Agarosegelelektrophorese

Um die Größe der DNA- oder RNA-Stränge zu bestimmen und gleichzeitig eine Aufreinigung der PCR-Probe zu bewirken, wurde die Agarosegelelektrophorese benutzt. Da-zu werden Agarosepolymere Da-zu einem Gitter vernetzt, das engmaschiger wird je höher der Agaroseanteil ist. Es sorgt dafür, dass größere Teilchen nach Anlegung eines elektrischen Feldes langsamer zur Anode wandern als kleinere, da sie nicht so leicht durch die Netzstruk-tur gelangen. Anhand eines parallel laufenden Standards kann man die Größe der sich gebil-deten Banden bestimmen.

Die Agarose wurde mit dem Wasser zusammen aufgekocht, bis sie sich aufgelöst hatte, und nach Abkühlen der Lösung wurde das Gel Red™ (12.2.3) dazupipettiert. Anschließend wurde das flüssige Gel in die Kammer (12.2.2) gegossen, der Kamm (12.2.2) eingesetzt und gewar-tet, bis das Gel erhärtet war. Danach wurde in die erste Tasche 3 µl des 100 bp-Standards (12.2.3) pipettiert, während in die anderen Taschen die 20 µl des hergestellten PCR-Produktes gegeben wurden. Das Gel lief bei 85 V für ca. 45 min. Anschließend konnte man mit Hilfe von UV-Licht (12.2.2) die gebildeten Banden sichtbar machen, wobei beachtet wurde, das Gel nicht zu lange zu bestrahlen, da es sonst zu einer Schädigung der Nukleinsäuren kommt.

Die gewünschte Bande wurde mit einem Skalpell (12.2.2) ausgeschnitten. Zur Analyse des CCL20-PCR Produkts mit einer Größe von 370 bp wurde ein 2 %-iges Gel gefahren, während Plasmide mit einer Größe von über 5000 bp auf einem 0,4 %-igem Gel analysiert wurden.

178 12.3.2.6 Gelextraktion

Um an die im Agarosegel enthaltene DNA zu gelangen, wurde eine Extraktion mit dem QIAEX™II Gel Extraktion Kit (12.2.5) durchgeführt. Zuerst wurde das ausgeschnittene Gelstück gewogen und zusammen mit dem dreifachen Gewichtsvolumen an QX1 und 10 μL QIAEX II in ein Eppendorfgefäß gegeben. Dieses wurde für 10 min auf eine 50 °C warme Heizplatte gestellt und dabei alle 2 min gevortext. Anschließend wurde es bei 14,5 x rcf für 30 sec zentrifugiert und der Überstand mit einer Pipette abgenommen. Dann wurde das Pellet resuspendiert und 500 μL QX1 dazugegeben, um Agarosegelreste auszuwaschen. Das Eppen-dorfgefäß wurde erneut bei 14,5 x rcf für 30 sec zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert, das Pellet zweimal hintereinander in 500 μL PE-Puffer resuspendiert und dazwi-schen jeweils für 30 sec bei 14,5 x rcf zentrifugiert. Danach wurde mit einer Pipette möglichst die gesamte Flüssigkeitsmenge abgenommen und das offene Eppendorfgefäß für ca. 15 min zum Trocknen auf den Heizblock (12.1) gelegt, bis das Pellet weiß und undurchsichtig war.

Daraufhin wurden zum Pellet 20 μL Aqua dest. hinzugegeben und gevortext. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Eppendorfgefäß erneut für 30 sec bei 14,5 x rcf zentrifugiert und diesmal wurde der Überstand, der die extrahierte DNA enthielt, in ein PCR-Reaktionsgefäß überführt.

12.3.2.7 Klonierung

Die Klonierung wurde mit Hilfe des TOPO-Cloning-Kits (12.2.5) und dem pCR^®2.1-Vektor (12.2.3) durchgeführt. Dazu wurden die Ansätze nach dem Pipettierschema in Tabelle 19 an-gesetzt und 20 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Währenddessen wurden die One Shot Top 10 E. coli (12.2.6) ca. 10 min auf Eis angetaut und dann der gesamte zuvor pipettierte Ansatz zu den Bakterien gegeben und zusammen für 30 min auf Eis inkubiert. An-schließend wurde der Ansatz für 30 sec auf der 42 °C warmen Heizplatte hitzegeschockt und dann 250 μL super optimal broth with catabolite repression (S.O.C.)-Medium (12.2.3) hinzu-gefügt. Die Zellen wurden daraufhin eine Stunde lang bei 37 °C und 250 rpm wegen der bes-seren Sauerstoffzufuhr in waagerechter Position geschüttelt (12.1). Danach wurden auf vor-gewärmten LB-Agarplatten (12.2.8.3), die Ampicillin, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid (X-Gal) und Isopropyl-β-D-thio5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid (IPTG) (12.2.3) enthielten, jeweils 200 μL und 100 μL der Suspension ausgestrichen und die Platten für 16-18 h in den Wärmeschrank gestellt. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Platten bei 4 °C gelagert.

