NK-Zellen sind neben den neutrophilen Granulozyten und Makrophagen wichtige Effektorzellen der angeborenen Immunabwehr; sie enthalten zudem alle Granula mit antibak-teriellen Peptiden (ANDERSSON et al. 1995). Um zu überprüfen, ob die verschiedenen Zell-populationen in der Lage sind, mithilfe ihrer Mediatoren einen antimikrobiellen Effekt gegen-über E. coli zu vermitteln, wurden unterschiedliche Zellkulturgegen-überstände generiert und mittels Mikrodilution überprüft.
Die zellfreien Kulturüberstände der Monozyten zeigten in der Mikrodilution bei nur einem von fünf Tieren eine signifikante antibakterielle Wirkung. Dies betraf sowohl die für 4 oder 24 h stimulierten LPS-Ansätze als auch für den 4-stündigen Stimulationsansatz mit E. coli (Abbildung 22D). Anhand dieser Ergebnisse ist zu vermuten, dass die antimikrobielle Wir-kung der Monozyten vom Versuchstier abhängt und generell stärker bei stimulierten Zellen ist. Eine Stimulation von Monozyten führt unter anderem zu einer verstärkten Synthese von Stickstoffmonoxid, das es den phagozytierenden Zellen ermöglicht, zytostatisch oder -toxisch gegenüber einer Vielzahl an Pathogenen, wie Viren, Bakterien, Pilze, Protozoen und Helmin-then, zu wirken (MACMICKING et al. 1997). Die Hemmung des bakteriellen Wachstums könnte demnach auf eben jene Synthese zurückzuführen sein. Die verstärkte wachstumshem-mende Wirkung in den LPS-enthaltenen Ansätzen könnte darauf beruhen, dass LPS durch Blutmonozyten erkannt wird, da diese auf ihrer Oberfläche den glycosylphosphatidylinositol-(GP1-)verbundenen LPS-Rezeptor CD14 exprimieren, welcher wiederum mit TLR4 inter-agiert und auf diesem Wege die Erkennung und Beseitigung gramnegativer Bakterien aus dem Blut und Gewebe vermittelt (CALVANO et al. 2003). Da es aber nur bei einem Tier zu
102
diesen statistisch signifikanten Effekten kam, könnten diese auch mit einer Voraktivierung infolge der Separationsmethode begründet werden.
Obwohl Phagozyten über Abwehrmechanismen – AMP und Proteasen – verfügen, ist die Phagozytose über spezifische Rezeptoren und anschließende Eliminierung der Pathogene durch gebildete ROS die wichtigste Funktion der Monozyten (SELSTED et al. 1985; DALE et al. 2008). Es ist daher verständlich, dass die zellfreien Kulturüberstände keine antibakteriel-le Wirkung gegenüber E. coli zeigten, weil die Phagozytose das Vorhandensein der Zellen benötigt. Denkbar wäre, dass das Tier mit messbaren Effekten (Abbildung 22D) im Gegensatz zu den anderen Tieren besonders viele AMP sekretiert hatte.
Antibakterielle Peptide, wie α-Defensine (HNP1-3) und LL-37, wurden in den Überständen stimulierter Lymphozyten (NK-Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen und Monozyten) nachgewiesen und sollen zusammen mit Lysozym und anderen bislang noch nicht charakterisierten Kompo-nenten die extrazelluläre antimikrobielle Aktivität vermitteln (PROKESOVA et al. 1994;
LEVITZ et al. 1995; FROHM et al. 1997). Dass diese Substanzen auch in B- und γδ T-Zellen vorkommen, deutet darauf hin, dass diese neben ihrer adaptiven Funktion ebenfalls direkt bakterizid wirken können. Die MNC waren tierindividuell aus verschiedenen Anteilen der unterschiedlichen Zellpopulationen zusammengesetzt und verfügen aus diesem Grund über mehrere extrazelluläre Mechanismen gegen Pathogene. Trotzdem vermittelten die Überstände der MNC bei vier von sechs Tieren – ähnlich wie bereits bei den Monozyten – keinen statis-tisch signifikanten wachstumshemmenden Effekt auf E. coli, obwohl durchaus antimikrobiel-le Tendenzen erkennbar waren (Abbildung 21A, C und E-F). Die signifikanten antibakteriel-len Effekte von zwei Tieren waren vorwiegend bei den unstimulierten Zellkulturüberständen nachweisbar und nur bei einem LPS-stimulierten Ansatz (Abbildung 21B und D). Folglich führte die Stimulation nicht, wie eigentlich erwartet, zu einer vermehrten Synthese und Frei-setzung antimikrobieller Substanzen.
