Die Bestimmung der Menge vitaler Zellen erfolgte mithilfe eines Durchflusszytometers, das unter 3.10.5 genauer beschrieben wird.
3.5.1 Zellzahl mononukleärer Zellen für die MACS
Um Zellklumpen zurückzuhalten, wurden die Zellen im 50 ml-Röhrchen, die in 5 ml MACS-Puffer aufgenommen worden waren (3.3), über einen Filter (12.2.2) in ein
38
15 ml-Röhrchen (12.2.1) gegeben. Anschließend wurde das 50 ml-Röhrchen noch zweimal mit jeweils 5 ml MACS-Puffer gespült und die Flüssigkeit ebenfalls auf den Filter gegeben.
Von dieser Zellsuspension wurden 50 µl entnommen und zusammen mit 50 µl PBS-PJ40 (12.2.8.1) durchflusszytometrisch gemessen, um die vitale Zellzahl zu bestimmen. In der Zwischenzeit wurde das 15 ml-Röhrchen bei 300 x g für 10 min bei 10 °C zentrifugiert, der Überstand abgegossen und die restliche Flüssigkeit mit einer Pipette abgenommen, bevor das Pellet resuspendiert und in MACS-Puffer aufgenommen wurde.
3.5.2 Zellzahl neutrophiler Granulozyten
Von der Zellsuspension im 50 ml-Röhrchen wurden 50 µl entnommen und mit 50 µl PBS-PJ40 am Durchflusszytometer gemessen. Währenddessen wurde die restliche Zellsuspension bei 300 x g für 10 min bei 10 °C zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Zellpellet resus-pendiert und in HBSS (12.2.3) oder I10F- aufgenommen.
3.6 Magnetische Zellseparation
Die MACS (magnetic activated cell sorting) ist eine Methode zur Selektion einzelner Zellpo-pulationen aus dem Blut. Diese erfolgt durch Markierung der Oberflächenstrukturen bestimm-ter Zellgruppen mit einem oder mehreren Ak und magnetischen Beads. Die markierten Zellen werden auf Separationssäulen pipettiert, die eine eisenhaltige Matrix beinhalten, die nach Einbringen der Säule in ein Magnetfeld dafür sorgt, dass die Zellen, die magnetische Beads gebunden haben, zurückgehalten werden. Um die gebundenen Zellen zu eluieren, wird die Säule aus dem Magnetfeld genommen und die Zellen mit Hilfe eines Stempels aus der Säule gedrückt.
3.6.1 Direkte MACS
Bei einer direkten MACS sind die magnetischen MicroBeads bereits an den Ak gekoppelt.
Bei den in dieser Arbeit eingesetzten Beads handelte es sich um CD14-gekoppelte Beads (12.2.3), die zur Durchführung einer positiven Selektion der Monozyten dienten. Aus diesem Grund konnte direkt nach Bestimmung der MNC-Zellzahl (3.5.1) die berechnete Menge an MicroBeads und MACS-Puffer zum resuspendierten Pellet dazugegeben werden. Eingesetzt wurden 10 µl CD14-Beads und 90 µl MACS-Puffer pro 107 Zellen. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei 4 °C im Dunkeln wurde der Ansatz mit 10 ml MACS-Puffer aufgefüllt und bei
39
4 °C und 300 x g für 10 min zentrifugiert. Die Zellen wurden dann für eine positive magneti-sche Separation verwendet.
3.6.2 Indirekte MACS Positive Selektion
Für eine positive Selektion der NK-Zellen wurden diese mit dem spezifischen NK-Zellmarker CD335, der in drei verschiedenen Varianten (unmarkiert, Phycoerythrin- (PE-)markiert, AlexaFluor488-gekoppelt) geprüft wurde. Die Zellsuspension (1 x 108 MNC/ml) wurde pro ml mit 5 µl unmarkiertem CD335-Ak (12.2.4) (Verdünnung 1:200) versetzt. Vom PE-gekoppelten CD335-Ak (12.2.4) wurden 100 µl (1:10) und vom AlexaFluor488-PE-gekoppelten CD335-Ak (12.2.4) 10 µl (1:100) pro ml Zellsuspension eingesetzt. Nach einer 30-minütigen Inkubation im Dunkeln bei 4 °C wurden 10 ml MACS-Puffer dazugegeben und die Zellsus-pension anschließend zentrifugiert (300 x g, 4 °C, 10 min). Der Überstand wurde abgegossen und das Zellpellet resuspendiert. Als Nächstes wurden die magnetischen IgG-MicroBeads (12.2.3) hinzugegeben (10 μl Beads und 90 μl MACS-Puffer pro 107 Zellen) und im Dunkeln bei 4 °C für 20 min inkubiert. Danach wurde das Röhrchen erneut mit 10 ml MACS-Puffer aufgefüllt und bei 300 x g und 4 °C für 10 min zentrifugiert.
