymphozyten im Nabelschnur- blut NK-Zellen sind. Bei Menschen sinkt der Anteil innerhalb des ersten Lebensjahres auf ca.
11 % ab, bevor er wieder langsam bei Adulten (> 17 Jahre) auf ca. 14 % ansteigt. Diese Diffe- renz wird dadurch erklärt, dass γδ T-Zellen beim Rind ähnliche Funktionen übernehmen wie die NK-Zellen. Der relative Anteil der γδ T-Zellen liegt um 20 % bei Kälbern und unter 10 % bei adulten Rindern; zum Vergleich machen sie bei erwachsenen Menschen unter 5 % der zirkulierenden T-Zellen aus und bei Neugeborenen nur etwa 1 %. Die recht hohe NK-Zellmenge bei Kindern und Kälbern wird als Kompensation für die Unreife des adaptiven Immunsystems angesehen (KULBERG et al. 2004).
2.3.3.4 Bovine NK-Zell-Subpopulationen
Bovine NK-Zellen werden in zwei Subpopulationen unterteilt, die anhand der Expression von CD2 unterschieden werden können. CD2-negative NK-Zellen, die eine kleine Untergruppe von ca. 20 % (STORSET et al. 2004) (15 % - 30 % bei BOYSEN et al. (2006)) im Blut aus- machen, stellen die aktivierten Zellen dar, denn sie proliferieren schneller in der Zellkultur und produzieren eine größere Menge an Interferon γ (IFN-γ). Zudem weisen CD2-negative NK-Zellen vermehrt die beiden Aktivierungsmarker CD44 und CD25 auf. Die Zytotoxizität beider Subpopulationen ist gleich stark. Humane NK-Zellen werden durch die Expression von CD56 charakterisiert, wobei CD56bright Zellen vor allem Chemokine produzieren, wohingegen CD56dim Zellen zytotoxisch effektiver sind. Dadurch ist ein direkter Vergleich zwischen hu- manen und bovinen Subsets nicht möglich, da bovine NK-Zellen kein CD56 exprimieren (COOPER et al. 2001; BOYSEN et al. 2006).
Zwischen 4 % - 15 % der bovinen NK-Zellen sind zudem CD8-positiv. Bovine IL-2-aktivierte NK-Zellen exprimieren CD8 hauptsächlich als αβ-Heterodimer im Gegensatz zu Mensch und Ratte, deren NK-Zellen CD8 α-Homodimere aufweisen, und murinen NK-Zellen, die gar kein CD8 exprimieren. Die funktionelle Rolle von CD8 auf NK-Zellen ist noch unklar, doch nach einer Aktivierung durch IL-2 erhöhen NK-Zellen signifikant ihre CD25- und CD8- Expression, sodass es sich wahrscheinlich um einen Aktivierungsmarker handelt (STORSET et al. 2004).
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2.3.3.5 Rolle der bovinen NK-Zellen bei Infektionen
Das Vorhandensein von Rezeptoren für PAMPs (Pathogen-associated molecular patterns) zeigt das Vermögen angeborener Immunzellen mikrobielles „non self“ zu erkennen und die anschließend sekretierten Zytokine verändern die Qualität der darauf folgenden Immunant- wort (MEDZHITOV u. JANEWAY 1997). NK-Zellen helfen dadurch mit, den Organismus vor viralen, bakteriellen und parasitischen Infektionen zu schützen, indem sie die Pathogenbelastung bei Entzündungen durch ihre eigene Zytotoxizität kontrollieren. Diese entsteht durch Freisetzung zytotoxischer Granulaproteine, wie z.B. Granulysin (KRENSKY 2000), die zusammen mit Perforin in der Lage sind, infizierte Zellen zu lysieren, und eine antimikrobielle Wirkung aufweisen, die vor allem bei intrazellulären Erregern, wie z.B.
Mycobacterium bovis (BOYSEN u. STORSET 2009), eine wichtige Rolle spielt. Des Weite- ren wurden LL-37 und die α-Defensine HNP 1-3 (human neutrophil peptide 1-3) im Über- stand von kultivierten NK-Zellen nachgewiesen, bei denen es sich um antibakteriell wirksame Proteine handelt (AGERBERTH et al. 2000).
Außerdem sind NK-Zellen wichtige Zytokinproduzenten und helfen bei der Immunmodulati- on von Dendritischen Zellen und T-Lymphozyten (STORSET et al. 2004; SMYTH et al.
2005; BOYSEN et al. 2006). Bei einer Infektion werden NK-Zellen mit als eine der ersten Zellen zum Infektionsort rekrutiert, sind eine wichtige Quelle von IFN-γ und anderen Zytokinen zu Beginn der Immunantwort und beeinflussen dadurch die Tendenz der T- Helferzellantwort (Th1 versus Th2) der erworbenen Immunität (RAULET 2004). Des Weite- ren können NK-Zellen selber eine lang anhaltende haptenspezifische Immunantwort in Abwe- senheit von T- und B-Zellen vermitteln, sodass ihre Zugehörigkeit zur angeborenen Immuni- tät überdacht werden sollte (O'LEARY et al. 2006). Eine generelle Übersicht über die Einbin- dung der NK-Zelle in das „Netzwerk Immunsystem“ zeigt Abbildung 1.
2.4 Antimikrobielle Peptide
Bei den AMP handelt es sich generell um Peptide mit unter 100 Aminosäureresten, die durch relativ unspezifische Mechanismen wirken und letztendlich zur Membranlyse von Zellen füh- ren. Des Weiteren sind AMP in der Lage Endotoxine zu neutralisieren (GIULIANI et al.
2007). Die AMP werden anhand ihrer Sekundärstruktur klassifiziert: α-Helix, β-Faltblatt,
23
„loop“ und „extended“, wobei die ersten beiden am häufigsten vorkommen (HANCOCK u.
LEHRER 1998; EPAND u. VOGEL 1999; VAN 'T HOF et al. 2001).
AMP haben eine Brückenfunktion zwischen der angeborenen und erworbenen Immunität, da sie antimikrobiell und chemotaktisch wirken und zudem die Freisetzung verschiedener Zyto- kine und Chemokine veranlassen und so einen wichtigen immunmodulatorischen Effekt ha- ben. Außerdem sind sie an der Wundheilung beteiligt (GALLO et al. 1994; GIULIANI et al.
