Es konnte für verschiedene Zellpopulationen gezeigt werden, dass sie durchaus signifikante antibakterielle Wirkungen vermitteln. Aufgrund der sehr geringen Versuchstierzahlen sind weitere Untersuchungen nötig, um die Effektivität der Zellkulturansätze, besonders der mit NK-Zellen, zu untermauern. Ebenso sollten weitere Versuche mit rekombinanten bovinen Chemokinen durchgeführt werden, die zudem in höheren Konzentrationen getestet werden sollten, damit die MHK bestimmt werden können. Anschließend sollte geprüft werden,
in-114
wieweit diese Konzentrationen in vivo zu erreichen sind und ob durch gezielte Beeinflussung von Zellen und deren Mediatoren eine erhöhte Bereitstellung und Freisetzung dieser Zellin-haltsstoffe zu erreichen wäre.
AMP weisen viele gewünschte Eigenschaften einer neuen Antibiotikaklasse auf (HANCOCK u. SAHL 2006), sind aber bislang aufgrund der hohen Produktionskosten und benötigten Konzentrationen, die zudem nahe der toxischen Dosis liegen, am ehesten als Therapeutikum für topische Anwendungen geeignet. Es besteht eine synergistische Wirkung zwischen kon-ventionellen Antibiotika und AMP, die ggf. dadurch zustande kommt, dass AMP aufgrund ihrer membranolytischen Wirkung den Antibiotika Zugang zu Bakterien ermöglichen (GIULIANI et al. 2007).
Der Einsatz von AMP birgt ebenfalls Probleme, da sie eine schlechte Stabilität in vivo haben, durch erhöhte Salzkonzentrationen inaktiviert werden und Resistenzen sich z.T. schnell ent-wickeln, wenn Bakterien durchgehend erhöhten AMP-Spiegeln ausgesetzt sind. Dieses Phä-nomen der Resistenzentstehung trifft ebenso auf Antibiotika zu, sodass eine AMP-Anwendung nicht deswegen von vornherein ausgeschlossen werden sollte, sondern ein ratio-naler Umgang mit ihnen das wichtigste ist, um eine Resistenzsituation – wie sie bei den Anti-biotika vorliegt – zu vermeiden (GIACOMETTI et al. 2000b; VAN 'T HOF et al. 2001;
GIULIANI et al. 2007).
Inwieweit die in dieser Arbeit beschriebenen Effekte auf die Wirkung der durch Kulturzellen sekretierten AMP zurückzuführen sind, bleibt leider ungeklärt. Deshalb sind weitere Versuche notwendig, um die Vermutung, dass die Vitalitätsreduktion von E. coli AMP-vermittelt ist, abschließend zu bestätigen.
115
6 Zusammenfassung
Annika Bogusch Prüfung der antibakteriellen Aktivität boviner Immunzellen und Chemokine in vitro
Der überwiegende Anteil der Immunzellen ist mit antimikrobiellen Substanzen ausgestattet oder kann sie nach Aktivierung durch inflammatorische Mediatoren bilden und sezernieren.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden Immunzellen (mononukleäre Zellen, Monozyten, neu-trophile Granulozyten und NK-Zellen) neben drei ausgewählten rekombinanten bovinen Chemokinen (CXCL9, CXCL10 und CXCL11) auf ihre antibakteriellen Effekte gegenüber E. coli untersucht.
Dazu wurden zwei verschiedene Vitalitätsnachweise durchgeführt, um den Einfluss der Test-substanzen auf E. coli quantifizierbar zu machen. Das durchflusszytometrische Verfahren lieferte aufgrund der nicht benötigten Inkubationszeit schnelle Ergebnisse, was einen hohen Probendurchsatz und darüber hinaus eine Bestimmung der Zeitkinetik antimikrobieller Sub-stanzen ermöglichte. Die Mikrodilution, die ein Standardverfahren der Mikrobiologie dar-stellt, erwies sich – bezogen auf die Antibiotikakontrollen – als zehnmal sensitiver für den Nachweis antibakterieller Effekte.
Für die durchflusszytometrische Darstellung wurden die Bakterien nach einer 90-minütigen Wachstumsphase auf eine Konzentration von 108 E. coli/ml PBS eingestellt, wodurch das Umgebungsrauschen minimiert wurde und der membranschädigende Effekt maximal sichtbar war. Um die Abgrenzung gegenüber anderen Partikeln zu erleichtern, wurden drei verschie-dene Lebend/Tot-Färbungen mit den Fluorochromen CFSE (6-carboxyfluorescein succinimidyl Ester), TO (Thiazol Orange) und DiBAC4 (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine Oxonol) in Kombination mit Propidiumjodid (PI) durchgeführt. Beim Vergleich der Doppelfärbungen mit der einfachen PI-Färbung zeigte sich jedoch, dass bei einem Groß-teil der zweifach Fluorochrom-markierten Bakterien Membranschäden verhindert wurden, weil allein PI-gefärbte E. coli in ihrer Gesamtheit nahezu vollständig membrangeschädigt (99 %) waren, wogegen sich bei den restlichen Doppelfärbungen nur ein Anteil von 20 % - 30 % PI-positiv darstellte.