Tierspezifische Unterschiede in der antibakteriellen Wirkung könnten an der Zusammenset-zung der MNC liegen. Die stärkste Variation gab es bei den NK-Zellen (CV 60 %), wohinge-gen die Variationskoeffizienten der anderen Zellpopulationen (T-Zellen, B-Zellen und
Mono-103
zyten) nur zwischen 10 % - 30 % lagen. Die unterschiedlichen NK-Zell-Anteile hätten die tierindividuellen Unterschiede in der antimikrobiellen Wirkung vielleicht erklären können, da Tier 038 (Abbildung 21B) mit ca. 3 % den zweithöchsten Prozentsatz aufwies, aber Tier 271 (Abbildung 21D) mit 1,5 % NK-Zellen im unteren Drittel lag. Zudem zeigte das Tier 266 mit knapp 4 % NK-Zellen keine wachstumshemmende Wirkung gegenüber den Bakterien (Abbildung 21C). Folglich kann die antimikrobielle Effektivität nicht ausschließlich durch den variablen Anteil an NK-Zellen begründet werden.
Die MNC bestanden neben den bereits erwähnten NK-Zellen ungefähr zur Hälfte aus T-Zellen und zu 25 % aus B-Zellen. Diese Zellen sind nicht darauf spezialisiert, Pathogene direkt zu eliminieren. Dennoch sind CD4- und CD8-positive Zellen in der Lage, MHCII- und MHCI-präsentierte Pathogenepitope zu erkennen und spielen vor allem bei intrazellulär repli-zierenden Bakterien eine wichtige Rolle (KERKSIEK u. PAMER 1999). CD8-positive T-Zellen lysieren durch Freisetzung porenformender Substanzen, wie Perforin, und Apoptose-einleitenden Granzymen aus sekretorischen Granula die Zielzelle (KAGI et al. 1996; HARTY u. BEVAN 1999; HARTY et al. 2000). Die bakterizide Wirkung wird durch Sekretion anti-bakterieller Proteine – Granulysin und Defensine – vermittelt (STENGER et al. 1998; L.
ZHANG et al. 2002). 50 % der CD8-positiven und 25 % der CD4-positiven T-Zellen sind NK-Lysin positiv (ANDERSSON et al. 1995). Nach einer Phorbol Ester/Calcium Ionophor-Stimulation exprimierten nur CD3-positive T-Zellen (CD4-, CD8- und WC1-positiv), aber nicht CD21- oder CD14-positive Zellen Granulysin und NK-Lysin (ENDSLEY et al. 2004).
Warum das durch MNC-Überstände vermittelte Absterben unter den Erwartungen blieb, ist an dieser Stelle unklar. Vielleicht war der Stimulationszeitrahmen von 4 und 24 h unpassend gewählt. Die 4-stündige Inkubation könnte eventuell zu kurz für die Genexpression-Maschinerie (Transkription, Translation, Proteinexpression inklusive Faltung etc.) gewesen sein. Allerdings hätten 24 h dafür ausreichend sein müssen. Der Rest der MNC bestand aus Monozyten, deren wichtigster Abwehrmechanismus gegenüber Pathogenen die Phagozytose ist (GESKE et al. 2002). Wie bereits erwähnt, vermittelten die Ansätze der Kulturüberstände, die nur aus Monozyten bestanden, nur eine geringe Wachstumshemmung der Bakterien. An dieser Stelle sollte demnach die Frage aufgeworfen werden, ob die Monozyten zu den
Stimu-104
lationszeitpunkten weniger AMP produzierten und eher den Mechanismus der Phagozytose zur Erregerbekämpfung verwendet hätten. Laut Literatur produzieren Monozyten AMP erst nach längerer Kultivierung, während sie sich zu Makrophagen entwickeln (MAYHEW u.