2007; LAI u. GALLO 2009). Während einer Infektion wird ihre Expression stark gesteigert;
dies erfolgt durch Aktivierung von Pattern-Recognition Receptors (PRR), wie Toll-like Re- zeptoren (TLR), oder aufgrund von proinflammatorischen Zytokinen (ROSSI u. ZLOTNIK 2000; LUSTER 2002; DI NARDO et al. 2007; MORIOKA et al. 2008; LAI u. GALLO 2009).
AMP, ob natürlich vorkommend oder synthetisch hergestellt, sind seit einiger Zeit von gro- ßem Interesse wegen den immer öfter auftretenden multidrug resistant (MDR) Pathogenen (GIULIANI et al. 2007). Eine antimikrobielle Aktivität mit minimalen Hemmstoffkonzentra- tionen (MHK) im mikromolaren Bereich (HANCOCK u. LEHRER 1998) wurde gegenüber verschiedenen Pilzen (Candida albicans, Cryptococcus neoformans), grampositiven (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes) und gramnegativen (Pseudomonas aeruginosa, E. coli) Bakterien (A. M. COLE et al. 2001; TANG et al. 2002; HIESHIMA et al.
2003; YANG et al. 2003) sowie Protozoen (ALEY et al. 1994) nachgewiesen. Um eine Schä- digung der körpereigenen Zellen zu verhindern, liegen die AMP als Propeptide in intrazellulä- ren Granula gespeichert vor und werden erst durch proteolytische Spaltung nach Degranulati- on biologisch aktiv (GULLBERG et al. 1999; LAI u. GALLO 2009). Hinzu kommt, dass AMP durch Proteasen schnell wieder abgebaut werden.
Auf welche Weise die AMP zwischen der Membran von Bakterien und der von wirtseigenen Zellen unterscheiden, ist noch nicht ganz geklärt. Eine Selektivität aufgrund der Membranzusammensetzung oder deren Polarität werden diskutiert (LAI u. GALLO 2009).
Die eukaryotische Membran ist aus neutralen Phospholipiden aufgebaut, sodass sie im Ge- gensatz zur negativ geladenen Bakterienmembran keine eigene Ladung aufweist
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(NAKAJIMA et al. 1987; MATSUZAKI 1999; ZASLOFF 2002; YEAMAN u. YOUNT 2003). Dazu kommt, dass das Cholesterol der eukaryotischen Membran die Aktivität der AMP reduzieren kann, indem es die Lipiddoppelschicht stabilisiert oder direkt mit einigen AMP interagiert und sie dadurch neutralisiert (MATSUZAKI 1999; SORENSEN et al. 1999).
Bei sehr hohen AMP-Konzentrationen in vitro werden aber auch eukaryotische Zellen, wie T- Lymphozyten (JOHANSSON et al. 1998), zerstört, wodurch einige AMP auch in der Lage scheinen, Tumorzellen abzutöten (A. M. COLE et al. 2001; LEUSCHNER u. HANSEL 2004;
SUN et al. 2006; BULLARD et al. 2008; COFFELT u. SCANDURRO 2008).
2.4.1 Antimikrobielle Chemokine
Antimikrobielle Chemokine (AMC) sind eine Gruppe innerhalb der AMP und gehören zu den β-Faltblatt Proteinen, die 2-3 Disulfidbrücken beinhalten und deren Wirksamkeit abhängig ist von der sie umgebenden Salzkonzentration. AMC haben eine positive Nettoladung, dies be- deutet aber nicht, dass alle positiv geladenen Chemokine antimikrobielle Eigenschaften auf- weisen (YUNG u. MURPHY 2012).
Chemokine sind chemotaktische Zytokine, die wichtige Regulatoren bei verschiedenen physi- ologischen und pathologischen Prozessen, wie der Organogenese, Angiogenese, Entzündung, Immunität und vor allem bei der Zellbewegung, darstellen (ROLLINS 1997; BAGGIOLINI 1998). Die meisten Chemokine sind 8–14 kDa groß, kationisch bei neutralem pH-Wert und weisen untereinander eine 20 % - 70 % Homologie ihrer Aminosäuresequenz auf. Die Benen- nung der Chemokine erfolgt nach den Cystein-Motiven am N-Terminus, wodurch vier Fami- lien entstehen: CXCL, CCL, CX3CL und XCL. Dabei steht ein C für ein Cystein, X für jeden anderen Aminosäurerest und das L für Ligand. Die Effekte der Chemokine werden durch ihre zugehörigen Rezeptoren vermittelt, die ebenfalls in vier Gruppen eingeteilt werden (CXCR, CCR, CX3CR und XCR) (BAGGIOLINI et al. 1997; ROLLINS 1997; BAGGIOLINI 1998;
P. M. MURPHY et al. 2000; ZLOTNIK u. YOSHIE 2000).
Unter den Chemokinen gibt es einige, die für die Rekrutierung spezieller Immunzellen zu- ständig sind, so werden z.B. Neutrophile durch CXCL1, CXCL2 und CXCL8 angelockt und Monozyten durch CCL2, CCL7 und CCL13. Th1-Zellen reagieren auf CXCL9, CXCL10 und CXCL11, wohingegen Th2-Zellen durch CCL17 und CCL22 rekrutiert werden (OLSON u.
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LEY 2002; SINGH et al. 2008). Für die meisten AMC sind mikromolare Konzentrationen notwendig, um eine antimikrobielle Wirkung zu erzielen (KRIJGSVELD et al. 2000; A. M.
COLE et al. 2001; YANG et al. 2003; MAERKI et al. 2009; YUNG et al. 2011), während die Konzentration zur Leukozytenrekrutierung in vitro 1000-fach geringer ist (BERKHOUT et al.
1997; SIVEKE u. HAMANN 1998). Die im gesunden Organismus auftretenden Chemokinkonzentrationen liegen zumeist im piko- bis nanomolaren Bereich (BRANDT et al.
2000).
