12.2 Material
12.2.3 Reagenzien
1 kb GeneRulerTM DNA Ladder Fermentas, Schwerte
100 bp Quickload® DNA Ladder New England BioLabs Inc., Frankfurt am Main
2-Mercaptoethanol (2-Hydrocyethyl mercaptani,
β-Mercaptoethanol), C2H6OS Sigma-Aldrich, Steinheim
5x Phusion Green HF Buffer Thermo Scientific, Rockford, Illinois (USA)
6x Orange DNA Loading Dye Thermo Scientific, Rockford, Illinois (USA)
Accutase® Solution Sigma-Aldrich, Steinheim
Agar Agar Carl Roth, Karlsruhe
Agarose NEEO, ROTI®Garose Carl Roth, Karlsruhe
160
Agarose Typ I Sigma-Aldrich, Steinheim
Albumin Fraktion V, bovine, pulv. 98% Carl Roth, Karlsruhe
Ampicillin Sigma-Aldrich, Steinheim
Biocoll® Separatin Solution, Dichte: 1,077 g/ml Biochrom AG, Berlin Biotin-SP-conjugated goat anti-mouse IgG2α Ak Dianova GmbH, Hamburg Bromphenolblau (3’ , 3’ , 5’ , 5’ -Tetrabrom-
phenolsulfophtalin) Carl Roth, Karlsruhe
CXCL 9 Kingfisher Biotech Inc., St. Paul (USA)
CXCL 10 Kingfisher Biotech Inc., St. Paul (USA)
CXCL 11 Kingfisher Biotech Inc., St. Paul (USA)
CD14-MicroBeads MACS Miltenyi Biotec, Bergisch
Glad-bach
Colistin Sulfat Salz Sigma-Aldrich, Steinheim
Coomassie Brilliant Blau G-250 Serva, Heidelberg Deoxynucleotide Triphosphates (dNTPs) Promega, Mannheim Dulbecco’s modified Eagle’s Medium Sigma-Aldrich, Steinheim Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich, Steinheim DTT (Dithiothreitol), 0,1 M Invitrogen, Karlsruhe EDTA (Ethylendiamine-tetraacetic acid) Sigma-Aldrich, Steinheim Ethanol, Rotipuran® ≥99,8 % (C2H60) Carl Roth, Karlsruhe
Essigsäure Carl Roth, Karlsruhe
Fetales Kälberserum (FCS), Virus und Myko-
plasmen getestet Biochrom, Berlin
Formaldehyd 37 %, p.a., ACS, Rotipuran® Carl Roth, Karlsruhe
Gel RedTM Nucleic Acid Gel Stain
10,000 X in water Biotium, Hayward, Californien
Glycin Carl Roth, Karlsruhe
161
Glycerol Sigma-Aldrich, Steinheim
Goat anti-mouse IgG (H+L) RPE Dianova, Hamburg
Goat anti-mouse IgG-HRP Ak Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich, Steinheim
Hind III (Restriktionsenzym aus
Haemophilus influenza) Promega, Mannheim
Ionomycin Sigma-Aldrich, Steinheim
IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid) Invitrogen, Karlsruhe Iscove’s modified Dulbecco’s Medium Sigma-Aldrich, Steinheim
LB-Agar (Lennox) Carl Roth, Karlsruhe
LB-Broth (Lennox) Carl Roth, Karlsruhe
L-Glutamin Biochrom, Berlin
Lipopolysaccharid von Escherichia coli
Serotyp o111:B4 Invivogen, Toulouse (Frankreich)
Low Range Protein Ladder Thermo Scientific, Rockford, Illinois (USA)
Milchpulver Carl Roth, Karlsruhe
Minimal Essential Medium Eagle PAA Laboratories, Pasching (Österreich)
MgCl2, 50 mM Invitrogen, Karlsruhe
Natriumazid Sigma-Aldrich, Steinheim
Natriumcarbonat Carl Roth, Karlsruhe
Natriumchlorid Carl Roth, Karlsruhe
Natriumdesoxycholat Carl Roth, Karlsruhe
Natriumthiosulfat Carl Roth, Karlsruhe
Nicht essentielle Aminosäuren (NEAA) PAA Laboratories , Pasching (Österreich)
