3.8.1 Stimulation mit LPS und E. coli
MACS-separierte Monozyten und NK-Zellen wurden ebenso wie Neutrophile und MNC in I10F- aufgenommen und in eine 24-Well-Platte (12.2.2) pipettiert (1 x 106 Zellen/Well, 1 ml).
Zu den Zellen wurde LPS (12.2.3) (final 100 ng/ml) oder hitzedeaktivierte E. coli (12.2.6) (final 1 x 107 KBE/Well) gegeben. Dazu wurden die E. coli in PBS auf eine Konzentration von 1 x 108 KBE/ml eingestellt und für 15 min bei 85 °C erhitzt. Bis zur Nutzung wurden sie als 1 ml Aliquot bei -20 °C eingefroren gelagert.
Die Inkubation erfolgte für 4 und 24 h bei 37 °C und 5 % CO2. Als negative Kontrolle dienten Ansätze, bei denen I10F- anstelle des Stimulus hinzugefügt worden war. Anschließend wur-den die Platten bei 300 x g für 5 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und bei -20 °C eingefroren. Die Zellen wurden in MIF-Puffer resuspendiert und zusammen mit PBS-PJ40 am Durchflusszytometer auf ihren Phänotyp und ihre Vitalität geprüft; bei den NK-Zellen wurde zusätzlich eine MIF mit CD335 und CD2, wie in 3.7 beschrieben, durchgeführt.
3.8.2 Priming mit IL-12
NK-Zellen wurden für 20 h mit IL-12 (final 20 ng/ml) inkubiert, während die restlichen NK-Zellen ohne IL-12 kultiviert wurden. Anschließend wurden die Zellen in Parallelansätzen mit LPS (final 100 ng/ml), Ionomycin (final 1 µg/ml) und IL-1β (final 10 ng/ml) für 30 min inkubiert. Außerdem wurden neben einem Kontrollansatz, in dem sich die Zellen in I10F- befanden, bei einem Teil der NK-Zellen die CD335- und CD2-Moleküle auf der Zelloberflä-che kreuzvernetzt. Dazu wurden die NK-Zellen zuerst mit einem CD2- oder
CD335-43
spezifischen Ak für 30 min inkubiert, die in einem zweiten 15-minütigen Inkubationsschritt mit einem goat anti-mouse IgG Ak vernetzt wurden. Die Überstände der 20-stündigen Kulti-vierung und ebenso die der darauf folgenden Stimulation und Kreuzvernetzung wurden, wie in 3.8.1 beschrieben, gewonnen und eingefroren. Die NK-Zellen wurden zudem am Durch-flusszytometer gemessen, um ihre Vitalität und ihren Aktivitätszustand mittels MIF mit einem PE-markierten CD335-spezifischen Ak (1:10) und FITC-gekoppelten CD25-spezifischen Ak (1:50) (3.7) zu überprüfen.
3.8.3 Degranulation von Neutrophilen
Neutrophile Granulozyten besitzen vier verschiedene Granulatypen (primäre, sekundäre, terti-äre Granula und sekretorische Vesikel), die nacheinander in der Zelle gebildet werden und entgegengesetzt ihrer Entstehung degranulieren. Um die neutrophilen Granulozyten (3.4) zu degranulieren, wurden sie mit dem Carrier-Ionophor für Calcium Ionomycin (12.2.3) inku-biert.
Die Neutrophilen wurden in HBSS auf eine Zellzahl von 1 x 107/ml eingestellt. Als Negativ-kontrolle dienten Zellen in HBSS, während die restliche Zellsuspension zusätzlich mit Iono-mycin (final 1 µg/ml) bei Raumtemperatur für 15 min inkubiert wurde. Anschließend wurden die Ansätze für 6 min bei 120 x g und 20 °C zentrifugiert, der Überstand vorsichtig abpipettiert und in Eppendorfgefäße überführt, die bei -20 °C eingefroren wurden. Das Zell-pellet wurde danach in 1 ml PBS resuspendiert, eine Teilprobe wurde entnommen und zu-sammen mit PBS-PJ40 am Durchflusszytometer gemessen.
Um die erfolgte Degranulation der neutrophilen Granulozyten zu überprüfen, wurden die Zel-len vor und nach der Behandlung mit Ionomycin am Durchflusszytometer gemessen. Dabei wurde vor allem auf die Zellgröße/Forward Scatter (FSC) geachtet, da bei erfolgter Degranu-lation eine Größenzunahme zu vermerken wäre, die durch den ausgefransten Zustand der Neutrophilen nach Ausschleusen der Granula verursacht wird.
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Abbildung 3: Durchflusszytometrischer Nachweis der Degranulation von neutrophilen Granulo- zyten.
