4.2 Durchflusszytometrische Darstellung von E. coli
4.2.2 Vitalfärbungen zur Abgrenzung der Bakterien im Durchflusszytometer
etablieren, wurden drei verschiedene Verfahren geprüft. Die Lebend/Tot-Färbungen (CFSE, TO und DiBAC4) wurden an 48 verschiedenen Tagen durchgeführt. Alle drei Verfahren wa-ren generell sehr variabel im Anteil der fluoresziewa-renden E. coli. Vor allem bei der CFSE- und TO-Färbung waren an einigen Tagen nahezu keine positiv gefärbten Bakterien zu detektieren, wohingegen die DiBAC4-Färbung durch den z.T. hohen Anteil an PI-positiven Bakterien auf-fiel. Um die Ergebnisse der Färbungen zu optimieren, wurden verschiedene Parameter verän-dert. Dies betraf zum einen die Zentrifugation. Es wurde die Anzahl der Waschschritte vari-iert, um einen Einfluss der Zentrifugation auf die Vitalität auszuschließen (Daten nicht ge-zeigt). Zum anderen wurde die Inkubationszeit von 15 auf 30 min verlängert (Daten nicht
D) 108E. coli/ml E) 109E. coli/ml C) 107E. coli/ml
B) 106E. coli/ml
SSC
SSC SSC SSC SSC
A) 105E. coli/ml
PI PI PI FSC
SSC SSC SSC SSC SSC
PI PI
FSC FSC FSC FSC FSC
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gezeigt). Weiterhin wurde die Färbung bei drei unterschiedlichen Temperaturen (37 °C, Raumtemperatur und auf Eis) durchgeführt. Dabei zeigte sich keine Veränderung des Färbe-verhaltens und der Vitalität der Bakterien (Daten nicht gezeigt), sodass die Färbung fortan auf Eis durchgeführt wurde, um die Bakterien an einer Teilung zu hindern. Für die CFSE-Färbung wurden zudem verschiedene Konzentrationen (1, 5, 10, 20, 30, 40 und 50 µg/ml) getestet, wobei die meisten CFSE-positiven Bakterien (71,3 %) bei einer finalen Konzentrati-on vKonzentrati-on 20 µg/ml zu erfassen waren. Der Anteil an CFSE-fluoreszierenden E. coli lag bei den anderen Konzentrationen zwischen 37 % und 60 % (Daten nicht gezeigt). Dagegen wurde bei der TO-Färbung die Menge an Staining Buffer variiert, indem fünf unterschiedliche Volumina (1000, 800, 500, 300 und 100 µl) getestet wurden. Die TO-Färbung mit 100 µl Staining Buffer führte nur zu sehr geringen Anteilen TO-positiver Bakterien (0,2 %), wohingegen
≥ 500 µl Staining Buffer dazu führten, dass der Anteil der PI-positiven E. coli auf bis zu 35 % anstieg (Daten nicht gezeigt).
Im Endeffekt wurden die Bakterien, wie unter 3.10.6 beschrieben gefärbt, um anschließend durchflusszytometrisch analysiert zu werden. Diese Färbetechnik wurde an 27 Tagen benutzt;
dennoch waren die Bakterien weiterhin tagesabhängig variabel in ihrer Fähigkeit, sich anfär-ben zu lassen. Tabelle 10 gibt die Schwankungsbreite dieser Färbungen wieder.
Tabelle 10: Färbeverhalten und Vitalität der Bakterien bei unterschiedlichen Vitalfärbungen.
Fluorochrom-positive E. coli Membrangeschädigte E. coli n Min-Max [%] Median [%] CV [%] Min-Max [%] Median [%] CV [%]
CFSE 27 4,7 - 96,8 35,3 61,4 2,2 - 8,6 3,7 33,9
TO 27 7,1 - 83,5 51,6 40,7 2,2 - 13,6 3,5 56,5
DiBAC4 27 0,7 - 16,4 1,6 121,5 2,5 - 26,5 3,6 98,1 E. coli (108 KBE/ml) wurden mit Fluorochromen markiert: CFSE (final 20 µg/ml), TO (final 202,5 ng/ml), DiBAC4 (final 10 µg/ml) und PI (final 32,5 µg/ml) sowie anschließend durchflusszyto-metrisch erfasst. In einem Forward (FSC) gegen Side Scatter (SSC) Dotplot wurde um die dominante Partikelwolke eine Region gesetzt und die darin gemessenen Events in FL3 (PI) versus FL1 (CFSE, TO, DiBAC4) Diagrammen dargestellt. Die Quadranten wurden so gesetzt, dass CFSE, TO, DiBAC4
fluoreszierende E. coli oberhalb der waagerechten Linie und membrangeschädigte Bakterien (PI-positiv) rechts der senkrechten Linie liegen. Die Prozentsätze der Quadranten wurden zur Berechnung herangezogen. PI = Propidiumjodid, CFSE = 6-carboxyfluorescein succinimidyl Ester, TO = Thiazol Orange, DiBAC4 = bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine Oxonol.