116
Ferner kam es bei den Lebend/Tot-Färbungen der Bakterien zu einer sehr heterogenen Anfärbbarkeit mit den Fluorochromen, die trotz Änderung zahlreicher Parameter der Färbe-technik bestehen blieben. So wiesen zwischen 4,7 % - 96,8 % der E. coli eine CFSE-Fluoreszenz auf (Median 35,3 %, CV 61,4 %) und waren zu 2,2 % - 8,6 % PI-positiv (Median 3,7 %, CV 33,9 %). Nach TO-Färbung fluoreszierten 7,1 % - 83,5 % der Bakterien in FL1 (TO-positiv) (Median 51,6 %, CV 40,7 %) und 2,2 % - 13,6 % in FL3 (PI-positiv) (Median 3,5 %, CV 56,5 %). 0,7 % - 16,4 % der E. coli waren DiBAC4-positiv (Median 1,6 %, CV 121,5 %) und 2,5 % - 26,5 % (Median 3,6 %, CV 98,1 %) wiesen eine geschädigte Membran auf. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden die Bakterien für die Versuche mit Zellkulturüber-ständen oder den bovinen Chemokinen nur mit PI gefärbt.
Für die Untersuchungen an bovinen NK-Zellen wurde eine Methode zur Anreicherung dieser Zellpopulation mittels magnetischer Zellseparation erarbeitet. Positive Selektionen mit drei verschiedenen CD335-Ak (Klon AKS1) erzielten Reinheiten zwischen 4,6 % - 22,0 %. Um höhere Reinheiten (43 % - 82 %) zu erzielen wurden NK-Zellen mittels Ak gegen CD3, CD4, CD14, CD21, MHCII und WC1, die mit einem sekundärem biotinylierten Ak und Streptavidin-MicroBeads gekoppelt wurden, aus dem Blutzellgemisch negativ selektiert.
Für die drei untersuchten bovinen Chemokine (CXCL9, CXCL10 und CXCL11) konnte eine signifikante Hemmung des bakteriellen Wachstums mit der Mikrodilution nachgewiesen wer-den, die bei CXCL9 und CXCL10 stärker als bei CXCL11 war. Die bakterielle Wachstums-hemmung war dabei unabhängig vom verwendeten Kulturplattenmaterial (Polystyrol versus Polypropylen).
Die Zellkulturüberstände vermittelten abhängig von der geprüften Zellpopulation antibakteri-elle Effekte, wobei eine Stimulation der Zantibakteri-ellen mit LPS oder E. coli diese nur in wenigen Fäl-len steigerte. Die antimikrobielle Aktivität der Überstände von Monozyten und mononukleä-ren Zellen erwiesen sich als stark tierindividuell. Ebenso verhielt es sich bei denen der neu-trophilen Granulozyten und deren Degranulationsprodukten. Lediglich die NK-Zellüberstände aller Versuchstiere hemmten nachweislich das Wachstum der E. coli. Die Überstände aus der
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Co-Kultivierung von MAC-T Zellen mit mononukleären Zellen, Monozyten oder NK-Zellen zeigten bei allen Ansätzen antibakterielle Effekte.
Die Überstände von NK-Zellen, die 20 h mit IL-12 geprimt wurden, erzielten einen stärkeren wachstumshemmenden Effekt auf E. coli als Überstände ungeprimter Zellen. Eine weitere Stimulation der NK-Zellen mit LPS, Ionomycin oder IL-1β vermittelte keine Steigerung der antimikrobiellen Aktivität. Die Kulturüberstände kreuzvernetzter (CD335 oder CD2) NK-Zellen unterschieden sich tierindividuell in ihrem wachstumshemmemden Potential gegen-über E. coli.
Eine Co-Kultivierung von E. coli mit mononukleären Zellen, neutrophilen Granulozyten oder einer Kombination aus beiden führte zu membrangeschädigten Bakterien, die abhängig von den eingesetzten Zellen und der Stimulation mit Ionomycin für 30 min bis zu 4 h nachzuwei-sen waren. Die Stimulation mit Ionomycin hatte demgegenüber keinen Einfluss auf den An-teil membrangeschädigter Bakterien, der allein von der verwendeten Zellpopulation abhing (Neutrophile bis zu 21 %, MNC bis zu 7 % und in Kombination bis zu 11 % PI-positive E. coli).
Anhand dieser Versuche konnte gezeigt werden, dass einzelne Zellpopulationen – vor allem NK-Zellen – ebenso wie bovines CXCL9, CXCL10 und CXCL11 antibakteriell gegenüber E. coli wirken. Ein Einsatz antimikrobieller Proteine oder eine gezielte Modulation von Im-munzellen, die zur verstärkten Sekretion antibakterieller Substanzen führt, wären mögliche Ansätze, um den Einsatz konventioneller Antibiotika zu senken.