Nonidet P-40 Sigma-Aldrich, Steinheim
162
Phusion DNA Polymerase (2 u/µl) Thermo Scientific, Rockford, Illinois (USA)
Penicillin-Streptomycin-Glutamine-Lösung,
100-fach konzentriert Invitrogen, Karlsruhe
Penta-His Antibody QIAGEN GmbH, Hilden
Polymyxin B Sulfat Salz Sigma-Aldrich, Steinheim
Propidium-Jodid (PI) Calbiochem , Bad Soden
Random Primer Invitrogen, Karlsruhe
RLT plus Lysis buffer QIAGEN GmbH, Hilden
RNaseOUT™ Ribonuclease Inhibitor Invitrogen, Karlsruhe Rotiphorese® Gel (37,5:1) Acrylamid Carl Roth, Karlsruhe Salzlösung (1,2 mmol/L NaCl,
0,06 mmol/L MgCl2) Invitrogen, Karlsruhe
Sodiumdodecylsulfat (SDS) BioRad Laboratories GmbH, München
Silbernitrat Carl Roth, Karlsruhe
Streptavidin MicroBeads MACS Miltenyi Biotec, Bergisch Glad-bach
Superscript™ II Reverse Transkriptase Invitrogen, Karlsruhe
T4 DNA Ligase (3 u/µl) Promega, Mannheim
TBE-Puffer, 10-fach, Rotiphorese® Carl Roth, Karlsruhe TEMED (Tetramethylethylendiamin) Sigma-Aldrich, Steinheim
TE-Puffer Invitrogen, Karlsruhe
Tris Carl Roth, Karlsruhe
Tris-HCl Carl Roth, Karlsruhe
Trypsin-EDTA, 10-fach PAA Laboratories, Pasching (Österreich)
Tween 20 Sigma-Aldrich, Steinheim
Urea Sigma-Aldrich, Steinheim
163
Water, DNase-, RNase-free Sigma-Aldrich, Steinheim
XhoI Promega, Mannheim
X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-
beta-D-galactopyranosid) Invitrogen, Karlsruhe 12.2.4 Bovine Antikörper
Spezifität Konjugat Klon Isotyp Firma
CD2 unmarkiert CC42 IgG1 Kingfisher
CD2 FITC CC42 IgG1 AbD Serotec
CD3 unmarkiert MM1A IgG1 Kingfisher
CD4 unmarkiert CACT138A IgG1 Kingfisher
CD8 AlexaFluor647 CC63 IgG2α AbD Serotec
CD14 unmarkiert MM61A IgG1 Kingfisher
CD21 RPE CC51 IgG2b AbD Serotec
CD25 FITC IL-A111 IgG1 AbD Serotec
CD335 unmarkiert AKS1 IgG1 AbD Serotec
CD335 RPE AKS1 IgG1 AbD Serotec
CD335 AlexaFluor488 AKS1 IgG1 AbD Serotec
MHCII unmarkiert TH14B IgG2α Kingfisher
WC1 unmarkiert GB45A IgG1 Kingfisher
12.2.5 Kits
BioRad Dc Protein Assay BioRad Laboratories, München
Champion™ pET Directional TOPO®
Expression Kit Invitrogen, Karlsruhe
PureLink™ Quick Plasmid Miniprep Kit Invitrogen, Karlsruhe EndoFree® Plasmid Maxi Kit QIAGEN GmbH, Hilden QIAEX™II Gel Extraction Kit QIAGEN GmbH, Hilden
RNeasy® Plus Micro Kit QIAGEN GmbH, Hilden
SuperSignal® West Dura Trial Kit Thermoscientific, Rockford, Illinois (USA)
164 TOPO® TA Cloning Kit mit E. coli
und S.O.C.-Medium Invitrogen, Karlsruhe
12.2.6 Biologisches Material
BL21 (DE3) Competent Cells BioLabs New England, Frankfurt am Main
HEK 293-Zellen DSMZ (ACC 635), Göttingen
One Shot® BL21 (DE3) E. coli Invitrogen, Karlsruhe One Shot® Top 10 E. coli Invitrogen, Karlsruhe
MAC-T Zelle:
Die MAC-T Zelllinie wurde freundlicherweise von der Arbeitsgruppe um Prof. Dr. Hans-Martin Seyfert Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere (FBN), Fachbereich Molekularbiologie, Dummerstorf zur Verfügung gestellt.