2.4.2 CXCL9, CXCL10 und CXCL11
Die in dieser Arbeit verwendeten rekombinanten bovinen Chemokine gehören zu den IFN-γ- induzierten Chemokinen. Für alle drei Chemokine gibt es andere Namen, die das Molekül näher charakterisieren. CXCL9 wird auch als MIG (Monocyte induced by Gamma-Interferon) bezeichnet, wogegen es sich bei CXCL10 um ein 10 kDa großes Protein handelt, das deshalb IP-10 (Interferon gamma-induced protein 10) genannt wird. Ein anderer Name für CXCL11 ist I-TAC (Interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant), da es sich um einen T-Zell- Lockstoff handelt. Allen dreien fehlt das Tripeptid-Motiv Glu-Leu-Arg (ELR), weshalb sie auch als ELR-negative Chemokine bezeichnet werden (LUSTER et al. 1985; WRIGHT u.
FARBER 1991; K. E. COLE et al. 1998). CXCL9, CXCL10 und CXCL11 sind sich sehr ähn- lich. Sie sind amphipathisch und haben eine gleiche Ladungsverteilung, wobei der C- Terminus aufgrund der zahlreichen kationischen Aminosäuren eine stark positive Ladung aufweist. Dadurch ergibt sich für alle drei eine positive Nettoladung: CXCL9 (+18), CXCL10 (+9) und CXCL11 (+8) (A. M. COLE et al. 2001). CXCL9, CXCL10 und CXCL11 werden vor allem von Monozyten, Makrophagen, Fibroblasten und epithelialen Zellen nach Stimula- tion mit proinflammatorischen Zytokinen, besonders durch IFN-γ, produziert und sekretiert (LUSTER u. RAVETCH 1987; FARBER 1997). Jedes der drei Chemokine vermittelt seine Signale durch den gleichen G-Protein-gekoppelten Rezeptor CXCR3 und sorgt primär für eine Rekrutierung von aktivierten CD4- und CD8-positiven T-Zellen sowie NK-Zellen (MACKAY 2001; MOHAN et al. 2005). Die bei Rindern gemessene Konzentration von CXCL9 beträgt im Serum 0,012 nM (CHUANG et al. 2005) und in der Milch 0,01 nM, wäh- rend die von CXCL10 im Serum bei 0,009 nM und in der Milch bei 0,06 nM liegt (TAKAHATA et al. 2003). Ähnlich hoch ist die Serumkonzentration von CXCL11 mit 0,005 nM (NARBUTT et al. 2009). Während einer Entzündung steigt die Produktion dieser
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Chemokine stark an, sodass Konzentrationen im nanomolaren Bereich gemessen werden kön- nen, dagegen liegen die Chemokine im gesunden Gewebe oft unterhalb der Detektionsgrenze (EGESTEN et al. 2007).
Die ERL-negativen Chemokine weisen eine antimikrobielle Aktivität gegenüber verschiede- nen Pathogenen auf (LIAO et al. 1995). Da in dieser Arbeit die Untersuchungen mit E. coli erfolgten, wird nur die jeweilige MHK für dieses Bakterium angegeben. Die MHK von CXCL9 liegt bei 0,5 µg/ml, bei 4,4 µg/ml für CXCL10 und bei 6,5 µg/ml für CXCL11 (A. M.
COLE et al. 2001).
AMC sind salzsensitiv und werden bereits durch Konzentrationen ab 50 mM Natriumchlorid (NaCl) in ihrer Wirkung gehemmt (A. M. COLE et al. 2001; MAISETTA et al. 2008). Die Elektrolytkonzentration von Na beträgt 140 mM und von Cl 101 mM (VON ENGELHARD 2010) im Serum und in der Milch sind 5-8 mM Na und 9-13 mM Cl enthalten (KOO u. GUP- TA 1982; WACK et al. 1997). Somit sind die Salzkonzentrationen im Serum viel zu hoch, um eine antimikrobielle Wirkung zu vermitteln. Es wird vermutet, dass in vivo Pathogene trotz der erhöhten Salzkonzentration abgetötet werden, weil die antimikrobiellen Substanzen selber in sehr hohen lokalen Konzentrationen vorliegen. Weiterhin ist die Salzsensitivität zumindest für CXCL9, CXCL10 und CXCL11 abhängig vom Bakterium, da eine Wachstumshemmung u.a. von Streptococcus pyogenes sogar bei 150 mM NaCl vorhanden und auch die Wirkung gegenüber Bacillus anthracis unabhängig von der Ionenkonzentration ist (EGESTEN et al.
2007; CRAWFORD et al. 2010; YUNG u. MURPHY 2012).
2.4.3 Defensine, Cathelicidine und Laktoferrin
Defensine und Cathelicidine bilden die Hauptfamilien der AMP und weisen deren charakte- ristische Merkmale auf. Sie sind klein, amphipathisch, salzsensitiv, im nanomolaren Bereich chemotaktisch, positiv geladen und Teil der angeborenen Immunabwehr. Ihre Wirkungsme- chanismen entsprechen den unter 2.4.4 beschriebenen. Defensine und Cathelicidine sind ge- gen verschiedene gramnegative und -positive Bakterien, behüllte Viren und Pilze wirksam, beeinflussen die Immunantwort des Körpers und sind zudem an der Wundheilung und Angiogenese beteiligt (TERRITO et al. 1989; ZANETTI et al. 1995; YANG et al. 2000;
KOSCIUCZUK et al. 2012).
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Die ersten argininreichen AMP wurden in den 1960-er Jahren isoliert und Defensine wegen ihrer Schutzwirkung für den Organismus genannt. Sie kommen in allen Zellen und Geweben vor, die an der Abwehr beteiligt sind, und weisen z.T. millimolare Konzentrationen auf (> 10 mg/ml in leukozytärer Granula) (GANZ et al. 1985; GANZ 1987). Die durchschnittli- che Konzentration auf Epithelzellen liegt zwischen 10-100 µg/ml (HARDER et al. 1997).
