Für die geplanten Versuche war es zuerst notwendig, eine Methode zu entwickeln, die es er-möglichte, NK-Zellen aus dem Blut hochrein zu isolieren, um diese dann im zweiten Teil für Kultivierungsversuche einzusetzen.
4.1.1 Anreicherung der bovinen Blut-NK-Zellen mittels MACS
Um Untersuchungen an NK-Zellen durchführen zu können, war es zuvor notwendig den ge-ringen Anteil von ca. 1 % - 5 % NK-Zellen an den mononukleären Zellen des peripheren bo-vinen Blutes durch MACS zu erhöhen. Der Anteil der NK-Zellen an den MNC war abhängig vom Versuchstier (1,1 % - 4,6 %), dessen Alter und dem Tag der Probenentnahme und wurde vorab mittels MIF analysiert (Tabelle 9).
Tabelle 9: NK-Zell-Anteil der Versuchstiere (angegeben als Prozent der MNC).
Tiernummer Geburtsjahr NK-Zellen [%]
035 2003 1,3
036 2011 1,8
038 2011 3,4
131 2003 1,3
202 2011 1,1
266 2011 4,4
271 2012 2,2
411 2010 1,2
430 2009 1,7
493 2000 1,9
567 2006 2,6
660 2008 4,6
Da für eine negative Selektion eine große Menge an Primär-Ak benötigt wird, um alle ande-ren Zellpopulationen zu markieande-ren, wurde eine NK-Zellanreicherung durch positive Selektion mit drei unterschiedlich markierten CD335-Ak durchgeführt.
Mittels positiver MACS konnte lediglich eine Anreicherung auf 4,6 % - 22,0 % (CV 73 %) boviner NK-Zellen erzielt werden (Abbildung 6). Deshalb wurde im Anschluss versucht, durch eine negative Selektion der NK-Zellen die Anreicherung zu erhöhen.
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Abbildung 6: Durchflusszytometrische Messungen der positiven Anreicherung boviner NK-Zellen durch CD335-spezifische Antikörper.
Die Zellen des Eluats einer positiven MACS wurden im Forward (FSC) gegen Side Scatter (SSC) Dotplot auf vitale lymphoide Zellen gefenstert. CD335-positive Zellen liegen rechts der senkrechten Linie. A) FL2/SSC-Dichteplot mit einem PE-markierten CD335-spezifischen Ak (Klon AKS1). B) FL2/SSC-Dichteplot mit einem unmarkierten CD335-spezifischen Ak (Klon AKS1). Nach der Elution von der Säule wurden die Zellen mit einem PE-konjugierten goat anti-mouse IgG Ak inkubiert. C) FL1/SSC-Dichteplot mit einem AlexaFluor488-konjugierten CD335-spezifischen Ak (Klon AKS1).
MACS = magnetic activated cell sorting, Ak = Antikörper, PE = Phycoerythrin.
Nach erfolgter negativer MACS (3.6.2) wurden die drei CD335-Ak (unmarkiert, PE- und AlexaFluor488-gekoppelt) in der MIF bezüglich ihrer Bindungskapazität miteinander vergli-chen (Abbildung 7).
Abbildung 7: Durchflusszytometrische Bestimmung des Bindungsverhaltens der CD335- Antikörper nach negativer MACS.
Depletierte Zellen wurden nach negativer MACS (Ak gegen CD3, CD4, CD14, CD21, MHCII und WC1 mit einem biotinylierten Sekundär-Ak und Streptavidin-gekoppelten MicroBeads) durchflusszy-tometrisch mittels A) CD335-PE-Ak (Klon AKS1), B) unmarkierten CD335-Ak (Klon AKS1), der sekundär mit einem PE-konjugierten goat anti-mouse IgG Ak gefärbt wurde oder C) AlexaFluor488-konjugierten CD335-Ak (Klon AKS1) analysiert. Alle Darstellungen sind im Forward (FSC) gegen Side Scatter (SSC) Dotplot auf vitale lymphoide Zellen gefenstert. CD335-positive Zellen befinden sich innerhalb des rechteckigen Feldes. Die Depletion bestand zu 67 % aus NK-Zellen. MACS = magnetic activated cell sorting, Ak = Antikörper, PE = Phycoerythrin.