E. coli 1303
Die E. coli wurden freundlicherweise von Dr. med. vet. Wolfram Petzl, Klinik für Wieder-käuer, Ludwig-Maximilians-Universität München zur Verfügung gestellt.
12.2.7 Versuchstiere
Die Versuchstierpopulation bestand aus 10 Tieren, deren Zusammensetzung sich im Laufe der Zeit änderte. Es handelte sich um weibliche Tiere der Rasse Deutsche-Schwarzbunte, die zum Zeitpunkt der Probenentnahme klinisch gesund waren.
Tabelle 13: Geburtsjahr der Versuchstiere.
Tiernummer Geburtsjahr 035
036
2003 2011
038 2011
131 2003
202 2011
266 2011
271 2012
165
12.2.8 Zusammensetzung der Lösungen, Medien und Puffer
12.2.8.1 Lösungen für Zellseparation
Lösung mit einem 0,2 µm Filter steril filtrieren.
PBS
166 BL21-Puffer (pH 7,9)
Reagenz Volumen
200 mM Tris 2,4 g
150 mM NaCl 8,77 g
1 mM EDTA (Stocklösung: 0,5 mol/L) 2 ml
Aqua tridest. ad 1 L
Boeringer Lyse Puffer (pH 7,4)
Reagenz Volumen
50 mM Tris-HCl 0,394 g
150 mM NaCl 0,43 g
1 % Nonidet P40 0,5 ml
0,1 % Natriumdesoxycholat 0,05 ml
0,1 % SDS 0,05 g
Aqua tridest. ad 50 ml
D10F-
Reagenz Volumen
Dulbecco’s modified Eagle’s Medium 500 ml
FCS 50 ml
L-Glutamin 5 ml
I10F-
Reagenz Volumen
Iscove’s modified Dulbecco’s Medium 500 ml
FCS 50 ml
L-Glutamin 5 ml
LB-Agar
Reagenz Volumen
LB-Agar 16 g
Aqua tridest. ad 500 ml
Ampicillin (100 mg/ml)* 500 µl
Autoklavierung bei 135 °C und 2,8 bar für 20 min.
* Zugabe erst nach Abkühlung auf ca. 55 °C.
167 LB-Medium
Reagenz Volumen
LB broth 10 g
Aqua tridest. ad 500 ml
Autoklavierung bei 135 °C und 2,8 bar für 20 min.
M10F-
Reagenz Volumen
Minimal Essential Medium Eagle 500 ml
FCS 50 ml
NEAA 0,5 ml
M10F+
Reagenz Volumen
Minimal Essential Medium Eagle 500 ml
FCS 50 ml
Pen/Strep 5 ml
NEAA 0,5 ml
MIF-Puffer
Reagenz Volumen
PBS 500 ml
NaN3 0,05 g
0,5 % BSA (Franktion V) 2,5 g
Staining-Buffer (pH 7,4)
Reagenz Volumen
PBS 500 ml
1 mM EDTA (Stocklösung: 0,5 mol/L) 1 ml 0,01 % Tween 20 (Stocklösung: 20 %) 250 µl
0,1 % NaN3 0,5 g
Trypsin-EDTA
Reagenz Volumen
Trypsin EDTA 5 ml
PBS 45 ml
168
12.2.8.3 Lösungen und Puffer für molekularbiologische Verfahren 4 x Laemmli Puffer
Reagenz Volumen
240 mM Tris-HCL pH 6,8 (Stock: 1 M) 3,6 ml
8 % SDS 1,2 g
40 % Glycerol 6 ml
0,04 % Bromphenolblau 6 mg
Aqua tridest. ad 15 ml
5 % ß-Mercaptoethanol * 25 µl/ml
* erst nach dem Auftauen hinzufügen.