Defensine besitzen eine charakteristische β-Faltblatt Struktur, drei Disulfidbrücken (GANZ et al. 1985; SELSTED et al. 1985) und werden in drei Untergruppen α-, β- und θ-Defensine ein- geteilt (TANG et al. 1999). α-Defensine bestehen aus 30 Aminosäuren und werden als Pro- peptide in primären und in geringem Maße in sekundären Granula neutrophiler Granulozyten gespeichert. Deshalb werden sie auch als HNP1-4 bezeichnet, wobei HNP1 auch von NK- und T-Zellen exprimiert wird (GANZ et al. 1985; DAHER et al. 1988; WILDE et al. 1989).
Bovine Neutrophile und Epithelzellen weisen nur β-Defensine auf, wohingegen humane Epi- thelzellen α- und β-Defensine exprimieren (GANZ et al. 1985; DIAMOND et al. 1991;
HARDER et al. 1997; TARVER et al. 1998). Die Synthese und Freisetzung der Defensine ist durch mikrobielle Signale (Lipopolysaccharid (LPS)) und Zytokine (Interleukin 1 (IL-1), Tumornekrosefaktor α (TNF-α), granulocyte-colonoy stimulating factor (G-CFS)) reguliert (COWLAND u. BORREGAARD 1999).
Das erste Cathelicidin (Cecropin) wurde 1980 im Gewebe von Schmetterlingen (Hyalophora cecropia) nachgewiesen (HULTMARK et al. 1980). Die Cathelicidine wurden nach einer gemeinsamen Proregion am N-Terminus, der Cathelin Domäne, die eine starke Homologie zum Cathepsin L Inhibitor aufweist, benannt. Cathelicidine wurden zuerst in myeloiden Zel- len nachgewiesen und werden deshalb auch als myeloide antimikrobielle Peptide bezeichnet.
Die antimikrobielle Domäne liegt am C-Terminus und ist Inter- und Intra-Spezies hoch di- vers. Cathelicidine werden als Prepropeptide in den Granula von Neutrophilen und Makro- phagen gespeichert und ebenfalls von Epithelzellen exprimiert (BOMAN 1995; ZANETTI et al. 1995; BALS u. WILSON 2003; TREFFERS et al. 2005; ZANETTI 2005).
Bei Menschen wird nur ein Cathelicidin (LL-37) exprimiert, welches auch als hCAP-18 be- zeichnet wird (ZHAO et al. 2001). Es besteht aus 37 Aminosäuren, hat ein Molekulargewicht
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von 18 kDa (GUDMUNDSSON et al. 1995) und wurde in verschiedenen Geweben (Haut, Gastrointestinaltrakt, Lunge) und Zellen (Neutrophile, Monozyten, Makrophagen, B-, T- und NK-Zellen) nachgewiesen (FROHM et al. 1997; BALS et al. 1998; ZASLOFF 2007).
Beim Rind sind sieben verschiedene Cathelicidine (BMAP27, 28 und 34, Bac5 und 7, Indolicidin und Bactenecin-1) beschrieben. Bac5 und 7 bestehen aus 43 bzw. 60 Aminosäu- ren, weisen einen prolinreichen Abschnitt auf (GENNARO et al. 1989) und sind vor allem gegen gramnegative Bakterien wirksam (TOMASINSIG et al. 2010). Die bovinen myeloiden antimikrobiellen Peptide (BMAP) 27 und 28 bestehen aus 27 bzw. 28 Aminosäuren, töten Bakterien und Pilze und induzieren bereits in geringen Konzentrationen die Apoptose bei Tumorzellen (SKERLAVAJ et al. 1996). Zudem sind sie reichhaltig in der Milch von mastitiskranken Tieren vorhanden, aber nur in geringer Menge bei gesunden Kühen (TOMASINSIG et al. 2010). Indolicidin ist ein 13 aminosäurelanges tryptophanreiches Pep- tid, das in Neutrophilen vorkommt und wirksam ist gegen Pilze (Candida albicans, Cryptococcus neoformans) sowie Staphylococcus aureus und E. coli (SELSTED et al. 1992;
BENINCASA et al. 2006). Zudem hemmt Indolicidin die Sekretion von TNF-α aus Makro- phagen und induziert die IL-8-Produktion (BOWDISH et al. 2005).
Laktoferrin ist im Gegensatz zu den Defensinen und Cathelicidinen ein 80 kDa schweres Glykoprotein mit 703 Aminosäuren aus der Transferrin-Familie, dessen Glykosylierungsgrad die Resistenz gegen Proteasen und niedrige pH-Werte bestimmt. Es wurde 1939 von Sorensen und Sorensen aus boviner Milch isoliert und später ebenfalls aus Sekreten von exokrinen Drü- sen, Epithelzellen des Reproduktions- und Gastrointestinaltraktes und den Granula von Neu- trophilen. Laktoferrin ist am Eisenmetabolismus, der Zellproliferation und -differenzierung beteiligt und zeigt zudem antibakterielle, -virale und -parasitische Aktivität (METZ- BOUTIGUE et al. 1984; IYER u. LONNERDAL 1993; WARD et al. 1999; ADLEROVA et al. 2008). Die Eigenschaft Eisen, auch bei niedrigem pH, wie er an Entzündungsstellen durch die metabolische Aktivität von Bakterien herrscht (VALENTI u. ANTONINI 2005), zu bin- den, ist ausschlaggebend für die antimikrobielle Wirkung. Dadurch steht das essentielle Eisen den Bakterien nicht mehr zur Verfügung und vermittelt auf diesem Weg die bakteriostatische Wirkung (ARNOLD et al. 1980; BROCK 1980; LEGRAND et al. 2005).
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Die Regulation der Laktoferrinsynthese ist abhängig von den produzierenden Zellen, so wird die der Euterepithelzelle durch Prolaktin kontrolliert (GREEN u. PASTEWKA 1978), wohin- gegen exokrine Drüsen Laktoferrin kontinuierlich sekretieren. In Neutrophilen wird Laktoferrin nur während der Entwicklung im Knochenmark gebildet und ist vor allem in der sekundären Granula, aber in geringem Maße ebenfalls in tertiärer Granula gespeichert (MASSON et al. 1969; BAGGIOLINI et al. 1970; SAITO et al. 1993). Die gemessene Menge an Laktoferrin im Blut gesunder Probanden schwankt stark zwischen verschiedenen Veröf- fentlichungen (0,02-1,52 μg/ml) (ADLEROVA et al. 2008) und steigt im Verlauf einer Ent- zündung stark an (BIRGENS 1985). Weitaus größere Schwankungsbreiten weisen die ermit- telten Werte in der Milch gesunder und subklinisch erkrankter Tiere auf (1,15 μg/ml (HAGIWARA et al. 2003) bis 485,63 μg/ml (CHENG et al. 2008)). Die Konzentration wäh- rend der Milchdrüseninvolution steigt auf über 100 mg/ml Laktoferrin an (WELTY et al.