SSC SSC SSC
PE PE AlexaFluor488
A) CD335-PE B) CD335-unmarkiert C) CD335-AlexaFluor488
SSC SSC SSC
PE PE AlexaFluor488
A) CD335-PE B) CD335-unmarkiert C) CD335-AlexaFluor488
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Nur durch den AlexaFluor488-gekoppelten CD335-Ak (Abbildung 7C) konnten zwei klar voneinander getrennte Wolken erfasst werden, wohingegen der PE-konjugierte CD335-Ak (A) und der unmarkierte CD335-Ak (B) (der sekundär mit einem PE-gekoppelten Ak markiert wurde) eine Unterscheidung von CD335-positiven und -negativen Zellen erschwerte.
Es wurden verschiedene Ansätze negativer Selektionen getestet, um die NK-Zellen von den übrigen Blutzellen zu separieren. Zuerst wurden nur die größten Zellpopulationen der MNC mit Ak markiert, wie CD4 und CD8 für T-Zellen, CD14 für Monozyten und MHCII für B-Zellen. Das hatte zur Folge, dass auch ein Teil der NK-Zellen verloren ging, da eine Unter-gruppe der NK-Zellen auch positiv ist (Daten nicht gezeigt). Deshalb wurde der CD8-Ak gegen einen anti-CD3 getauscht, um auch die nicht CD4 positiven T-Zellen zu binden.
Daneben wurde ein WC1-Ak für die γδ T-Zellen und zu dem MHCII ein CD21-Ak für die B-Zellen eingesetzt (Abbildung 8A). Es konnte dadurch eine NK-Zell-Reinheit von ungefähr 55 % erreicht werden. Die separierten Zellen waren vor allem mit T-Zellen kontaminiert (Da-ten nicht gezeigt), sodass im nächs(Da-ten Schritt mehrere MACS-Durchgänge hintereinander durchgeführt wurden. Eine erhebliche Steigerung der Reinheit wurde erreicht, wenn nach der Depletion eine positive MACS mit CD335-AlexaFluor488 (77,1 % NK-Zellen) oder eine wei-tere Depletion mit CD8 durchgeführt wurde (73,5 % NK-Zellen). Allerdings führte diese wie-derum zum Verlust der doppelt positiven (CD335 und CD8) NK-Zellen. Durch die Benutzung von einem Biotin-gekoppelten Sekundär-Ak und Streptavidin-MicroBeads wurde eine Rein-heit von 76 % NK-Zellen (Abbildung 8B) erreicht, wodurch gleichzeitig die T-Zell-Verunreinigung stark gesenkt werden konnte. Durch Einsatz eines CD8-Ak im Primär-Ak-Mix wurde ein Anteil von 93 % NK-Zellen erreicht (Abbildung 8C); dies führte aber, wie bereits erwähnt, zum Verlust der CD8-positiven NK-Zellen. Aus diesem Grund wurden die NK-Zellen fortan, wie für Abbildung 8B beschrieben, separiert.
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Abbildung 8: Durchflusszytometrische Analysen der negativen Anreicherung boviner NK-Zellen mittels MACS.
Bovine MNC wurden mit Ak gegen CD3, CD4, CD14, CD21, MHCII und WC1 markiert und nach negativer magnetischer Selektion durchflusszytometrisch mit einem AlexaFluor488-konjugierten CD335-Ak (Klon AKS1) inkubiert und analysiert. Alle Darstellungen sind im Forward (FSC) gegen Side Scatter (SSC) Dotplot auf vitale lymphoide Zellen gefenstert und die CD335-positiven Zellen befinden sich im Rechteck. A) Negative magnetische Separation mit anti-mouse IgG-MicroBeads. B) Negative magnetische Separation mittels sekundärem biotinylierten Ak und Streptavidin-MicroBeads.
C) Zu den sechs oben genannten Ak wurde zusätzlich ein Ak gegen CD8 hinzugefügt; negative mag-netische Separation wie B durch biotinylierten Ak und Streptavidin-MicroBeads. Ak = Antikörper, MACS = magnetic activated cell sorting.