TBE
Reagenz Volumen
TBE 10 x 100 ml
Aqua tridest. 900 ml
12.2.8.4 Lösungen und Puffer für proteinbiochemische Methoden 3 % BSA-TBS
Reagenz Volumen
TBS 100 ml
BSA (Fraktion V) 3 g
5 % Milch
Reagenz Volumen
Milchpulver 5 g
Aqua tridest. ad 100 ml
10 x TBS
Reagenz Volumen
Tris, pH 7,4 24,2 g
NaCl 80 g
Aqua tridest. ad 1 L
10 x TG-Puffer
Reagenz Volumen
Tris 144 g
Glycerin 30,3 g
Aqua tridest. ad 1 L
169 APS 10 %
Reagenz Volumen
APS 0,5 g
Aqua tridest. 5 ml
Coomassie-Entfärber
Reagenz Volumen
40 % Ethanol 400 ml
10 % Essigsäure 100 ml
Aqua tridest. ad 1 L
Coomassie-Färbelösung
Reagenz Volumen
0,1 % Coomassie Brillant Blau G-250 1 g
40 % Ethanol 400 ml
10 % Essigsäure 100 ml
Aqua tridest. ad 1 L
SDS 10%
Reagenz Volumen
SDS 50 g
Aqua tridest. ad 500 ml
SDS-Gelpuffer, pH 6,8
Reagenz Volumen
0,5 M Tris-HCl 7,88 g
0,4 % SDS 0,4 g
Aqua dest. ad 100 ml
SDS-Gelpuffer, pH 8,8
Reagenz Volumen
1,5 M Tris 18,2 g
0,4 % SDS 0,4 g
Aqua dest. ad 100 ml
170 SDS-Laufpuffer
Reagenz Volumen
10 x TG 100 ml
10 % SDS 10 ml
Aqua tridest. ad 1 L
TBS 10x (pH 7,4)
Reagenz Volumen
Tris 24,2 g
NaCl 80 g
Aqua tridest. ad 1 L
TBS Tween
Reagenz Volumen
TBS 500 ml
0,05 % Tween 20 (Stocklösung: 20%) 1,25 ml
Transferpuffer (pH 8,3)
Reagenz Volumen
25 mM Tris 3 g
150 mM Glycerin 13,8 g
20 % Methanol 200 ml
Aqua tridest. ad 1 L
12.2.9 Plasmide
CCL20-Plasmid mit His-tag Life Technology, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA (USA)
Abbildung 32: CCL20-Plasmid mit His-tag.
171
pCR®2.1-TOPO® Invitrogen, Karlsruhe
Abbildung 33: pCR®2.1-TOPO® Plasmid.
172
12.3 CCL20
12.3.1 Zellbiologische Methoden
12.3.1.1 Kultivierung der HEK 293-Zellen
Humane embryonale Nierenzellen (human embryonic kidney cells, HEK) wurden mit DNA-Fragmenten des Adenovirus Typ 5 transformiert, wodurch die Zellen unsterblich wurden. Sie wachsen bis zur Konfluenz epitheloid und danach weiter als Haufen (GRAHAM et al. 1977).
Die Kultivierung von HEK 293-Zellen (12.2.6) erfolgte in M10F+ (12.2.8.2) bei 37 °C mit 5 % CO2 in Zellkulturflaschen (12.2.2). Dazu wurden zuerst die bei -150 °C eingefrorenen HEK-Zellen möglichst schnell aufgetaut, indem sie in ein 37 °C warmes Wasserbad gehalten wurden. Sobald der Inhalt des Kryo-Röhrchens (12.2.2) flüssig war, wurde er in ein 15 ml-Röhrchen mit 10 ml kalten M10F+ gegeben. Um Dimethylsulfoxid (DMSO)-Rückstände (12.2.3) von der Asservierung zu entfernen, wurde das Röhrchen bei 300 x g für 10 min zent-rifugiert, der Überstand abgenommen und das Pellet resuspendiert. Anschließend wurden wieder 10 ml kaltes M10F+ dazu gegeben und das Ganze mit den gleichen Einstellungen er-neut zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet resuspendiert. Dieser Schritt wurde noch ein drittes Mal wiederholt. Danach wurden zum resuspendierten Zellpellet 30 ml M10F+
gegeben, das Volumen gleichmäßig auf drei Zellkulturflaschen verteilt und diese in den Wärmeschrank gestellt. Nach ein paar Tagen erfolgte ein Mediumwechsel, um die toten nicht adhärenten Zellen zu entfernen. Zum Wechseln des Mediums wurde zuerst das alte Medium mit einer 10 ml-Pipette abgesaugt und dann neues, zuvor erwärmtes M10F+ in die Flasche gegeben.
