Wenn Pathogene die mechanischen und physikalischen Barrieren des Körpers penetriert ha-ben, aktivieren sie dadurch Zellen des angeborenen Immunsystems. Zu diesen Zellen gehören Granulozyten, Makrophagen und NK-Zellen (K.M. MURPHY et al. 2009).
2.3.1 Monozyten
Monozyten sind ein Teil des angeborenen Immunsystems, gehören zum mononukleären Phagozytensytem und entwickeln sich aus hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmar-kes in Anwesenheit vom colony stimulating factor 1 (VAN FURTH et al. 1972; AUFFRAY et al. 2009). Ihr Durchmesser beträgt 5-20 µm und ihr Aussehen wird von einem großen oft bohnenförmigen Kern geprägt, der nur von wenig Zytoplasma umgeben ist (JONAS et al.
1990). Sie zirkulieren nach Freisetzung aus dem Knochenmark für einige Tage im Blut, bevor sie ins Gewebe einwandern und sich dort weiter zu Makrophagen oder Dendritischen Zellen differenzieren (AUFFRAY et al. 2009; ZIEGLER-HEITBROCK 2014).
Monozyten lassen sich aufgrund ihrer Oberflächenmoleküle (CD14, CD16 und CD163) in drei Subpopulationen einteilen. Nicht klassische Monozyten machen etwa 6 % der Monozyten aus und exprimieren kein CD14, viel CD16 und kein CD163. Dagegen ist CD163 sowohl bei den intermediären als auch den klassischen Monozyten vorhanden. Klassische Monozyten stellen die größte Fraktion mit 90 % dar und sind stark CD14 positiv und CD16 negativ.
Intermediäre Monozyten machen 4 % der Monozyten aus, die CD16 und viel CD14
exprimie-18
ren (HUSSEN et al. 2013; ZIEGLER-HEITBROCK 2014). Während einer Entzündung mig-rieren vor allem die nicht klassischen Monozyten schnell in das betroffene Gewebe entlang eines chemotaktischen Gradienten, der durch Lysate von neutrophilen Granulozyten entsteht (SOEHNLEIN et al. 2009). Dort modulieren Monozyten durch Zytokinsekretion die Immun-antwort und beseitigen die Pathogene durch Phagozytose sowie die Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder AMP (AGERBERTH et al. 2000; AUFFRAY et al. 2009;
SOEHNLEIN et al. 2009).
2.3.2 Neutrophile Granulozyten
Neutrophile Granulozyten, die auch als polymorphkernige Neutrophile (PMN) oder nur als Neutrophile bezeichnet werden, entstehen aus pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark, wobei täglich 5-10 x 1010 Neutrophile freigesetzt werden. Diese hohe Pro-duktionsrate ist nötig, da Neutrophile zu den kurzlebigsten Zellen des Körpers gehören und nur 6-8 Stunden im Blut zirkulieren, bevor sie apoptotisch werden. Die geringe Lebensdauer könnte ein Weg sein, um eine Schädigung des Körpers durch die in den Granula enthaltenen Inhaltsstoffe zu verhindern (SUMMERS et al. 2010; AMULIC et al. 2012). Die Apoptose kann jedoch durch proinflammatorische Zytokine verhindert werden, sodass diese Zellen im Falle einer Entzündung bei der Eliminierung der Pathogene helfen können (WILLIAMS et al.
2011).