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Abbildung 13: Interassay-Variabilität der Vitalfärbungen von E. coli.
Auf 108 KBE/ml eingestellte E. coli wurden mit A) CFSE (final 20 µg/ml), B) TO (final 202,5 ng/ml) oder C) DiBAC4 (final 10 µg/ml) markiert und mit Propidiumjodid (PI, final 32,5 µg/ml) versetzt.
Nach durchflusszytometrischer Erfassung wurde in einem Forward (FSC) gegen Side Scatter (SSC) Dotplot um die dominante Partikelwolke eine Region gesetzt und die darin gemessenen Events in FL3 (PI) versus FL1 (CFSE/TO/DiBAC4) Diagrammen dargestellt. Die Quadranten wurden so gesetzt, dass CFSE-, TO- oder DiBAC4-fluoreszierende E. coli oberhalb der waagerechten Linie und membrange-schädigte Bakterien (PI-positiv) rechts der senkrechten Linie liegen. Aus den Ergebnissen von Tabelle 10 wurden hier exemplarisch vier verschiedene Tage zur Darstellung ausgewählt. CFSE = 6-carboxyfluorescein succinimidyl Ester, TO = Thiazol Orange, DiBAC4 = bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine Oxonol.
CFSE-Färbung
Die CFSE-Färbung lieferte bei der durchflusszytometrischen Messung bezüglich des Anteils fluoreszierender Bakterien, der Fluoreszenzintensität und der Abgrenzbarkeit von CFSE-positiven und -negativen E. coli sehr heterogene Ergebnisse (Tabelle 10). Bei den exempla-risch gezeigten CSFE-Färbungen (Abbildung 13A) waren 36,4 % - 96,8 % (CV 50,3 %) der
CFSE
DiBAC4 DiBAC4 DiBAC4 DiBAC4
PI PI PI PI
C) DiBAC4
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Bakterien CFSE-positiv und der Anteil membrangeschädigter E. coli lag zwischen 2,3 % und 5,4 % (CV 32,5 %).
TO-Färbung
Mit TO gefärbte Bakterien zeigten ebenfalls heterogene Ergebnisse bezüglich ihres Färbever-haltens (Tabelle 10). Die Bakterien in den exemplarisch gezeigten Färbungen (Abbildung 13B) waren zu 3,9 % - 67,3 % (CV 63,8 %) TO-positiv. Zwischen 2 % - 13 % (CV 102,8 %) der Bakterien waren nachweisbar membrangeschädigt (PI-positiv). Die Fluoreszenzintensität und der Anteil fluoreszierender E. coli war vom Versuchstag abhängig und eine Trennung zwischen TO-positiven und -negativen E. coli gestaltete sich insgesamt schwierig, da die Par-tikelwolken an den meisten Tagen in einem indifferenten Bereich zwischen eindeutig TO-positiven oder TO-negativen Bakterien lagen (Abbildung 13B).
DiBAC4-Färbung
Die Fluorochrom-Markierung der Bakterien mit DiBAC4 war bis auf wenige Tage konstant im Anteil an fluoreszierenden E. coli (Tabelle 10). Bei den exemplarisch gezeigten Färbungen (Abbildung 13C) waren 0,5 % - 15,4 % (CV 95,5 %) der Bakterien DiBAC4-positiv und der Anteil membrangeschädigter E. coli lag zwischen 3,7 % und 7,1 % (CV 35 %).
DiBAC4 ist ein spannungsabhängiger Farbstoff, der im Gegensatz zu PI keiner Membranschädigung, sondern lediglich des Verlustes der transmembranen Spannung bedarf, um zu fluoreszieren. Deshalb wurden durchflusszytometrische Messungen einer DiBAC4 -Färbung ohne Antibiotikum (Abbildung 14A) und nach Inkubation mit 100 ng/ml Polymy-xin B für 7 (B) und 15 min (C) durchgeführt. Die ursprünglich DiBAC4-negativen Bakterien (A, links unten) verschoben sich in den oberen linken Quadranten (DiBAC4-Fluoreszenz), wobei die meisten E. coli PI-negativ waren (B). Nach einer längeren Inkubationszeit verschob sich die Bakterienwolke in die beiden unteren Quadranten: Die Bakterien waren DiBAC4 -negativ und PI-positiv (C).
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Abbildung 14: Durchflusszytometrische Analyse der DiBAC4-Färbung zu drei verschiedenen Zeitpunkten.