Bei einer 90 %-igen Konfluenz der Zellen wurden diese passagiert. Dazu wurde zuerst das Medium mit einer 10 ml-Pipette abgenommen, dann wurden die Zellen mit 5 ml kalten PBS gewaschen und danach mit 2 ml Trypsin-EDTA (12.2.8.2) versetzt. Die Zellkulturflaschen wurden für 5 min in den Wärmeschrank gestellt und anschließend wurde durch leichtes Schwenken geprüft, ob sich die Zellen vom Boden der Flasche gelöst hatten. Die Zellsuspen-sion wurde daraufhin in ein 50 ml-Röhrchen überführt, die Zellkulturflasche mit 5 ml M10F+
gespült und diese Flüssigkeit ebenfalls zu der Zellsuspension gegeben. Durch das im Medium
173
enthaltene fetale Kälberserum (FCS, 12.2.3) wurde die Reaktion des Trypsins gestoppt. Die Zellsuspension wurde bei Raumtemperatur für 10 min bei 300 x g zentrifugiert, der Überstand abgekippt und das Pellet in 1 ml M10F+ resuspendiert. Ein Teil der Zellen wurde zusammen mit 10 ml erwärmten M10F+ in eine neue Kulturflasche überführt, während die restlichen Zellen eingefroren wurden, indem 700 µl Zellsuspension mit 200 µl FCS und 100 µl DMSO versetzt wurden. Zuerst wurde das Kryo-Röhrchen für 24 bis 72 h bei -80 °C eingefroren, um die Bildung von Eiskristallen zu minimieren. Anschließend wurden die Kryo-Röhrchen in einen -150 °C kalten Gefrierschrank umgelagert, wodurch eine lange Lagerung der Zellen ermöglicht wurde.
12.3.1.2 HEK-Zell-Transfektion
Um die gewünschte CCL20-DNA (12.2.9) in die HEK-Zellen einzubringen wurde Lipofectamine 2000® (12.2.3) benutzt. Zuerst wurden bei Zellkulturflaschen, deren Zellen eine 90 %-ige Konfluenz aufwiesen, das Kulturmedium entfernt, anschließend die Zellen zweimal mit jeweils 5 ml kalter PBS gespült und mittels Trypsin-EDTA vom Flaschenboden gelöst. Die gelösten Zellen wurden in ein 50 ml-Röhrchen gegeben, die Zellkulturflasche mit 5 ml M10F- (12.2.8.2) gespült und ebenfalls in das Röhrchen gegeben, das dann bei 300 x g für 10 min zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet resuspendiert, in 24 ml M10F- aufgenommen und auf zwei 24-Well-Platten verteilt, sodass sich in jedem Well 500 µl der Zellsuspension befanden. Die Zellen wurden in M10F- aufgenommen, da der Zu-satz von Antibiotika bei der Transfektion Zelltod zur Folge hätte. Anschließend wurden die Platten für einen Tag im Brutschrank gelassen, damit die Zellen adhärieren konnten.