Den PMN stehen zur Pathogenbekämpfung eine Vielzahl an Substanzen zur Verfügung, wie z.B. antimikrobielle Peptide, die in den Granula gespeichert vorliegen. Neutrophile beinhalten vier verschiedene Granulatypen (primäre, sekundäre, tertiäre Granula und sekretorische Vesikel), die während ihrer Maturation im Knochenmark gebildet werden. Die Degranulation erfolgt in entgegengesetzter Richtung zu ihrer Entstehung, sodass die sekretorischen Vesikel zwar als letztes gebildet aber als erstes sekretiert werden (GULLBERG et al. 1999; AMULIC et al. 2012). Neben der Degranulation können neutrophile Granulozyten die Pathogene auch phagozytieren, die dann in Phagolysosomen durch AMP oder ROS abgetötet werden. Darüber hinaus sind sie in der Lage Mikroorganismen durch neutrophil extracellular traps (NETs) zu eliminieren (MAYER-SCHOLL et al. 2004; AMULIC et al. 2012). AMP sind vorzugsweise in primären und sekundären Granula gespeichert und zu einem kleinen Anteil auch in den tertiären Granula enthalten. Primäre Granula enthält Myeloperoxidase, ein Enzym, das zur
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Generierung der ROS benötigt wird, und verschiedene AMP, wie Defensine, Lysozym, BPI (Bactericidal/Permeability Increasing Protein) und einige Serinproteasen. Die sekundäre Granula besteht aus Laktoferrin sowie hCAP-18 (human cathelicidin antimicrobial pepti-de 18) und Lysozym, wohingegen die tertiäre Granula vor allem Metalloproteinasen enthält (FAURSCHOU u. BORREGAARD 2003; AMULIC et al. 2012).
Des Weiteren haben PMN eine wichtige chemotaktische Wirkung. Durch Sekretion von Zytokinen oder Freisetzung anderer Mediatoren, die von apoptotischen Zellen stammen, sind Neutrophile in der Lage, andere Immunzellen, wie z.B. Monozyten, zu rekrutieren (SOEHNLEIN et al. 2009).
2.3.3 Natürliche Killerzellen
2.3.3.1 Eigenschaften der NK-Zellen
Bei NK-Zellen handelt es sich um große granuläre Lymphozyten des angeborenen Immunsys-tems. Durch die Produktion von Zytokinen und Interaktion mit antigenpräsentierenden Zellen modulieren NK-Zellen die angeborene Immunität (L. MORETTA et al. 2002b). Der Wirkme-chanismus der NK-Zellen wird durch die Hypothese des „missing self“ von Ljunggren und Kärre beschrieben. Sie zeigten erstmalig auf, dass Zellen, die kein oder nur vermindert MHC-Klasse-I Moleküle exprimieren, von NK-Zellen getötet werden (KARRE et al. 1986). Dane-ben gibt es weitere beschrieDane-bene Strategien der NK-Zell-Regulation wie inhibitorische Rezep-toren, welche die NK-Zellaktivierung über Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs (ITIMs) modulieren (VELY u. VIVIER 1997) oder die „stress-induced self recognition“ über NKG2D (natural-killer group 2, member D) (RAULET 2003). Zirkulierende NK-Zellen sind keine „steady-state killer“, es sei denn, sie durchlaufen zuvor den Prozess einer funktionellen Reifung – NK cell education. Dabei muss neben anderen bisher unbekannten Faktoren das eigene MHC-Klasse-I über inhibitorische Rezeptoren erkannt werden. Die Mehrheit der NK-Zellen im Blut ist daher nicht- oder hypoempfänglich (ANFOSSI et al. 2006; VIVIER 2006).
Zusammenfassend bleibt zur Regulation der NK-Zellen zu sagen, dass sie aktivierende und inhibitorische Rezeptoren besitzen, von denen viele MHC-Klasse-I oder Klasse-I-ähnliche Liganden erkennen, sodass das Gleichgewicht zwischen den Rezeptoren maßgeblich das
Er-20
gebnis der Interaktion von NK-Zellen mit möglichen Zielzellen bestimmt (STORSET et al.
2004).
2.3.3.2 NKp46
Um Untersuchungen an NK-Zellen durchzuführen, ist eine eindeutige Charakterisierung der Zellpopulation notwendig. Dazu wird in den meisten Fällen ein Oberflächenmolekül genutzt, das ausschließlich auf den nachzuweisenden Zellen vorkommt. Diesen Kriterien entspricht das NKp46-Protein (natural killer cell p46-related protein), das so benannt wurde, weil eine 46 kDa große Bande durch einen NKp46-spezifischen monoklonalen Antikörper (Ak) in NK-Zellen präzipitiert wurde. NKp46 wird auch als natural cytotoxicity triggering receptor 1 (NRC1) bezeichnet und ist Teil der Immunglobulin-Superfamilie (PESSINO et al. 1998).