1976).
Aufgrund der eisenbindenden Wirkung sowie der Interaktion mit Molekülen und Zielzellen durch spezifische Rezeptoren kann Laktoferrin die Immunreaktion beeinflussen. Durch die Aktivierung von Immunzellen wird die Immunantwort verstärkt, wohingegen eine Bindung an LPS oder Rezeptoren auf Pathogenen diese mindert, da weniger proinflammatorische Zy- tokine oder ROS ausgeschüttet werden, für deren Produktion Eisen essentiell ist (LEGRAND et al. 2005; WARD et al. 2005). Durch die einzigartige antibakterielle, immunmodulatorische und sogar antineoplatische Wirkung hat Laktoferrin großes Potential für den therapeutischen Einsatz (ADLEROVA et al. 2008).
2.4.4 Wirkungsweise antimikrobieller Proteine
Die Art, wie AMP wirken, kann in zwei Gruppen eingeteilt werden: Die membranzerstörende (barrel stave, toroidal, carpet und micellar aggregate model) und die nicht membranzerstörende (intrazelluläre Zielstrukturen) Wirkung (POWERS u. HANCOCK 2003). Der molekulare Mechanismus, der schließlich zur Membranpermeation und damit zum Absterben des Mikroorganismus führt, ist abhängig von der Aminosäuresequenz des AMP, den Membranlipiden und der Peptidkonzentration (GIULIANI et al. 2007).
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Die initiale Assoziation der AMP mit der Bakterienmembran geschieht durch elektrostatische Wechselwirkung der kationischen Peptide mit den anionischen Lipopolysacchariden der gramnegativen Bakterien (GANZ u. LEHRER 1998; LEHRER u. GANZ 2002; ZASLOFF 2002; TOKE 2005). Die LPS-Moleküle werden durch die Interaktion mit divalenten Katio- nen, wie Magnesium und Kalzium, stabilisiert. Werden diese entfernt oder durch kationische AMP ersetzt, wird die Membranstruktur aufgelockert, wodurch die AMP die äußere Membran passieren können. Daraufhin assoziieren AMP mit der Zytoplasmamembran, fügen sich in sie ein und bilden dort mizellenartige Aggregate, die zur allgemeinen Zerstörung der Membran führt. In einer nicht membranzerstörenden Methode passieren die AMP die Membran und binden an zelluläre Strukturen, wie DNA und RNA, oder hemmen intrazelluläre Vorgänge (HANCOCK 1997; HANCOCK u. CHAPPLE 1999; WU et al. 1999; BROGDEN 2005).
Abbildung 2: Mögliche Wirkmechanismen von antimikrobiellen Peptiden bei gramnegativen Bakterien.
Die antimikrobiellen Peptide (AMP) interagieren mit der negativ geladenen Bakterienoberfläche, in- dem sie an die divalenten Bindungsstellen des LPS andocken. Für die membranolytische Wirkung werden verschiedene Mechanismen diskutiert, darunter das „carpet“ (A), „barrelstave“ (B),
„wormhole“ oder „toroidal“ (C), und „aggregate channel“ (D) Model. Zusammenfassend kann man die Effekte von A bis D so beschreiben, dass Monomere sich von der Membran lösen, in das Zyto- plasma gelangen und dort an zelluläre Strukturen, wie DNA und RNA, binden oder zelluläre Prozesse, wie die Proteinsynthese oder Proteinfaltung, hemmen. Nach GIULIANI et al. (2007).
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Das „carpet“ Model beinhaltet eine initiale Peptidbindung an der Membranoberfläche, wo- durch es zur Formation von Mizellen kommt, was zum Auslaufen von zellulären Bestandtei- len führt. Es wird allgemein angenommen, dass die antimikrobielle Wirkung nicht wie bei Detergenzien vermittelt wird (SANDERSON 2005).
Im „toroidal-hole“ Model ist die Formation der Pore und die Translokation der Peptide von einem kritischen Peptid-Lipid-Verhältnis abhängig. So würde ein weiterer Anstieg der Peptidmenge die Stabilität der Pore aufgrund der erhöhten elektrostatischen Abstoßung (Cou- lomb-Energie) zwischen den positiv geladenen Molekülen reduzieren (BROGDEN 2005).
Das „barrel-stave“ Model besagt, dass sich eine geringe Menge an Peptiden perpendikular in die Membran einlagert, aggregiert und so die Stützen des tonnenartigen Ringes in der Memb- ran bildet, der zu einer transmembranen Pore oder einem Tunnel mit zylindrischer Struktur wird. So liegen die hydrophoben Peptidregionen außen, während die hydrophilen Anteile das Innere der Pore bilden (BREUKINK u. DE KRUIJFF 1999; LAI u. GALLO 2009). Die Pore ist eine dynamische Struktur, die durch kontinuierliche Rekrutierung und dem gleichzeitigen Verlust von Peptidmonomeren in verschiedenen Porengrößen resultiert (GIULIANI et al.
2007).
Unabhängig vom Mechanismus erfolgt die Abtötung der Pathogene durch die Chemokine sehr schnell (HIESHIMA et al. 2003; LINGE et al. 2008). Es ist unklar, ob eine Genaktivie- rung oder Signaltransduktion für die antimikrobielle Aktivität benötigt wird. Anders als kon- ventionelle Antibiotika, die am besten auf sich teilende Organismen wirken, sind AMP in der Lage, dieses auch bei nicht teilenden Bakterien zu tun (WIESNER u. VILCINSKAS 2010).