Um die HEK-Zellen zu transfezieren wurde für jedes Well 1 µg DNA des CCL20-His-Tag (12.2.3) in 50 µl MEM (12.2.3) gegeben. Das Lipofectamine 2000® wurde vor Gebrauch vor-sichtig geschwenkt und zu 50 µl MEM pipettiert. Dabei wurden verschiedene Verhältnisse zwischen Lipofectamine 2000® und DNA getestet, die im Bereich von 1:0,5 bis 1:5 lagen (Tabelle 14). Nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die beiden MEM-Ansätze mit der DNA und dem Lipofectamine 2000® zusammen pipettiert und für weitere 20 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurden die 100 µl in das entsprechende Well gegeben und vorsichtig durch Schwenken der Platte mit dem bereits enthaltenen Medi-um vermischt. Um überprüfen zu können, ob die Transfektion erfolgreich war, erfolgte
zeit-174
gleich zur CCL20-Transfektion eine Transfektion eines Plasmids mit der DNA von grün fluo-reszierendem Protein (GFP) (12.2.3), einem nach Anregung mit UV-Licht grün fluoreszieren-den Farbstoff. (Für die GFP-Ansätze wurfluoreszieren-den nur die mit Sternchen gekennzeichneten Lipofectamine 2000®-Verhältnisse angesetzt.) Die Kulturplatte wurde bei 37 °C und 5 % CO2
für 18 h inkubiert und die GFP-Ansätze dann unter einem Fluoreszenzmikroskop (12.1) be-gutachtet. Nach weiteren 24 h wurden die Überstände abgenommen und die HEK-Zellen mit 100 µl Boehringer Lyse-Puffer (12.2.8.2), der Protease-Inhibitoren (12.2.3) in einem Verhält-nis von 1:400 enthielt, lysiert und ebenso wie die Überstände bei -20 °C eingefroren.
Tabelle 14: Lipofectamine 2000®-Verhältnisse der CCL20-Ansätze.
Verhältnis Lipofectamine 2000® β-Mercaptoethanol (12.2.3) enthielt. Anschließend wurden die Zelllysate in Eppendorfgefäße überführt und bei -80 °C eingefroren.
Die mRNA Extraktion erfolgte mit dem RNeasy® Plus MiniKit (12.2.5) und die gesamte Zentrifugation erfolgte bei 14,5 x rcf. Dazu wurden die Proben aufgetaut, die 350 µl auf den QIAShredder™ gegeben und 2 min zentrifugiert. Der Durchlauf wurde auf den Eliminator pipettiert und für 30 sec zentrifugiert. Der daraus entstandene Durchlauf wurde mit 350 µl 70 %-igen Ethanol gemischt und auf die Membran im Spin-Column gegeben. Das Ganze
175
wurde für 15 sec zentrifugiert, der Durchlauf verworfen, anschließend 700 µl RW1 dazupipettiert und der Ansatz für 15 sec zentrifugiert. Der Durchfluss wurde abgekippt und die Membran zweimal mit jeweils 500 µl RPE gewaschen; nach dem ersten Mal wurde für 15 sec zentrifugiert und nach dem zweiten Mal für 2 min. Danach wurde die Membran in ein neues 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt, 40 µl RNase freies Aqua dest. hinzugegeben und al-les für 1 min zentrifugiert. Der Durchlauf enthielt die extrahierte mRNA, die am Photometer (12.1) gemessen und anschließend bei -80 °C eingefroren wurde.
12.3.2.2 cDNA Synthese mittels SuperScript™ II
Die gesamte Synthese wurde in einem Thermozykler (12.1) durchgeführt. Zuerst wurde der in Tabelle 15 beschriebene Mastermix angesetzt, für 5 min bei 65 °C erhitzt und auf Eis abge-kühlt. Anschließend wurden zum Ansatz 4 µl des 5 x First-Strand Buffer, 2 µl 0,1 M DTT sowie 1 µl RNaseOut™ (40 units/µl) (12.2.3) gegeben und alles für 2 min bei 25 °C erwärmt.
Danach wurde 1 µl SuperScript™ II (12.2.3) dazu gegeben, durch mehrmaliges Pipettieren durchmischt und bei 25 °C für 10 min erhitzt. Daraufhin wurde der Ansatz weitere 50 min bei 42 °C inkubiert, bevor die Enzyme bei 70 °C für 15 min inaktiviert wurden. Die fertige DNA wurde für 7 Tage im Kühlschrank aufbewahrt oder bei -20 °C eingefroren.
Tabelle 15: Mastermix für SuperScript™ II.
Reagenz Volumen [µl]
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) dient dazu, ein zwischen zwei gegenläufig orientierten Primern liegenden DNA-Abschnitt – ausgehend vom 3'-Ende in Richtung 5'-Ende – in vitro zu amplifizieren, um es anschließend z.B. für Genexpressionsanalysen oder für eine Trans-formation/Transfektion zu nutzen. Es handelt sich dabei um eine 1983 von Kary Mullis ent-wickelte Methode. Dabei wird die DNA zuerst bei 95 °C aufgeschmolzen, sodass zwei Ein-zelstränge vorliegen, an die sich dann um das zu vervielfältigende Stück herum der Forward- und Reverse-Primer bei einer für sie optimalen Temperatur an die DNA anlagern.