NKp46-positive Zellen weisen kein CD3, CD4, WC1, keinen T-Zell Rezeptor 1 und keine B-Zell- oder Granulozytenmarker auf. Bovines NKp46 wird als Monomer exprimiert und die molekulare Masse (47 kDa) ist mit der von humanem NKp46 vergleichbar (STORSET et al.
2004). Das cluster of differentiation (CD) für NKp46 ist CD335. CD335 wird als Oberflä-chenmolekül dazu verwendet, NK-Zellen von anderen mononukleären Zellen des peripheren Blutes abzugrenzen, z.B. im Durchflusszytometer durch Fluorochrom-markierte Ak (SIVORI et al. 1997; STORSET et al. 2004).
2.3.3.3 NK-Zellen des Rindes
NK-Zellen kommen sowohl in lymphoiden als auch nicht lymphoiden peripheren Geweben vor, etwa im Blut, im Knochenmark, in der Milz, den Lymphknoten, der Leber, der Lunge, dem Omentum, dem Darm und der Plazenta (A. MORETTA et al. 2002a). Die Gewebevertei-lung beim Rind ist mit der bei anderen Spezies vergleichbar. Die NKp46-positiven peripheren Blutzellen haben einen Anteil von 1 % - 10 % an den bovinen MNC, wobei die Menge zwi-schen den Tieren und ihrem Alter variiert (STORSET et al. 2004), da eine signifikant negati-ve Korrelation zwischen der Menge an NK-Zellen und dem Alter besteht. Junge Kälber wei-sen die höchste Menge an NK-Zellen auf (3,5 %), deren Anzahl sukzessiv mit steigendem Alter abnimmt (2,2 %), bis ein Tiefpunkt bei Färsen erreicht wird (1,5 %). Bei adulten Rin-dern erfolgt ein moderater Anstieg auf einen Anteil von 2,1 % NK-Zellen an den peripheren Blutlymphozyten. Dennoch bleibt die relative NK-Zellmenge beim Rind geringer als beim
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Mensch, wobei der altersabhängige Verlauf bei beiden ähnlich ist. Davon ausgenommen sind neugeborene Kälber, denn bei Tieren, die jünger als acht Tage sind, ist der Prozentsatz sehr niedrig (0,1 % - 1,8 %), während beim Mensch um 20 % der Lymphozyten im Nabelschnur-blut NK-Zellen sind. Bei Menschen sinkt der Anteil innerhalb des ersten Lebensjahres auf ca.
11 % ab, bevor er wieder langsam bei Adulten (> 17 Jahre) auf ca. 14 % ansteigt. Diese Diffe-renz wird dadurch erklärt, dass γδ T-Zellen beim Rind ähnliche Funktionen übernehmen wie die NK-Zellen. Der relative Anteil der γδ T-Zellen liegt um 20 % bei Kälbern und unter 10 % bei adulten Rindern; zum Vergleich machen sie bei erwachsenen Menschen unter 5 % der zirkulierenden T-Zellen aus und bei Neugeborenen nur etwa 1 %. Die recht hohe NK-Zellmenge bei Kindern und Kälbern wird als Kompensation für die Unreife des adaptiven Immunsystems angesehen (KULBERG et al. 2004).