2.4.5 Nachweisverfahren antimikrobieller Wirkung
Zum Nachweis wachstumshemmender Effekte antimikrobieller Proteine in vitro sind in der Literatur verschiedene Methoden beschrieben. Dabei wird zwischen reinen Nachweis- (Gel Overlay Assay) und Quantifizierungsverfahren (Radial Diffusion Assay, Colony Forming Assay, Mikrodilution) unterschieden (KRIJGSVELD et al. 2000; A. M. COLE et al. 2001;
YANG et al. 2003). Die meisten Verfahren benutzen dabei zwei unterschiedliche Agar- bzw.
Mediumzusammensetzungen, nämlich nährstoffarm und -reich. Durch den geringen Nah-
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rungsgehalt des ersten Agars, der nur 6-8 Bakterienteilungen erlaubt, können die antimikro- biellen Substanzen diffundieren, ohne vom Testkeim überwachsen zu werden, bevor ein nähr- stoffreicher Agar, zumeist nach 3 h, darüber gegeben wird. Während der sich anschließenden 18-20-stündigen Inkubation bei 37 °C bilden sich Kolonien. Die Unterschiede der Assays bestehen in der Art, wie die zu testenden Substanzen appliziert werden, und der Methoden- auswertung.
Beim Radial Diffusion Assay (RDA) wird eine bestimmte AMP-Menge in gestanzte, 3 mm große Löcher pipettiert. Von dort diffundieren die Proteine kreisförmig in den Agar, sodass der Durchmesser der bakterienfreien Zone gemessen und daraus die Wirksamkeit der Chemo- kine berechnet werden kann. Der Test ist hochsensitiv und es werden nur geringe Mengen AMP benötigt (STEINBERG u. LEHRER 1997; A. M. COLE et al. 2001; YUNG u.
MURPHY 2012).
Beim Colony Forming Assay (CFA) werden die Mikroorganismen mit dem antimikrobiellen Agens schüttelnd inkubiert und anschließend in unterschiedlichen Verdünnungen auf Agarplatten ausgespatelt, sodass am nächsten Tag die sich gebildeten Kolonien gezählt wer- den können (YANG et al. 2003; EGESTEN et al. 2007; CHAN et al. 2008; YUNG u.
MURPHY 2012).
Für den Gel Overlay Assay (GOA) wird zunächst die Testsubstanz mittels Essigsäure- Harnstoff- (AU-) oder Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und das Gel anschließend auf den Agar gelegt, sodass die darin enthaltenen Prote- ine in den Agar diffundieren können. Nach Entfernung des Gels wird nährstoffreicher Agar darüber geschichtet und nach Inkubation bei 37 °C zeigen bakterienfreie Stellen die Lage der AMP an (KRIJGSVELD et al. 2000; YUNG u. MURPHY 2012).
Die Mikrodilution hingegen ist eine Methode, bei der nur ein Kulturmedium eingesetzt wird.
Dabei wird eine definierte Pathogenmenge im Medium suspendiert und in 96-Well-Platten pipettiert. Zu den einzelnen Ansätzen werden steigende Konzentrationen der antimikrobiellen Substanz gegeben. Nach einer 16-20-stündigen Inkubation bei 37 °C werden die Wells pho-
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tometrisch auf den Grad der Trübung oder visuell auf Knopfbildung untersucht. Die MHK entspricht dem Well mit der geringsten AMP-Konzentration, in dem kein mikrobielles Wachstum stattgefunden hat. Diese Methode bietet gegenüber dem RDA die Vorteile, dass eine größere Probenanzahl getestet werden kann und das System automatisierbar ist, aber es wird rund 10-mal mehr Testsubstanz benötigt (STEINBERG u. LEHRER 1997;
GIACOMETTI et al. 2000a; CLSI 2006).
2.4.6 Antimikrobielle Proteine im Vergleich zu konventionellen Antibiotika Anders als bei konventionellen Antibiotika kommen Resistenzen gegenüber AMP relativ sel- ten vor, da tiefgreifende Veränderungen von Membranstrukturen notwendig wären, um eine Resistenz zu vermitteln, während die funktionelle und strukturelle Integrität der Zellwand und Membran erhalten bleiben soll (ZASLOFF 2002; LEUSCHNER u. HANSEL 2004). Deshalb haben Pathogene andere Resistenzmechanismen entwickelt, wie die Produktion und Sekretion von Proteasen, welche die AMP abbauen. Daneben gibt es Bakterien, die Plasmid-DNA aus- schleusen, um die Expression von AMP in epithelialen Zellen oder Monozyten zu verhindern (ISLAM et al. 2001). Die AMP wiederum reagieren darauf mit sehr hohen lokalen Konzentra- tionen in vivo (DIAMOND et al. 2000; GHOSH et al. 2002) oder durch Expression einer Vielzahl unterschiedlicher AMP (MENARD et al. 2008).
Die MHK und die minimale bakterizide Konzentration (MBK), unter der die geringste Kon- zentration, bei der eine 99,9 %-ige Reduktion der Kolonien auftrat, verstanden wird, liegen bei AMP sehr nahe beieinander und sind ein Zeichen dafür, dass die bakterizide Eigenschaft der Peptide im Vordergrund steht (GIULIANI et al. 2007).
2.5 Polymyxine
Die Positivkontrolle, die zusammen mit den Testsubstanzen in den antimikrobiellen Assays eingesetzt werden sollte, musste die gleichen chemischen Eigenschaften aufweisen, wie eine ähnliche Nettoladung und einen membrangebundenen Wirkmechanismus. Diesen Kriterien entsprechen die Polymyxine, die aus diesem Grund in den Versuchen verwendet wurden.
2.5.1 Polypeptidantibiotika
Die beiden Polymyxine – Colistin und Polymyxin B – gehören zur Gruppe der Polypeptidan- tibiotika. Es sind fünf verschiedene Polymyxine (A-E) beschrieben, doch nur Polymyxin B
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und E (Colistin) werden zur therapeutischen Behandlung eingesetzt. Polymyxin B wurde im Jahre 1947 aus Bacillus polymyxa isoliert (STORM et al. 1977), während Polymyxin E erst drei Jahre später vom namensgebenden Bacillus colistinus isoliert wurde (TAYLOR u. AL- LISON 1962).