179 Tabelle 19: TOPO Cloning Ansatz.

Reagenz Volumen

Salt Solution (1,2 M NaCl + 0,06 M MgCl2) 0,5 μL

PCR-Produkt 2,0 μL

TOPO-Vektor 2.1 0,5 μL

Gesamtvolumen 3,0 μL

12.3.2.8 Plasmidextraktion

Um das PCR-Produkt im pCR-Vektor zu analysieren, wurde eine Miniprep (12.3.2.9) mit 5 ml Ausgangskultur durchgeführt. Dazu wurd pro 5 ml LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin (12.2.3) enthielt, eine weiße Kolonie von den Platten gepickt und über Nacht bei 37 °C und 250 rpm geschüttelt. Da für die Transfektion der HEK-Zellen viel mehr CCL20-DNA benötigt wurde als für die Plasmidanalyse, wurde eine Maxiprep (12.3.2.10) mit 80 ml Übernachtkultur durchgeführt.

12.3.2.9 Miniprep

Die Plasmidextraktion erfolgte mittels dem Pure Link Quick Plasmid DNA Miniprep Kit (12.2.5). Dazu wurden die 5 ml der trüben Bakteriensuspension für 2 min bei 14,5 x rcf zent-rifugiert. Der gewonnene klare Mediumüberstand wurde abgenommen und das Pellet in 250 μL Resuspension-Puffer resuspendiert. Als Nächstes wurden 250 μL Lysis-Puffer hinzu-gefügt und das Ganze wurde vorsichtig geschwenkt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Dann wurden 350 μL Präzipitation-Puffer dazupipettiert und das Eppendorfgefäß wurde so lange kräftig geschüttelt bis eine homogene Lösung entstanden war, die für 10 min bei 14,5 x rcf zentrifugiert wurde. Der entstandene Überstand wurde auf die Membran gegeben und diese dann für 1 min bei 14,5 x rcf zentrifugiert, der Durchlauf verworfen und 500 μL Wasch-Puffer 10 auf die Membran gegeben. Nach Inkubation (1 min bei Raumtemperatur) und Zentrifugation (14,5 x rcf für 1 min) wurde der entstandene Durchlauf erneut verworfen, 700 μL Wasch-Puffer 9 auf die Membran gegeben und für 1 min bei 14,5 x rcf zentrifugiert.

Der Durchlauf wurde entsorgt und die Membran wiederum für 1 min bei 14,5 x rcf zentrifu-giert. Anschließend wurde der Membraneinsatz in das Recovery-Tube gesetzt, 75 μL des vor-geheizten TE-Puffers auf die Mitte der Membran gegeben und 1 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membran wurde daraufhin 2 min bei 14,5 x rcf zentrifugiert und der dadurch

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entstandene Durchlauf, der die Plasmid-DNA enthielt, abschließend im Photometer gemessen, um den DNA-Gehalt zu bestimmen.

Nach der Extraktion wurde das Produkt zur Sequenzierung zu SEQLAB nach Göttingen ge-schickt, um zu prüfen, ob es korrekt und vollständig in den Vektor integriert worden war. Da-zu wurden je Probe zwei Ansätze verschickt, die entweder Forward oder Reverse Primer (fi-nal je 20 pmol) enthielten.

Tabelle 20: Sequenzierungsansatz.

Reagenz Volumen Primer 1 µl DNA

Aqua dest.