Anschlie-176
ßend folgt eine Zeitspanne, in der die DNA-Polymerase den komplementären Strang aus Desoxynukleosid-triphosphaten (dNTPs) neu synthetisiert. Um eine genügend große Menge des DNA-Abschnitts herzustellen laufen 35 solcher Zyklen hintereinander ab. Es wird eine hitzestabile DNA-Polymerase benötigt, die bei der wiederholt hohen Temperatur während der Aufschmelzung nicht kaputt geht.
Zyklusschritt Zeit [sec.] Temperatur [°C]
Initiale Denaturierung
Um mittels PCR das gewünschte CCL20-Produkt zu generieren, waren spezifische Primer nötig, die mit Hilfe der Nukleotidsequenz der codierenden mRNA aus der Datenbank des Na-tional Center for Biotechnology Information (NCBI) generiert und durch die Firma MWG synthetisiert wurden. Allgemein sollten Primer zwischen 20-30 bp lang sein und einen GC-Gehalt um die 60 % aufweisen. Des Weiteren musste der Reverse Primer ein Stop-Codon enthalten, damit die Polymerase nicht über das zu synthetisierende Gen hinaus weiter ablas, und es wurde darauf geachtet, dass eine gerichtete Klonierung in den nachfolgend verwende-ten Vektor möglich war. Die bestellverwende-ten Primer wurden in einem Gradienverwende-tenprogramm des
177
Thermozyklers laufen gelassen, um die optimale Annealing Temperatur festzustellen, da Forward und Reverse Primer ein Temperaturdelta von 4 °C aufweisen. Es wurden in diesem Fall drei verschiedene Temperaturen (56 °C, 58 °C und 60 °C) getestet. Des Weiteren wurden verschiedene Zellen und Gewebe (Leber, MNC und Monozyten) eingesetzt, um das cDNA-Template zu generieren.
12.3.2.5 Agarosegelelektrophorese
Um die Größe der DNA- oder RNA-Stränge zu bestimmen und gleichzeitig eine Aufreinigung der PCR-Probe zu bewirken, wurde die Agarosegelelektrophorese benutzt. Da-zu werden Agarosepolymere Da-zu einem Gitter vernetzt, das engmaschiger wird je höher der Agaroseanteil ist. Es sorgt dafür, dass größere Teilchen nach Anlegung eines elektrischen Feldes langsamer zur Anode wandern als kleinere, da sie nicht so leicht durch die Netzstruk-tur gelangen. Anhand eines parallel laufenden Standards kann man die Größe der sich gebil-deten Banden bestimmen.
Die Agarose wurde mit dem Wasser zusammen aufgekocht, bis sie sich aufgelöst hatte, und nach Abkühlen der Lösung wurde das Gel Red™ (12.2.3) dazupipettiert. Anschließend wurde das flüssige Gel in die Kammer (12.2.2) gegossen, der Kamm (12.2.2) eingesetzt und gewar-tet, bis das Gel erhärtet war. Danach wurde in die erste Tasche 3 µl des 100 bp-Standards (12.2.3) pipettiert, während in die anderen Taschen die 20 µl des hergestellten PCR-Produktes gegeben wurden. Das Gel lief bei 85 V für ca. 45 min. Anschließend konnte man mit Hilfe von UV-Licht (12.2.2) die gebildeten Banden sichtbar machen, wobei beachtet wurde, das Gel nicht zu lange zu bestrahlen, da es sonst zu einer Schädigung der Nukleinsäuren kommt.
Die gewünschte Bande wurde mit einem Skalpell (12.2.2) ausgeschnitten. Zur Analyse des CCL20-PCR Produkts mit einer Größe von 370 bp wurde ein 2 %-iges Gel gefahren, während Plasmide mit einer Größe von über 5000 bp auf einem 0,4 %-igem Gel analysiert wurden.