WILLIAMS 1974). Retrospektiv betrachtet war die Stimulationszeit für die Monozyten so-wohl in der Reinkultur als auch in der MNC-Kultur eventuell zu kurz, um AMP zu generie-ren. Ferner wäre es vielleicht sinnvoll gewesen, die Co-Kulturansätze mit E. coli, die am Durchflusszytometer gemessen wurden, auch in der Mikrodilution zu überprüfen.
Neutrophile verfügen über verschiedene Abwehrmechanismen gegenüber Pathogenen. Neben der Degranulation, die zur Freisetzung antimikrobieller Substanzen führt, können neutrophile Granulozyten Pathogene phagozytieren, die anschließend in Phagolysosomen durch anti-mikrobielle Peptide und ROS eliminiert werden. Außerdem wird die Bildung von NETs dis-kutiert, die durch freiwerdende DNA-Bestandteile entstehen und Mikroorganismen unschäd-lich machen (MAYER-SCHOLL et al. 2004; AMULIC et al. 2012).
Aufgrund dieser vielfältigen Mechanismen gegen Pathogene ist es überraschend, wie gering die antibakterielle Wirkung bei einigen Versuchstieren war. Bei der Mikrodilution mit zell-freien Kulturüberständen zeigten nur zwei von sechs Tieren eine signifikante antibakterielle Wirkung gegenüber E. coli, sodass ebenfalls bei dieser Zellkultur ein starker tierindividueller Einfluss bestand (Abbildung 23B und C). Auffällig sind zudem die relativ starken Standard-abweichungen bei Tier 035, Tier 266 und vor allem bei Tier 202 (Abbildung 23A, D und E).
Diese kamen dadurch zustande, dass die Überstände an einigen Tagen keinen Effekt auf E. coli hatten, während sie an den übrigen Versuchstagen das Wachstum nachweislich hemm-ten. Eine Erklärung für das unterschiedliche Verhalten der Bakterien konnte nicht gefunden werden, da die Versuche so weit wie möglich standardisiert wurden. Trotzdem ist bereits die Bestimmung der OD600, die zur Berechnung der Inokulummenge genutzt wurde, mit einem gewissen Fehler durch Verwendung eines Photometers behaftet. Die starken Standardabwei-chungen traten aber ausschließlich bei den Neutrophilenüberständen auf, sodass ein Problem mit dem Versuchsaufbau unwahrscheinlich ist.
105
Ein anderer Grund könnte die Verwendung verschiedener Überstände sein, da die Proben der einzelnen Wells nicht gepoolt wurden, sondern pro Tag der Überstand eines Wells benutzt wurde. Ein Zusammenführen der Probenansätze wurde aber auch bei keiner der anderen Zell-kulturen durchgeführt, daher scheint dies ebenfalls nicht der Grund für die starken Schwan-kungen zu sein. Abschließend konnte nicht geklärt werden, wieso bei drei von sechs Tieren tagesabhängig unterschiedliche Ergebnisse gemessen wurden.
Eine signifikante Hemmung bakteriellen Wachstums wurde nur bei Tier 036 und Tier 038 festgestellt, wobei die antimikrobielle Wirkung unabhängig von Stimulans und Stimulations-zeit war (Abbildung 23B und C). Ebenso waren die Ansätze mit den Degranulationsprodukten dieser beiden Tiere die einzigen, die eine signifikant geringere OD600 im Vergleich zur Wachstumskontrolle (I10F-) aufwiesen. Hier ist anzumerken, dass keines der restlichen Tiere die Tendenz antibakterieller Wirkung zeigte (Abbildung 24). Die tierindividuelle Reaktion gegenüber den Bakterien könnte letztlich erneut mit der Voraktivierung der Zellen durch die Separationsmethode und dem Zeitfenster der Stimulation begründet werden. Die Überstände degranulierter Neutrophile konnten durchflusszytometrisch nicht auf ihre antimikrobielle Wirkung gegen E. coli getestet werden, da sie trotz hochtouriger Zentrifugation stark PI-fluoreszierende Partikel enthielten, die sich im FSC/SSC-Dotplot im gleichen Messbereich wie E. coli befanden, was eine abschließende Untermauerung bezüglich der andiskutierten Theorien unmöglich macht.