Auf 108 KBE/ml eingestellte E. coli wurden mit DiBAC4 (final 10 µg/ml) und Propidiumjodid (PI, final 32,5 µg/ml) gefärbt und in einem Forward (FSC) gegen Side Scatter (SSC) Dotplot wurde um die dominante Partikelwolke eine Region gesetzt. Die darin gemessenen Events wurden in FL3 (PI) versus FL1 (DiBAC4) Diagrammen dargestellt. Die Quadranten wurden so gewählt, dass DiBAC4 -fluoreszierende E. coli oberhalb der waagerechten Linie und membrangeschädigte Bakterien (PI-positiv) rechts der senkrechten Linie liegen. A) Gefärbte E. coli ohne Polymyxin B Zusatz. B) Diesel-ben Bakterien aus Probe A nach 7-minütiger Inkubation mit 100 ng/ml Polymyxin B. C) Probe B ge-messen nach weiteren 8 min Inkubation. DiBAC4 = bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine Oxonol.
4.2.3 Einfluss der Fluorochrom-Markierung auf den Anteil membrangeschädig-ter E. coli
Nach einer 15-minütigen Inkubation mit Polymyxin B erwiesen sich 99 % der Bakterien in der PI-Einzelfärbung als membrangeschädigt (Abbildung 15A), während sich dieser Anteil nach Durchführung der Lebend/Tot-Färbungen mit CFSE, TO oder DiBAC4 auf 17 % - 33 % reduzierte (Abbildung 15B-D). Die Lebend/Tot-Färbungen scheinen damit Membranschäden bei E. coli durch Polymyxin B zu verhindern.
Abbildung 15: Durchflusszytometrische Erfassung der durch Polymyxin B induzierten Membranschäden nach verschiedenen Lebend/Tot-Markierungen der E. coli.
DiBAC4 DiBAC4 DiBAC4
PI PI PI
A) ohne Polymyxin B 15 min nach
Poly-myxin B Zugabe 7 min nach
Poly-myxin B Zugabe
B) C)
DiBAC4
FL1 CFSE TO
PI PI PI PI
D) DiBAC4
A) PI B) CFSE C) TO
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E. coli (108 KBE/ml) wurden mit Fluorochromen markiert: A) PI (final 32,5 µg/ml), B) PI und CFSE (final 20 µg/ml), C) PI und TO (final 202,5 ng/ml), D) PI und DiBAC4 (final 10 µg/ml). Nach an-schließender Inkubation mit 500 ng/ml Polymyxin B für 15 min wurden diese durchflusszytometrisch erfasst. In einem Forward (FSC) gegen Side Scatter (SSC) Dotplot wurde um die dominante Partikel-wolke eine Region gesetzt und die darin gemessenen Events in FL3 (PI) versus FL1 (CFSE, TO, DiBAC4) Diagrammen dargestellt. Die Quadranten wurden so gesetzt, dass DiBAC4-fluoreszierende E. coli oberhalb der waagerechten Linie und membrangeschädigte Bakterien (PI-positiv) rechts der senkrechten Linie liegen. PI = Propidiumjodid, CFSE = 6-carboxyfluorescein succinimidyl Ester, TO
= Thiazol Orange, DiBAC4 = bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine Oxonol.
4.2.4 Einfluss der Wachstumszeit auf den Anteil membrangeschädigter E. coli Aufgrund des starken Einflusses der Färbungen auf den Anteil membrangeschädigter Bakteri-en wurde im FolgBakteri-endBakteri-en geprüft, ob dies ebBakteri-enfalls auf die Länge der BakteriBakteri-enwachstumspha- Bakterienwachstumspha-se zutraf.
Abbildung 16: Durchflusszytometrische Analyse der durch Polymyxin B induzierten
Membranschäden nach CFSE-Färbung zu unterschiedlichen Wachstumsphasen.
Der Bakterienkultur (Start-OD600 = 0,02) wurde jede halbe Stunde eine Probe entnommen, die auf 108 E. coli/ml eingestellt und mit CFSE (final 20 µg/ml) und PI (final 32,5 µg/ml) gefärbt wurde.
Nach 15-minütiger Inkubation mit 100 ng/ml Polymyxin B wurden die Bakterien anschließend durch-flusszytometrisch erfasst. In einem Forward (FSC) gegen Side Scatter (SSC) Dotplot wurde um die
- Polymyxin B + Polymyxin B - Polymyxin B + Polymyxin B
A) 30 min
C) 90 min
E) 150 min
CFSE
PI
B) 60 min
D) 120 min
F) 180 min
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dominante Partikelwolke eine Region gesetzt und die darin gemessenen Events in FL3 (PI) versus FL1 (CFSE) Diagrammen dargestellt. Die Quadranten wurden so gesetzt, dass CFSE-fluoreszierende