4.1.2 Durchflusszytometrische Charakterisierung boviner NK-Zell-Subpopula-tionen
Um den Aktivierungszustand der NK-Zellen nach Isolierung und Kultivierung zu untersuchen wurden die Zellen mit einem Ak gegen CD335 und mit einem CD2-spezifischen Ak markiert.
Abbildung 9: Durchflusszytometrisch erfasster Aktivierungszustand der NK-Zellen vor und nach 24 h Kultivierung in I10F-.
Die mittels negativer Selektion gewonnenen NK-Zellen wurden mit einem AlexaFluor488-gekoppelten CD335-Ak (Klon AKS1) und einem unmarkierten CD2-spezifischen Ak (Klon CC42) markiert, der sekundär mit einem PE-konjugierten goat anti-mouse IgG Ak nachgewiesen wurde. Bei-de Abbildungen sind im Forward (FSC) gegen SiBei-de Scatter (SSC) Dotplot auf vitale lymphoiBei-de Zellen gefenstert und als FL1 (CD335) versus FL2 (CD2) Dichtediagramme dargestellt. Die Quadranten
SSC SSC SSC
AlexaFluor488 AlexaFluor488 AlexaFluor488
A) anti-Maus IgG-MicroBeads CD8-Ak mit biotinylierten Ak
und Streptavidin-MicroBeads biotinylierter Ak mit
Streptavidin-MicroBeads
B) C)
CD2 CD2
CD335 CD335
A) nach MACS B) nach Kultivierung
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wurden so gesetzt, dass CD2-fluoreszierende Zellen oberhalb der waagerechten Linie und CD335-positive rechts der senkrechten Linie liegen. A) NK-Zellen direkt nach der MACS, B) NK-Zellen nach 24 h Inkubation in I10F- bei 37 °C. Ak = Antikörper, FITC = Fluoreszeinisothiocyanat, MACS = magnetic activated cell sorting.
Die durchflusszytometrische Analyse der NK-Zellen zeigte, dass nach der MACS 74 % der Zellen CD2-positiv waren (Abbildung 9A). Nach Kultivierung der NK-Zellen für 24 h in I10F- bei 37 °C stellten sich die Zellen zu 76 % als CD2-negativ dar (B).
Weiterhin wurde eine durchflusszytometrische Analyse der NK-Zellen in einer CD335/CD8-Doppelfluoreszenz durchgeführt.
Abbildung 10: Durchflusszytometrische Analyse der NK-Zellen anhand der CD335- und CD8-Oberflächenmolekülexpression.
Die durch negative Selektion gewonnenen NK-Zellen von 6 Tieren wurden mit einem AlexaFluor488-gekoppelten CD335-Ak (Klon AKS1) und einem AlexaFluor647-konjugierten CD8-Ak (Klon CC63) gefärbt. Alle Abbildungen sind im Forward (FSC) gegen Side Scatter (SSC) Dotplot auf vitale lym-phoide Zellen gefenstert und als FL1 (CD335) versus FL4 (CD8) Dichtediagramme dargestellt. Die Quadranten wurden so gesetzt, dass CD8-positive Zellen oberhalb der waagerechten Linie und CD335-positive rechts der senkrechten Linie liegen. Ak = Antikörper.
Die durchflusszytometrische Erfassung der NK-Zellen (Abbildung 10) ergab, dass die Menge an doppelt positiven Zellen zwischen 4,2 % und 16,4 % (x = 8,7 % ± 5,3 %, CV 60,9 %) lag.
Bei einigen Tieren (A, B, C und E) stellten sich die CD8-gefärbten NK-Zellen in drei
ver-CD8 CD8 CD8
A ) Tier 038 B) Tier 266 C) Tier 271
CD8 CD8 CD8
CD335 CD335 CD335
D) Tier 493 E) Tier 567 F) Tier 660
CD335 CD335 CD335
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schieden stark fluoreszierenden Wolken dar, wohingegen bei Tier 493 (D) und 660 (F) nur eine Unterscheidung in CD8-positive und CD8-negative Zellen möglich war.