600-700 ng x µl Gesamtvolumen 7 μL

12.3.2.10 Maxiprep

Für die Benutzung des EndoFree Plasmid Maxi Kit (12.2.5) wurde über Nacht bei 37 °C und 250 rpm eine 80 ml Bakteriensuspension in LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin herge-stellt. Die gesamte Zentrifugation fand in einer auf 4 °C gekühlten Zentrifuge statt. Zunächst wurden die 80 ml auf zwei 50 ml-Röhrchen aufgeteilt und bei 6000 x g für 15 min zentrifu-giert. Der Überstand wurde verworfen, jedes der zwei Bakterienpellets in 5 ml P1 resuspen-diert, anschließend 5 ml P2 dazugegeben und die Röhrchen 4-6-mal geschwenkt. Die Lösun-gen wurden 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, wobei sich die Lösung blau verfärbte, da LyseBlue^® in P2 enthalten war. Dann wurden 5 ml des vorgekühlten P3 zu der Zellsuspension gegeben und die Röhrchen erneut 4-6-mal geschwenkt, wodurch die Lösung wieder farblos wurde und ausflockte. Die beiden Röhrchen wurden zusammen auf einen Membranfilter ge-geben und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde der Verschluss entfernt und die Lösung mithilfe des Kolbens durch den Filter in ein neues 50 ml-Röhrchen gedrückt, so-dass in diesem eine klare Flüssigkeit übrig blieb. Der Flüssigkeit wurden 2,5 ml ER-Puffer beigesetzt, das Ganze wurde 10-mal geschwenkt und anschließend 30 min auf Eis inkubiert.

Kurz vor Ende der Inkubation wurde der Membranfilter mit 10 ml QBT-Puffer äquilibriert

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und danach das Lysat auf den Filter gegeben. Der Durchlauf wurde verworfen und die Memb-ran zweimal mit 30 ml QC-Puffer gespült, wobei der Durchlauf jeweils weggeschüttet wurde.

Die in der Membran enthaltene DNA wurde mit 15 ml QN-Puffer eluiert und in einem neuen Röhrchen aufgefangen. Zum Präzipitieren wurden 10,5 ml Isopropanol hinzugegeben, die Flüssigkeiten gut gemixt und danach für 30 min bei 15.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, das Pellet in 5 ml 70 %-igen Ethanol gelöst und erneut bei 15.000 x g für 10 min zentrifugiert. Danach wurde der Überstand vorsichtig abgenommen und das Pellet an der Luft getrocknet. Abschließend wurde das Pellet in einer angemessenen Menge TE-Puffer gelöst (200 µl) und mit dem Photometer die optische Dichte gemessen, um den DNA-Gehalt zu bestimmen.

12.3.2.11 Restriktionsverdau

Um zu überprüfen, ob das vollständige PCR-Produkt in den Vektor eingefügt worden war, wurde dieses mit Hilfe von Restriktionsenzymen (12.2.3), die an bestimmten Stellen außer-halb des eingefügten Stückes im Vektor schneiden, wieder aus dem Plasmid geschnitten. An-schließend erfolgte eine Größenkontrolle der Schnittstücke durch Gelelektrophorese. Als Kontrolle lief immer eine ungeschnittene Probe mit, um diese mit den verdauten Proben zu vergleichen.

Der Ansatz wurde wie in Tabelle 21 beschrieben angesetzt und 60-90 min bei 37 °C inkubiert und dann ebenso wie die unverdaute Probe mit 4 µl Orange Dye (12.2.3) gemischt und auf ein 0,4 %-iges Agarosegel (12.3.2.5) aufgetragen. In die erste Tasche wurden 3 µl eines 1 kb Größenstandards (12.2.3) pipettiert und in die restlichen Taschen jeweils 25 µl einer Probe.

Das Gel lief bei 85 V bis sich die Banden gut voneinander getrennt hatten, was einer Laufzeit von ca. 80 min entsprach. Das Gel wurde unter UV-Licht begutachtet, die dem Vektor ent-sprechenden Banden ausgeschnitten und, wie in 12.3.2.6 beschrieben, mit dem Gel Extraktion Kit extrahiert und am Photometer gemessen.

182

Die Ligation des geschnittenen und extrahierten Vektors mit der CCL20-DNA erfolgte mit der T4 DNA Ligase (12.2.3) über 3 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Dabei wurden drei verschiedene Ansätze, die jeweils ein anderes Verhältnis von Insert zu Vektor (1:1, 1:3, 3:1) enthielten, pipettiert. Nach den 3 h wurden von jedem Ansatz 5 µl in ein auf Eis für ca. 10 min angetautes One Shot Top10 E. coli-Röhrchen gegeben und dieses, wie bei 12.3.2.7 beschrieben, weiter bearbeitet und auf LB-Platten, die Ampicillin enthielten, ausgespatelt.