118
7 Summary
Annika Bogusch Screening of bovine immune cells and chemokines for antibacterial activity in vitro
Most immune cells are either equipped with or able to produce antimicrobial substances after receiving inflammatory signals. For this work immune cells (mononuclear cells, monocytes, neutrophil granulocytes and NK cells) were cultured and studied along with three recombi-nant bovine chemokines (CXCL9, CXCL10 and CXCL11) on behalf of their antibacterial effects against E. coli.
Two different vitality tests were used to quantify the influence of test substances on E. coli.
Flow cytometric evaluation yielded fast results due to the lack of long incubation periods.
Therefore many samples could be measured and it further enabled the user to determine time depended effects of the tested substances. Microdilution, a standard test in microbiology, was ten times more sensitive in detecting antibacterial effects than the used flow cytometric tech-nique.
For flow cytometric analyses E. coli was grown for 90 minutes and after that diluted in PBS (108 bacteria/mL) in order to minimize background noise while simultaneously maximizing the membrane disrupting effect. To discriminate between bacteria and other particles three fluorochromes CFSE (6-carboxyfluorescein succinimidyl ester), TO (thiazole orange) and DiBAC4 (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine oxonol) in combination with propidium iodide (PI) were used. Comparing double stained bacteria with those that were incubated with PI alone, it became obvious that dye combinations prohibited an increase in membrane per-meability, because only 20 % - 30 % of the bacteria appeared membrane-damaged after dou-ble staining compared to 99 % of PI-only stained bacteria.
Furthermore, the amount of stained bacteria using live/dead dyes yielded heterogenic results that could not be abrogated by changing parameters of the staining technique. The proportion of CFSE stained bacteria ranged between 4.7 % - 96.8 % (median 35.3 %, CV 61.4 %) with 2.2 % - 8.6 % PI positive E. coli (median 3.7 %, CV 33.9 %). After TO staining 7.1 % -
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83.5 % of the bacteria fluoresced in FL1 (TO positive) (median 51.6 %, CV 40.7 %) and 2.2 % - 13.6 % in FL3 (PI positive) (median 3.5 %, CV 56.5 %). Using DiBAC4 0.7 % - 16.4 % of E. coli were positive for this dye (median 1.6 %, CV 121.5 %) and 2.5 % - 26.5 % had disrupted membranes (median 3.6 %, CV 98.1 %). Due to these heterogenic results bacte-ria were solely stained with PI for further experiments.
Before evaluating bovine NK cells, a purification method by magnetic separation out of blood mononuclear cells was established. Whereas strategies to purify the cells by positive selection largely failed (purities ranged between 4.6 % and 22.0 %), a negative selection strategy by depleting contaminating cells with antibodies against CD3, CD4, CD14, CD21, MHCII and WC1, along with a secondary biotinylated antibody which bound to streptavidin microbeads yielded in purities from 43 % to 82 %.
By using microdilution a significant inhibition of bacterial growth could be noted for all three tested bovine chemokines. The inhibitory effect of CXCL9 and CXCL10 was stronger than that of CXCL11. The culture plate material (polystyrole or polypropylene) had no significant influence on the results.
The cell culture supernatants conveyed antibacterial effects depending on the tested cell popu-lation. Stimulation of cells with LPS or E. coli usually did not enhance the antibacterial ef-fects. Monocyte and mononuclear cell supernatants resulted in highly individual efef-fects. The same was observed with supernatants of neutrophils and their degranulation products. Only NK cell supernatants of all tested animals uniformly inhibited the growth of E. coli. Every supernatant from mononuclear cells, monocytes or NK cells co-cultured with MAC-T cells displayed antibacterial effects.
Supernatants of NK cells, which were primed for 20 h with IL-12 displayed stronger growth inhibitory effects on E. coli compared to supernatants of unprimed cells. Any further stimula-tion of NK cells with LPS, ionomycin or IL-1β did not result in an enhanced antimicrobial activity. Supernatant from cells that were CD335 or CD2 linked showed individually different growth inhibitory potential against E. coli.
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Co-culturing of E. coli with mononuclear cells, neutrophil granulocytes or a combination of these two cell populations led to bacteria with disrupted membranes as measured flow cytometrically by PI uptake. The effects were detectable for 30 min up to 4 h depending on the culture composition and stimulation of cells with ionomycin. Ionomycin had no detectable influence on the amount of PI-positive bacteria. The latter depended only on the cultured cell type (neutrophils up to 21 %, MNC up to 7 % and both combined up to 11 % PI-positive bac-teria).
Based on the experiments in this work, antibacterial activity of bovine CXCL9, CXCL10 and CXCL11, and of different mononuclear blood cell populations, especially NK cells, against E. coli could be shown. Either the application of antimicrobial proteins or the modulation of immune cells towards cells expressing more antibacterial substances is a possible approach to reduce usage of conventional antibiotics.
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The expression of the gene coding for the antibacterial peptide LL-37 is induced in human keratinocytes during inflammatory disorders.
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