NK-Zellen – sowohl ruhende als auch aktivierte – wirken in vitro gegen gramnegative und grampositive Bakterien. Dies wird zu einem gewissen Teil durch extrazelluläre Mechanismen, wie die Freisetzung antimikrobieller Faktoren aus den Granula, vermittelt, weil gezeigt wur-de, dass NK-Zell-Überstände antimikrobiell wirksam sind (GARCIA-PENARRUBIA et al.
1989a; GARCIA-PENARRUBIA et al. 1989b). Aufnahmen mit dem Transmissionselektro-nenmikroskop zeigten darüber hinaus, dass keine Bakterien innerhalb der NK-Zellen zu fin-den sind, sodass antibakterielle Effekte nicht durch Phagozytose vermittelt werfin-den (GUR et al. 2013).
106
Die Reinheit der NK-Zellen beim Stimulationsversuch für 4 und 24 h mit LPS und E. coli lag zwischen 66 % - 82 % (CV 11 %), und von den drei Versuchstieren vermittelten die Über-stände unabhängig von den Stimulanzien und Stimulationszeiten eine signifikante wachs-tumshemmende Wirkung auf E. coli. Das Tier mit dem höchsten NK-Zell-Anteil (Abbildung 25C) zeigte dabei die stärksten Effekte. Eines der AMP, das neben Defensinen und Cathelicidinen (LL-37) (AGERBERTH et al. 2000) aus der NK-Zell-Granula freigesetzt wird, ist NK-Lysin. Dabei handelt es sich um ein kationisches Peptid, das eine potente antimikro-bielle Wirkung gegen E. coli aufweist. Das humane Ortholog zu NK-Lysin ist Granulysin und das bovine Bo-Lysin, das von CD4- und CD8-positiven sowie γδ T-Zellen und NK-Zellen exprimiert wird. Im Gegensatz zu den anderen AMP ist NK-Lysin größer (78 Aminosäurereste) und hat eine globuläre Struktur. Die porenformende Wirkung wird, wie bei den Saponin-ähnlichen Proteinen, durch die α-helikale Struktur vermittelt (G. ZHANG et al.
2000; ENDSLEY et al. 2004; M. O. LEE et al. 2014). Diese lysierenden Effektormoleküle der NK-Zell-Granula sind in der Lage gegen Tumorzellen, eine Vielzahl an grampositiven und gramnegativen Bakterien, Pilze, Protozoen und Parasiten zu wirken (ANDERSSON et al.
1995; STENGER et al. 1998; LODOEN u. LANIER 2006), wobei zudem Perforin benötigt wird, damit Granulysin in die Zielzelle gelangen kann, um gegen intrazelluläre Pathogene zu wirken (STENGER et al. 1998; KRENSKY 2000).
Darüber, ob die durch NK-Zell-Überstände vermittelte Wachstumshemmung der E. coli spe-ziell auf das NK-Lysin zurückzuführen ist oder eher auf Defensinen und Cathelicidinen be-ruht, kann an dieser Stelle nur spekuliert werden. Die Ergebnisse legen allerdings die Vermu-tung nahe, dass die Mediatoren, die zu der Wachstumshemmung führten, von den NK-Zellen gebildet wurden, da die deutlichsten Effekte diesbezüglich von NK-Zell-Überständen aus der reinsten Zellkultur stammten.