Die Zellsuspension wurde im Forward Scatter (FSC) gegen FL1 Dotplot auf neutrophile Granulozyten gefenstert. Die Quadranten wurden so gesetzt, dass die Neutrophilen unterhalb der waagerechten und links der senkrechten Linie liegen. Die separierten neutrophilen Granulozyten (1 x 107/ml) wurden vor und nach der Inkubation durchflusszytometrisch erfasst (Forward (FSC) versus Side scatter (SSC) Dotplots). A) Zellen nach der Separation. B) Zellen nach 15 min Inkubation in HBSS. C) Zellen nach 15 min Inkubation in HBSS mit 1 µg/ml Ionomycin. D) Das Balkendiagramm zeigt den signifikanten Anstieg des mittleren FSC-Wertes (Mittelwerte ± SD, n=5) nach Stimulation der Neutrophilen mit Ionomycin.
3.8.4 MAC-T Zelle und Co-Kulturen
Bei den MAC-T Zellen handelt es sich um primäre bovine mammäre alveoläre Zellen, die mit dem großen T-Antigen des Simian-Virus 40 transfeziert wurden, wodurch sie die Eigenschaft behalten sich ungefähr alle 17 h zu teilen. Ihre Morphologie entspricht der von Epithelzellen, wenn sie auf einer Plastikoberfläche gezüchtet werden (HUYNH et al. 1991).
Die MAC-T Zellen (12.2.6) wurden in Zellkulturflaschen in D10F+ (12.2.8.2) bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Bei einer 80 %-igen Konfluenz der Zellen wurde das Kulturmedium ent-fernt und die Zellen wurden mit 5 ml PBS gewaschen. Anschließend wurden 3 ml Accutase® Solution (12.2.3) dazugegeben, um die adhärenten Zellen vom Flaschenboden zu lösen, in-dem sie für 30 min im Wärmeschrank standen. Danach wurde die Zellsuspension in ein 15 ml-Röhrchen gegeben und bei 300 x g für 10 min zentrifugiert; schließlich wurde der Überstand verworfen, das Pellet in 1 ml D10F- (12.2.8.2) resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe einer Bürker Zählkammer (12.2.2) bestimmt.
Die MAC-T Zellen wurden in eine 24-Well-Platte pipettiert, sodass sich pro Well 500.000 Zellen/ml D10F- befanden. Nach 24 h wurden die Überstände nach einer
Zentrifuga-SSC SSC SSC
FSC FSC FSC
A) B) C) D)
vor Degranulation HBSS Ionomycin
MeanFSC
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tion bei 300 x g für 5 min abgenommen und bei -20 °C asserviert. Die Hälfte der Ansätze wurde für 24 h mit LPS (final 100 ng/ml) stimuliert.
Des Weiteren wurde der Einfluss von MNC, Monozyten und NK-Zellen auf die MAC-T Zelle in Co-Kulturen geprüft. Dafür wurden je Well 250.00 MAC-T Zellen mit 500.000 Immunzel-len kombiniert und die Hälfte der Wells mit LPS (final 100 ng/ml) stimuliert. Eine Übersicht über die Stimulationsansätze von MAC-T Zellen, MNC und Monozyten zeigt Tabelle 2. Um die Überstände nach 24 h zu gewinnen, wurde die Zellkulturplatte für 5 min bei 300 x g zent-rifugiert, der Überstand in ein Eppendorfgefäß überführt und bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.
Tabelle 2: MAC-T Ansätze mit MNC und Monozyten in einer 24-Well-Platte.
MAC-T MAC-T MNC MNC Monozyten Monozyten
Zum Schluss wurde eine Co-Kultivierung von E. coli und verschiedenen Immunzellen (mononukleäre Zellen, neutrophile Granulozyten und deren Kombination) durchgeführt. Dazu wurden 500.000 MNC oder Neutrophile und im Fall des kombinierten Ansatzes jeweils 250.000 Zellen in 500 µl I10F- mit 1 x 106 E. coli über 4 h bei 37 °C inkubiert, wobei die Hälfte der Ansätze mit Ionomycin (final 1 µg/ml) stimuliert wurde. Die Co-Kulturen wurden zu fünf verschiedenen Zeitpunkten durchflusszytometrisch analysiert (30 min, 1, 2, 3 und 4 h), wozu jeweils der Inhalt eines Wells mit PI (final 32,5 µg/ml) gefärbt wurde. Zudem wurden 500.000 Zellen (mononukleäre Zellen, neutrophile Granulozyten oder die Kombinati-on der beiden) für 4 h ohne oder mit IKombinati-onomycin (final 1 µg/ml) in 500 µl I0F- inkubiert. An-schließend wurden 1 x 106 E. coli dazu pipettiert und die Ansätze nach Zugabe von PI (final 32,5 µg/ml) nach 30 min, 1, 2, 3 und 4 h durchflusszytometrisch analysiert.
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