2.3.3.4 Bovine NK-Zell-Subpopulationen
Bovine NK-Zellen werden in zwei Subpopulationen unterteilt, die anhand der Expression von CD2 unterschieden werden können. CD2-negative NK-Zellen, die eine kleine Untergruppe von ca. 20 % (STORSET et al. 2004) (15 % - 30 % bei BOYSEN et al. (2006)) im Blut aus-machen, stellen die aktivierten Zellen dar, denn sie proliferieren schneller in der Zellkultur und produzieren eine größere Menge an Interferon γ (IFN-γ). Zudem weisen CD2-negative NK-Zellen vermehrt die beiden Aktivierungsmarker CD44 und CD25 auf. Die Zytotoxizität beider Subpopulationen ist gleich stark. Humane NK-Zellen werden durch die Expression von CD56 charakterisiert, wobei CD56bright Zellen vor allem Chemokine produzieren, wohingegen CD56dim Zellen zytotoxisch effektiver sind. Dadurch ist ein direkter Vergleich zwischen hu-manen und bovinen Subsets nicht möglich, da bovine NK-Zellen kein CD56 exprimieren (COOPER et al. 2001; BOYSEN et al. 2006).
Zwischen 4 % - 15 % der bovinen NK-Zellen sind zudem CD8-positiv. Bovine IL-2-aktivierte NK-Zellen exprimieren CD8 hauptsächlich als αβ-Heterodimer im Gegensatz zu Mensch und Ratte, deren NK-Zellen CD8 α-Homodimere aufweisen, und murinen NK-Zellen, die gar kein CD8 exprimieren. Die funktionelle Rolle von CD8 auf NK-Zellen ist noch unklar, doch nach einer Aktivierung durch IL-2 erhöhen NK-Zellen signifikant ihre CD25- und CD8-Expression, sodass es sich wahrscheinlich um einen Aktivierungsmarker handelt (STORSET et al. 2004).
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2.3.3.5 Rolle der bovinen NK-Zellen bei Infektionen
Das Vorhandensein von Rezeptoren für PAMPs (Pathogen-associated molecular patterns) zeigt das Vermögen angeborener Immunzellen mikrobielles „non self“ zu erkennen und die anschließend sekretierten Zytokine verändern die Qualität der darauf folgenden Immunant-wort (MEDZHITOV u. JANEWAY 1997). NK-Zellen helfen dadurch mit, den Organismus vor viralen, bakteriellen und parasitischen Infektionen zu schützen, indem sie die Pathogenbelastung bei Entzündungen durch ihre eigene Zytotoxizität kontrollieren. Diese entsteht durch Freisetzung zytotoxischer Granulaproteine, wie z.B. Granulysin (KRENSKY 2000), die zusammen mit Perforin in der Lage sind, infizierte Zellen zu lysieren, und eine antimikrobielle Wirkung aufweisen, die vor allem bei intrazellulären Erregern, wie z.B.
Mycobacterium bovis (BOYSEN u. STORSET 2009), eine wichtige Rolle spielt. Des Weite-ren wurden LL-37 und die α-Defensine HNP 1-3 (human neutrophil peptide 1-3) im Über-stand von kultivierten NK-Zellen nachgewiesen, bei denen es sich um antibakteriell wirksame Proteine handelt (AGERBERTH et al. 2000).
Außerdem sind NK-Zellen wichtige Zytokinproduzenten und helfen bei der Immunmodulati-on vImmunmodulati-on Dendritischen Zellen und T-Lymphozyten (STORSET et al. 2004; SMYTH et al.
2005; BOYSEN et al. 2006). Bei einer Infektion werden NK-Zellen mit als eine der ersten Zellen zum Infektionsort rekrutiert, sind eine wichtige Quelle von IFN-γ und anderen Zytokinen zu Beginn der Immunantwort und beeinflussen dadurch die Tendenz der T-Helferzellantwort (Th1 versus Th2) der erworbenen Immunität (RAULET 2004). Des Weite-ren können NK-Zellen selber eine lang anhaltende haptenspezifische Immunantwort in Abwe-senheit von T- und B-Zellen vermitteln, sodass ihre Zugehörigkeit zur angeborenen Immuni-tät überdacht werden sollte (O'LEARY et al. 2006). Eine generelle Übersicht über die Einbin-dung der NK-Zelle in das „Netzwerk Immunsystem“ zeigt AbbilEinbin-dung 1.