178 12.3.2.6 Gelextraktion
Um an die im Agarosegel enthaltene DNA zu gelangen, wurde eine Extraktion mit dem QIAEX™II Gel Extraktion Kit (12.2.5) durchgeführt. Zuerst wurde das ausgeschnittene Gelstück gewogen und zusammen mit dem dreifachen Gewichtsvolumen an QX1 und 10 μL QIAEX II in ein Eppendorfgefäß gegeben. Dieses wurde für 10 min auf eine 50 °C warme Heizplatte gestellt und dabei alle 2 min gevortext. Anschließend wurde es bei 14,5 x rcf für 30 sec zentrifugiert und der Überstand mit einer Pipette abgenommen. Dann wurde das Pellet resuspendiert und 500 μL QX1 dazugegeben, um Agarosegelreste auszuwaschen. Das Eppen-dorfgefäß wurde erneut bei 14,5 x rcf für 30 sec zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert, das Pellet zweimal hintereinander in 500 μL PE-Puffer resuspendiert und dazwi-schen jeweils für 30 sec bei 14,5 x rcf zentrifugiert. Danach wurde mit einer Pipette möglichst die gesamte Flüssigkeitsmenge abgenommen und das offene Eppendorfgefäß für ca. 15 min zum Trocknen auf den Heizblock (12.1) gelegt, bis das Pellet weiß und undurchsichtig war.
Daraufhin wurden zum Pellet 20 μL Aqua dest. hinzugegeben und gevortext. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Eppendorfgefäß erneut für 30 sec bei 14,5 x rcf zentrifugiert und diesmal wurde der Überstand, der die extrahierte DNA enthielt, in ein PCR-Reaktionsgefäß überführt.
12.3.2.7 Klonierung
Die Klonierung wurde mit Hilfe des TOPO-Cloning-Kits (12.2.5) und dem pCR®2.1-Vektor (12.2.3) durchgeführt. Dazu wurden die Ansätze nach dem Pipettierschema in Tabelle 19 an-gesetzt und 20 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Währenddessen wurden die One Shot Top 10 E. coli (12.2.6) ca. 10 min auf Eis angetaut und dann der gesamte zuvor pipettierte Ansatz zu den Bakterien gegeben und zusammen für 30 min auf Eis inkubiert. An-schließend wurde der Ansatz für 30 sec auf der 42 °C warmen Heizplatte hitzegeschockt und dann 250 μL super optimal broth with catabolite repression (S.O.C.)-Medium (12.2.3) hinzu-gefügt. Die Zellen wurden daraufhin eine Stunde lang bei 37 °C und 250 rpm wegen der bes-seren Sauerstoffzufuhr in waagerechter Position geschüttelt (12.1). Danach wurden auf vor-gewärmten LB-Agarplatten (12.2.8.3), die Ampicillin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid (X-Gal) und Isopropyl-β-D-thio5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid (IPTG) (12.2.3) enthielten, jeweils 200 μL und 100 μL der Suspension ausgestrichen und die Platten für 16-18 h in den Wärmeschrank gestellt. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Platten bei 4 °C gelagert.
179 Tabelle 19: TOPO Cloning Ansatz.
Reagenz Volumen
Salt Solution (1,2 M NaCl + 0,06 M MgCl2) 0,5 μL
PCR-Produkt 2,0 μL
TOPO-Vektor 2.1 0,5 μL
Gesamtvolumen 3,0 μL
12.3.2.8 Plasmidextraktion
Um das PCR-Produkt im pCR-Vektor zu analysieren, wurde eine Miniprep (12.3.2.9) mit 5 ml Ausgangskultur durchgeführt. Dazu wurd pro 5 ml LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin (12.2.3) enthielt, eine weiße Kolonie von den Platten gepickt und über Nacht bei 37 °C und 250 rpm geschüttelt. Da für die Transfektion der HEK-Zellen viel mehr CCL20-DNA benötigt wurde als für die Plasmidanalyse, wurde eine Maxiprep (12.3.2.10) mit 80 ml Übernachtkultur durchgeführt.
12.3.2.9 Miniprep
Die Plasmidextraktion erfolgte mittels dem Pure Link Quick Plasmid DNA Miniprep Kit
Die Plasmidextraktion erfolgte mittels dem Pure Link Quick Plasmid DNA Miniprep Kit