Bei Polypeptidantibiotika handelt es sich um zyklische Dekapeptide, die endständig positiv geladene Aminosäuren und zudem einen ungeladenen Fettsäureschwanz aufweisen, wodurch die Moleküle amphotere Eigenschaften haben und sowohl in wässrigem Medium (z.B. Blut) als auch in Lipidmembranen löslich sind (EVANS et al. 1999). Colistin und Polymyxin B haben eine molekulare Masse um 1200 Da (STORM et al. 1977) und unterscheiden sich un- tereinander nur in einer Aminosäure; bei Colistin befindet sich an Position 6 ein D-Leucin und bei Polymyxin B ein Phenylalanin (FALAGAS u. KASIAKOU 2005).
2.5.2 Wirkungsweise der Polymyxine
Beide Polymyxine haben den gleichen Wirkmechanismus und weisen eine Kreuzresistenz auf (GALES et al. 2011). Eine natürliche Resistenz besteht gegenüber grampositiven Bakterien, gramnegativen aeroben Kokken, Mykoplasmen, Anaerobiern (FALAGAS u. KASIAKOU 2005) sowie gegenüber allen Pilzen und Parasiten (STORM et al. 1977). Der Wirkmechanis- mus wird initial durch die Bindung der Polymyxine an die Bakterienmembran aufgrund elekt- rostatischer Interaktionen der positiv geladenen Antibiotika mit der negativ geladenen Ober- fläche des Bakteriums vermittelt. Weiterhin werden die zweifach positiv geladenen Calcium- und Magnesium-Ionen, welche die negativ geladenen LPS-Moleküle untereinander stabilisie- ren, durch die Polymyxine verdrängt, sodass es zu einer Auflockerung der Membran kommt, die zu einer erhöhten Permeabilität und letztlich zum Absterben des Bakteriums führt (NEWTON 1956).
Neben der antibakteriellen Wirkung weisen Polymyxine durch ihre Bindung an LPS auch eine antiendotoxine Wirkung auf. Inwieweit dies in vivo eine Rolle spielt, insbesondere bei der Prävention des Endotoxin-induzierten Schocks, der durch die massive Freisetzung von Zytokinen ausgelöst wird, ist unklar, da das Endotoxin im Plasma ebenfalls an LPS- Bindungsproteine bindet und dieser Komplex wiederum CD14-vermittelt inaktiviert wird (GOUGH et al. 1996).
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2.5.3 Therapeutischer Einsatz von Polymyxinen
Polymyxine weisen eine starke systemische Toxizität nach parenteraler Verabreichung auf, die sich in neuro- und nephrotoxischen Symptomen und Muskelrelaxierung äußert, sodass Polymyxine wenn möglich nur lokal oder oral angewendet werden sollten, da sie kaum resor- biert werden. Der Einsatz von Polymyxinen bei laktierenden Tieren ist verboten und ebenso die Anwendung von Polymyxin B bei lebensmittelliefernden Tieren. Colistin hingegen darf bei diesen eingesetzt werden und hat bei Rindern eine Wartezeit von 2 (oral) oder 20 Tagen (intramuskulär) (LÖSCHER et al. 2014).
Resistente Bakterien treten nur selten auf, da es sich um eine chromosomale Resistenzentste- hung handelt (LÖSCHER et al. 2014). Dennoch häuften sich Berichte von colistinresistenten E. coli in den letzten Jahren, sodass die Resistenzsituation beobachtet werden sollte, wenn der Einsatz von Polymyxinen aufgrund von MDR-Erregern zunehmen sollte (BOYEN et al.
2010). Das European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) hat den klinischen Breakpoint für Colistin-Sulfat bei E. coli auf ≤ 2 mg/l für sensible Stämme und
> 2 mg/l bei resistenten Stämmen festgelegt (EUCAST 2015).
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3 Methoden
3.1 Blutentnahme bei den Versuchstieren
Die Blutproben wurden von weiblichen, klinisch gesunden Rindern der Rasse Deutsche Schwarzbunte genommen, die in der Rinderklinik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Han- nover standen (12.2.7). Die Gruppe, deren Zusammensetzung sich mit der Zeit änderte, be- stand aus zehn Tieren, die zwischen 2000 und 2012 geboren wurden. Die Blutentnahme er- folgte unter sterilen Bedingungen durch Punktion der Vena jugularis, die mit Hilfe einer Staukette nach Witte (12.2.1) angestaut wurde, in Natrium-Heparin-Röhrchen (12.2.1) mittels Vacutainersystem (12.2.1).
3.2 Gewinnung von Gesamtleukozyten
Die entnommenen Blutröhrchen wurden abgeflammt und jeweils zwei in ein 50 ml-Falcon (12.2.2) überführt, mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (12.2.8.1) auf 50 ml aufgefüllt und bei 1000 x g für 10 min zentrifugiert. Alle Zentrifugationsschritte wurden in einer auf 10 °C gekühlten Zentrifuge durchgeführt. Anschließend wurde das PBS zusammen mit dem Plasma mittels einer 10 ml-Pipette (12.2.2) entfernt. Das Pellet, bestehend aus den Erythrozy- ten und Leukozyten, wurde einer hypotonen Lyse unterzogen: Dazu wurden 20 ml Aqua dest.
zu den resuspendierten Zellen gegeben, diese für 30 Sekunden geschwenkt und mit 20 ml 2-fach PBS (12.2.8.1) isotonisch ausgeglichen. Das Röhrchen wurde bei 500 x g für 10 min zentrifugiert, der Überstand abgegossen und das Pellet resuspendiert. Gegebenenfalls wurde bei noch vorhandenen Erythrozyten eine zweite hypotone Lyse durchgeführt. Die anschlie- ßende Zentrifugation erfolgte bei 250 x g für 10 min. Danach wurde der Überstand verworfen, das Pellet resuspendiert und noch einmal mit 50 ml PBS gewaschen, bevor das Röhrchen für 10 min bei 120 x g zentrifugiert wurde. Abschließend wurde der Überstand abgegossen, das Zellpellet resuspendiert und je nach Größe des Zellpellets in 1-10 ml MIF-Puffer (12.2.8.2) aufgenommen.