Die Stimulation mit LPS oder E. coli hatte keinen verstärkenden antimikrobiellen Effekt zur Folge. Ebenso hatte das 20-stündige Priming mit IL-12 keinen Einfluss auf die überstandver-mittelte Wirkung der NK-Zellen. Dabei ist es verwunderlich, dass die Kulturüberstände weni-ger wirksam waren als die der zuvor durchgeführten Versuche. Die Reinheit war mit 43 %, 61 % und 81 % zwar geringer, aber das Tier mit dem geringsten NK-Zellanteil war das
einzi-107
ge, bei dem ein Effekt – zumindest bei den unstimulierten Zellen – nachgewiesen werden konnte (Abbildung 26).
Eine NK-Zell-Stimulation mit IL-12 sorgt in vitro für eine verstärkte Produktion verschiede-ner proinflammatorischer Zytokine, wie IFN-γ, TNF-α und GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) (HALLER et al. 2000; MARCENARO et al. 2005).
Der Anteil antimikrobieller Granulabestandteile kann ebenfalls durch Stimulation beeinflusst werden. Perforin wird konstitutiv von 30 % - 50 % der NK-Zellen exprimiert, wobei der An-teil abhängig vom Versuchstier scheint. Die Expression kann durch IL-15, IL-2/IL-12 oder IL-12/IL-15 gesteigert werden. Zudem hatte eine Aktivierung mit IL-15 im Vergleich zu un-stimulierten Ansätzen innerhalb von 14 h eine 80-fach verstärkte Expression von Granulysin zur Folge (ENDSLEY et al. 2006). Eine Inkubation der NK-Zellen mit IL-2, einem Stimu-lans, das die Proliferation und Aktivierung von T- und NK-Zellen fördert (SMITH 1993), erhöhte das zytotoxische Potential der Zellen, sodass ein 30-facher Anstieg der NK-Lysin spezifischen mRNA gemessen wurde. Demnach sollten die NK-Zellen in den nächsten Ver-suchen anstatt nur mit IL-12 besser mit IL-2, IL-15 oder einer Kombination dieser Substanzen stimuliert werden.
Sehr überraschend war, dass die Überstände der IL-12-geprimten NK-Zellen, unabhängig von der 30-minütigen Inkubation in I10F- oder der weiteren Stimulation mit LPS, Ionomycin oder IL-1β, eine Reduktion bakteriellen Wachstums zur Folge hatten (Abbildung 28A-C). Wieso diese nicht bereits nach 20 h nachzuweisen war, bleibt fraglich. Eine verstärkte antibakterielle Wirkung wäre zudem bei den Ionomycin-stimulierten NK-Zellen zu erwarten gewesen, da diese durch PMA/Ionomycin ihre Granula komplett freisetzen, sodass mehr antimikrobielle Substanzen im Überstand vorliegen sollten (REEFMAN et al. 2010). Leider konnte dies nicht durch die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche bestätigt werden.
Die Zellkulturüberstände von IL-12-geprimten und CD335-kreuzvernetzten NK-Zellen zeig-ten bei allen Tieren antimikrobielle Effekte im Vergleich zum Kontrollansatz (I10F-) (Abbildung 28A-C), wohingegen bei den ungeprimten NK-Zellen die Kreuzvernetzung von CD2, genauso wie der Sekundär-Ak alleine, nur bei dem Tier mit dem höchsten
NK-108
Zellanteil antibakteriell wirkte (Abbildung 28B). Die tierspezifischen Unterschiede sind zum Teil durch das Vorhandensein eines Schwellenwertes für NK-Zellen zu erklären, der über-schritten werden muss, damit ein antibakterieller Effekt nachweisbar ist. Unterhalb dieses Wertes kann kein bakterizider Effekt erreicht werden, nicht einmal durch Erhöhung des Ef-fektor-Zielzell-Verhältnisses auf 1:1. Ein komplettes Absterben der Bakterien bei niedrigen Verhältnissen (1:100) kann hingegen erreicht werden, sobald der Schwellenwert überschritten wird. Dieser Wert schwankt bei GARCIA-PENARRUBIA et al. (1989) zwischen 1200 und 12000 NK-Zellen pro Ansatz und ermöglicht eine quantitative Messung der antibakteriellen Aktivität, da der Schwellenwert von der Konzentration der extrazellulär abgegebenen Fakto-ren abhängig zu sein scheint (GARCIA-PENARRUBIA et al. 1989a). NK-Zellen vermitteln jedoch nicht immer bakterizide Effekte. So wurde für verschiedene Stämme von E. coli ge-zeigt, dass NK-Zellen zwar mit einer Zytokin-Ausschüttung (TNF-α) auf die Bakterien rea-gierten, aber es konnten keine PI-positiven Bakterien detektiert werden (GUR et al. 2013).