Negative Selektion
Bei der negativen Selektion (Depletion) der NK-Zellen wurden sechs verschiedene Ak einge-setzt, von denen fünf unmarkiert und der sechste an PE gekoppelt war. Somit wurden alle anderen Zellpopulationen, außer den NK-Zellen, mit Ak markiert, an welche die Beads bin-den konnten, sodass sie bei der magnetischen Zellseparation auf der Säule verbleiben würbin-den.
Die T-Zell-Markierung erfolgte mittels Ak gegen CD3, CD4 und WC1, die Markierung der Monozyten mit einem CD14-Ak und die B-Zell-Markierung durch Ak gegen MHCII und CD21 (12.2.4). Alle eingesetzten Ak, bis auf den PE-gekoppelten CD21, der 1:100 benutzt wurde, wurden in einer Verdünnung von 1:200 in einer Zellsuspension von 1 x 108 MNC/ml eingesetzt und im Dunkeln für 30 min bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden 10 ml MACS-Puffer zur Zellsuspension gegeben und das Röhrchen bei 4 °C und 300 x g für 10 min zentrifugiert, der Überstand abgegossen und das Zellpellet resuspendiert. Als Nächstes folgte die Zugabe des biotinylierten Sekundär-Ak (12.2.4), der ebenfalls 1:200 in einer
Zellsuspen-40
sion von 1 x 108 MNC/ml eingesetzt wurde, und eine weitere Inkubation für 15 min im Dun-keln bei 4 °C. Danach wurde das Röhrchen wieder mit 10 ml MACS-Puffer aufgefüllt, bei 300 x g und 4 °C für 10 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Pellet resus-pendiert. Darauf folgend wurden die Streptavidin-gekoppelten MicroBeads (12.2.3) dazuge-geben – pro 107 Zellen 10 μl Beads und 90 μl MACS-Puffer – und im Dunkeln für 20 min bei 4 °C inkubiert. Letztlich wurden erneut 10 ml MACS-Puffer dazugegeben und das Röhrchen bei 300 x g und 4 °C für 10 min zentrifugiert.
3.6.3 Magnetische Zellseparation
Während der Zentrifugation wurde die Magnetsäule in die Quadro MACS-Station (12.2.2) eingesetzt und mit 3 ml MACS-Puffer äquilibriert. Nach der Zentrifugation wurde der Über-stand abgegossen, das Zellpellet resuspendiert und in 3 ml (positive Selektion) bzw. 500 μl (Depletion) MACS-Puffer aufgenommen und auf die Magnetsäule gegeben. Im Falle einer positiven Selektion wurde dazu eine LS-Säule (12.2.2) benutzt und für die Depletion eine LD-Säule (12.2.2), auf die maximal 1 x 108 Zellen gegeben werden durften, damit alle markierten Zellen gebunden werden konnten. Danach wurde die Säule dreimal mit MACS-Puffer gespült (jeweils mit 3 ml bei der positiven und 1 ml bei der negativen Selektion) und die gesamte Flüssigkeit im Depletion-Röhrchen aufgefangen. Anschließend wurde die Magnetsäule aus der Halterung genommen, 3 ml (positive Selektion) oder 5 ml (negative Selektion) MACS-Puffer dazugegeben und die Flüssigkeit mit dem dazugehörigen Stempel zügig durch die Säule gedrückt und im Eluat-Röhrchen aufgefangen.
Jeweils 50 μl Zellsuspension aus dem Eluat- und Depletion-Röhrchen wurden zusammen mit 50 μl PBS-PJ40 in ein Eppendorfgefäß (12.2.2) gegeben und zur Bestimmung der Zellzahl am Durchflusszytometer gemessen.
Die restliche Zellsuspension – das Eluat bei der positiven und die Depletion bei der negativen Selektion – wurde bei 300 x g und 4 °C für 10 min zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Pellet resuspendiert und in I10F- aufgenommen.
41