3.3 Gewinnung mononukleärer Zellen
Die gesamte Zellseparation fand in einer auf 10 °C gekühlten Zentrifuge statt. Die Blutröhr- chen wurden, wie unter 3.2 beschrieben, in ein 50 ml-Röhrchen überführt und mit PBS auf 35 ml aufgefüllt. In einem neuen 50 ml-Röhrchen wurde 15 ml Biocoll® (12.2.3) vorgelegt –
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ein Separationsmedium mit einer Dichte von 1,077 g/ml bei 10 °C – und anschließend mit 30 ml des Blut-PBS-Gemisches vorsichtig überschichtet. Die Röhrchen wurden bei 1000 x g für 30 min ohne Bremse zentrifugiert. MNC, die sich in der Interphase zwischen Plasma und Biocoll® befanden, wurden mit einer 10-ml Pipette abgenommen und in ein neues, mit 3 ml PBS befülltes 50 ml-Röhrchen gegeben. Dieses Röhrchen wurde mit PBS auf 50 ml aufgefüllt und mit Bremse bei 500 x g für 10 min zentrifugiert, der Überstand abgegossen und das Zell- pellet resuspendiert. Danach erfolgte eine hypotone Lyse (siehe 3.2). Das Falcon wurde bei 250 x g für 10 min mit Bremse zentrifugiert, dann erneut der Überstand abgegossen und das Zellpellet resuspendiert. Zum Waschen der Zellen wurde das Röhrchen nochmals mit PBS aufgefüllt und bei 120 x g für 10 min zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abge- gossen, das Zellpellet resuspendiert und in I10F- (12.2.8.2) oder 5 ml MACS-Puffer (12.2.8.1) aufgenommen, dem weiteren Vorgehen entsprechend.
3.4 Gewinnung neutrophiler Granulozyten
Zur Separation neutrophiler Granulozyten wurde das Blut, wie unter 3.3 beschrieben, auf Biocoll® geschichtet und bei 1000 x g und 10 °C für 30 min ohne Bremse zentrifugiert. Dann wurden das Plasma, die Interphase und das Biocoll® mit einer 10 ml-Pipette entfernt und das Erythrozyten-Neutrophilen-Pellet resuspendiert. Anschließend erfolgte zweimal hintereinan- der eine hypotone Lyse (siehe 3.2). Nach der ersten Lyse wurde das Röhrchen bei 500 x g für 10 min zentrifugiert, der Überstand abgegossen und das Pellet resuspendiert. Die zweite Zent- rifugation erfolgte bei 250 x g für 10 min. Danach wurde der Überstand verworfen, das Pellet resuspendiert und noch einmal mit 50 ml PBS gewaschen. Das Röhrchen wurde anschließend für 10 min bei 120 x g zentrifugiert, das Zellpellet erneut resuspendiert und je nach Größe des Pellets in 10-50 ml PBS aufgenommen.
3.5 Zellzahlbestimmung
Die Bestimmung der Menge vitaler Zellen erfolgte mithilfe eines Durchflusszytometers, das unter 3.10.5 genauer beschrieben wird.
3.5.1 Zellzahl mononukleärer Zellen für die MACS
Um Zellklumpen zurückzuhalten, wurden die Zellen im 50 ml-Röhrchen, die in 5 ml MACS-Puffer aufgenommen worden waren (3.3), über einen Filter (12.2.2) in ein
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15 ml-Röhrchen (12.2.1) gegeben. Anschließend wurde das 50 ml-Röhrchen noch zweimal mit jeweils 5 ml MACS-Puffer gespült und die Flüssigkeit ebenfalls auf den Filter gegeben.
Von dieser Zellsuspension wurden 50 µl entnommen und zusammen mit 50 µl PBS-PJ40 (12.2.8.1) durchflusszytometrisch gemessen, um die vitale Zellzahl zu bestimmen. In der Zwischenzeit wurde das 15 ml-Röhrchen bei 300 x g für 10 min bei 10 °C zentrifugiert, der Überstand abgegossen und die restliche Flüssigkeit mit einer Pipette abgenommen, bevor das Pellet resuspendiert und in MACS-Puffer aufgenommen wurde.
3.5.2 Zellzahl neutrophiler Granulozyten
Von der Zellsuspension im 50 ml-Röhrchen wurden 50 µl entnommen und mit 50 µl PBS- PJ40 am Durchflusszytometer gemessen. Währenddessen wurde die restliche Zellsuspension bei 300 x g für 10 min bei 10 °C zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Zellpellet resus- pendiert und in HBSS (12.2.3) oder I10F- aufgenommen.
3.6 Magnetische Zellseparation
Die MACS (magnetic activated cell sorting) ist eine Methode zur Selektion einzelner Zellpo- pulationen aus dem Blut. Diese erfolgt durch Markierung der Oberflächenstrukturen bestimm- ter Zellgruppen mit einem oder mehreren Ak und magnetischen Beads. Die markierten Zellen werden auf Separationssäulen pipettiert, die eine eisenhaltige Matrix beinhalten, die nach Einbringen der Säule in ein Magnetfeld dafür sorgt, dass die Zellen, die magnetische Beads gebunden haben, zurückgehalten werden. Um die gebundenen Zellen zu eluieren, wird die Säule aus dem Magnetfeld genommen und die Zellen mit Hilfe eines Stempels aus der Säule gedrückt.
3.6.1 Direkte MACS
Bei einer direkten MACS sind die magnetischen MicroBeads bereits an den Ak gekoppelt.
Bei den in dieser Arbeit eingesetzten Beads handelte es sich um CD14-gekoppelte Beads (12.2.3), die zur Durchführung einer positiven Selektion der Monozyten dienten. Aus diesem Grund konnte direkt nach Bestimmung der MNC-Zellzahl (3.5.1) die berechnete Menge an MicroBeads und MACS-Puffer zum resuspendierten Pellet dazugegeben werden. Eingesetzt wurden 10 µl CD14-Beads und 90 µl MACS-Puffer pro 107 Zellen. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei 4 °C im Dunkeln wurde der Ansatz mit 10 ml MACS-Puffer aufgefüllt und bei