In den Vorversuchen konnte gezeigt werden, dass die NK-Zellen wenig voraktiviert waren (CD2-positiv). Allerdings sollten die CD8-Expression und das vermehrte Vorhandensein von CD25 auf der Oberfläche durch eine Kultivierung und/oder Aktivierung steigen, wobei die Literatur diesbezüglich heterogen ist (STORSET et al. 2004; ENDSLEY et al. 2006;
ELHMOUZI-YOUNES et al. 2009). Die Zunahme von CD8 und CD25 nach Aktivierung konnte durch die eigenen Versuche nicht bestätigt werden. Es bleibt unklar, ob in den Versu-chen trotz Stimulation der Zellen keine Aktivierung erreicht wurde oder ob die Aktivierung nicht mit einer Veränderung der CD2-, CD8- und CD25-Expression an der Zelloberfläche korrelierte. Demnach ist es ebenfalls unsicher, inwieweit es zu einer verstärkten Synthese und Freisetzung antimikrobieller Substanzen gekommen ist, falls keine Aktivierung der NK-Zellen stattgefunden haben sollte.
Die Vitalität aller Zellkulturen lag im Durchschnitt nach 4 h bei 12,4 % ± 5,6 % (CV 45,1 %) und nach 24 h bei 30,8 % ± 10,8 % (CV 35,1 %), wobei der Anteil PI-positiver Kulturzellen bei den neutrophilen Granulozyten und NK-Zellen am größten war. Dass eine Abtötung der Bakterien durch Zellinhaltsstoffe, wie z.B. DNA, erfolgte, kann zwar nicht ausgeschlossen werden, da sich die Kulturansätze bei den NK-Zellen aber unabhängig von der Stimulation im
109
Hinblick auf die Vitalität nicht unterschieden und bei den Neutrophilen die Mediumkontrolle trotz verringerter Vitalität im Vergleich keine anderen Ergebnisse lieferte, lässt den Schluss zu, dass die Vitalität der Kulturzellen als Einfluss auf die Abtötung der Bakterien zu vernach-lässigen ist. Die antibakterielle Effektivität der Kulturüberstände ist wahrscheinlich auf ihre inhaltliche Zusammensetzung oder die der jeweiligen Co-Kultivierung und deren variierende Populationsanteile zurückzuführen.
Bei Kühen, die experimentell mit E. coli infiziert wurden, konnte eine verstärkte Expression von TLR2 und 4 sowie von β-Defensinen in den mammären Epithelzellen festgestellt werden (PETZL et al. 2008). Zudem wurde für kultivierte bovine mammäre Epithelzellen nachgewie-sen, dass sie nach LPS-Stimulation die Sekretion von Laktoferrin und IL-8 innerhalb von 24 h hochregulierten (WELLNITZ u. KERR 2004). In dieser Arbeit wurde die bovine mammäre Epithelzelllinie MAC-T benutzt, um zu überprüfen, ob diese nach Stimulation ebenfalls anti-bakterielle Wirkstoffe sekretiert. Zudem wurden neben Ansätzen, die nur eine Zellpopulation enthielten, auch eine Co-Kultivierung von MAC-T Zellen mit drei verschiedenen Immunzel-len (MNC, Monozyten und NK-ZelImmunzel-len) durchgeführt.
Die Überstände der MAC-T und NK-Zell-Kultur vermittelten in der Mikrodilution bei allen Ansätzen eine signifikante Reduktion bakteriellen Wachstums (Abbildung 29C). Die Stimula-tion mit LPS hatte dabei keine gesteigerte antimikrobielle Effektivität zur Folge. Ebenso ver-hielt es sich zwischen den stimulierten und unstimulierten Überständen der Einzel- und Co-Kultivierung von Monozyten und MAC-T Zellen. Signifikante antibakterielle Effekte wurden durch die Co-Kulturansätze und durch MAC-T Zellen alleine nachgewiesen, wohingegen Monozyten alleine keinen Einfluss auf E. coli bewirkten (Abbildung 29B). Davon abwei-chende Ergebnisse wurden in der Mikrodilution durch Überstände der Einzel- und Co-Kultur von MNC mit MAC-T Zellen ermittelt. Diese zeigten bis auf den unstimulierten Co-Kulturansatz eine signifikante Wachstumshemmung der E. coli (Abbildung 29A). Eine Erklä-rung für das Fehlen antimikrobieller Wirkung dieses Ansatzes konnte nicht gefunden werden, da die MAC-T Zellen bei allen anderen Co- und Einzel-Kulturansätzen – unabhängig von der Stimulation mit LPS – antibakterielle Effekte vermittelten (Abbildung 29).
110
Für MAC-T Zellen wurde nachgewiesen, dass sie unabhängig von der eingesetzten LPS-Konzentration (10 ng - 10 µg/ml), die Expression von TLR 2 und 4 hochregulieren und gleichzeitig proinflammatorische Zytokine freisetzen. Folglich ist eine Stimulation durch we-nige Pathogene ausreichend, um MAC-T Zellen zu aktivieren (IBEAGHA-AWEMU et al.
2008). Bei den sekretierten Zytokinen handelt es sich unter anderem um zwei CXC Chemoki-ne (GCP-2 (granulocyte chemotactic protein-2) und IL-8), die zu eiChemoki-ner Rekrutierung von Im-munzellen führen (BOUDJELLAB et al. 2000; YU et al. 2010). Abschließend kann zu den Kulturüberständen der MAC-T Zelle gesagt werden, dass sie antibakterielle Effekte gegen-über E. coli vermitteln, die bereits bei unstimulierten Zellen nachzuweisen sind.
Der Vollständigkeit halber soll erwähnt werden, dass zudem zwei weitere Verfahren zur Be-urteilung antimikrobieller Effekte durchgeführt wurden, die jedoch aus verschiedenen Grün-den letztendlich nicht für die Analyse der bovinen Chemokine oder Zellkulturüberstände nutzt wurden. Die Analyse antimikrobieller Effekte mittels Agardiffusion wurde nicht ge-nutzt, da sowohl bei den LB- als auch bei den Blutagarplatten Probleme beim Erzeugen eines gleichmäßigen Bakterienrasens auftraten. Weiterhin bildeten die Polymyxinkontrollen sehr unregelmäßige Hemmhöfe, in denen zudem vereinzelte Kolonien wuchsen. Der GOA mit den AU-Gelen scheiterte am ungleichmäßigen Laufverhalten der Antibiotika in den Gelen, da die verschieden konzentrierten Proben zu einer einzelnen Bande zusammenflossen. Wurden die Gele dennoch im GOA eingesetzt, konnte keine Hemmung bakteriellen Wachstums detektiert werden, sodass dieses Verfahren nicht weiter etabliert wurde.
Abschließend kann das Fazit gezogen werden, dass im Vergleich zu den anderen getesteten Nachweisverfahren, die Mikrodilution gut anwendbar erscheint, um Zellkulturüberstände von verschiedenen Immunzellen bezüglich ihres Einflusses auf die Bakterienvitalität zu testen.
Dieses Standardverfahren kann im Hinblick auf die höhere Sensitivität nicht durch durch-flusszytometrische Messungen ersetzt werden. Gleichwohl ergibt sich durch die
Dieses Standardverfahren kann im Hinblick auf die höhere Sensitivität nicht durch durch-flusszytometrische Messungen ersetzt werden. Gleichwohl ergibt sich durch die