183 12.3.2.13 BL21(DE3)-Transformation

Eine Transformation von BL21(DE3) kompetenten E. coli (12.2.6) wurde durchgeführt, damit diese das CCL20 überexprimierten. Dazu wurden zwei Aliquots der BL21(DE3) kompetenten E. coli für ca. 10 min auf Eis aufgetaut und anschließend 5 ng oder 100 ng Plasmid-DNA in ein Aliquot gegeben. Dann wurde das Röhrchen 4-5-mal geschnipst, um den Inhalt miteinan-der zu vermengen. Der Ansatz wurde für 30 min auf Eis inkubiert, danach bei 42 °C für 10 sec hitzegeschockt und wieder für 5 min auf Eis gestellt. Anschließend wurden 250 µl S.O.C.-Medium dazupipettiert und das Röhrchen bei 37 °C und 250 rpm in waagerechter Po-sition für 60 min geschüttelt. Dann wurden 100 und 200 µl des Ansatzes auf aufgewärmten LB-Platten, die 100 µg/ml Ampicillin enthielten, ausgespatelt und für ca. 18 h bei 37 °C in-kubiert. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Platten bei 4 °C im Kühlschrank aufbe-wahrt.

12.3.3 Proteinbiochemische Methoden

12.3.3.1 Proteinexpression in E. coli mittels IPTG-Induktion

Am Vortag wurde eine Kolonie von transformierten E. coli gepickt und in einer 5 ml Vorkul-tur (LB-Medium versetzt mit 100 μg/ml Ampicillin) bei 37 °C über Nacht angezogen. Nach Bestimmung der OD600 wurde eine 50 ml Kultur auf einen OD-Wert von 0,05 mittels der Vorkultur angeimpft und bei 37 °C inkubiert. Bei einer OD600 von 0,4-0,6 wurde eine Probe von 100 µl entnommen und anschließend die Expression mit drei verschiedenen Mengen IPTG (250, 500 und 750 μM) induziert. Die Kultur wurde über 8 h bei 30 °C und 250 rpm geschüttelt und währenddessen jede Stunde 100 μL Bakteriensuspension entnommen. Diese Proben wurden jeweils für 5 min bei 14.000 x g und 4 °C zentrifugiert, der Überstand abge-nommen und 25 μL 4 x Laemmli-Puffer (12.2.8.4) dazugegeben. Dann wurden die Proben 3 min bei 85 °C erhitzt, auf Eis abgekühlt und bis zur Analyse, die mittels SDS-PAGE erfolg-te, bei -20 °C eingefroren. Nachdem die letzte Probe entnommen war, wurde die Bakterien-suspension in ein 50 ml-Röhrchen überführt, bei 3000 x g und 4 °C für 15 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen, das Pellet resuspendiert und mit 50 ml BL21-Puffer (12.2.8.2) aufgefüllt. Dann wurde das Röhrchen erneut mit den zuvor genannten Einstellungen zentrifu-giert und anschließend der Überstand möglichst vollständig abgenommen, bevor das Pellet gewogen und bei -20 °C eingefroren wurde.

184 12.3.3.2 Proteinbestimmung

Um die in den Proben aus 12.3.1.2 und 12.3.3.1 enthaltene Menge an Protein zu bestimmen, wurde ein quantitatives Verfahren in Anlehnung an das von Lowry benutzt. Der Nachweis des BioRad Kits (12.2.5) basiert auf zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen, die zum Farbum-schlag führen. Im ersten Schritt bildet das Protein mit dem Kupfertartrat in alkalischer Lösung Komplexe, die anschließend das gelbe Folin-Ciocalteu-Reagenz reduzieren, sodass es zu ei-nem blauen Farbumschlag kommt. Nach Messung am Spektralphotometer bei 750 nm wird die Proteinmenge anhand einer BSA-Standardreihe (0, 4, 6, 8 und 10 µg) berechnet.

Als erstes wurde die Lösung A‘ angesetzt, indem 20 µl von Substanz S zu 1 ml Reagenz A gegeben wurde. Nach vortexen der Lösung A‘ wurden 25 µl A‘ pro Well einer 96-Well-Flachbodenplatte (12.2.2) pipettiert. Die BSA-Standardreihe wurde als Duplikat angesetzt durch Zugabe von 0, 2, 3, 4 oder 5 µl einer 2 mg/ml BSA-Lösung pro Well. Von den zu tes-tenden Proben wurden jeweils 2 µl pro Well pipettiert und anschließend in alle Wells 200 µl Lösung B gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 5-10 min wurde die Platte im Absorptions Reader (12.1) gemessen.

12.3.3.3 SDS-PAGE

Um einzelne Proteine einer Lösung ihrer Größe nach aufzutrennen, wurde eine SDS-PAGE durchgeführt. Hierbei bildet das Polyacrylamid (12.2.3) eine Gitterstruktur aus, die engma-schiger wird je höher die Konzentration des Polyacrylamids ist. Aufgrund des SDS haben alle Proteine eine einheitlich negative Ladung und wandern nach Anlegen einer elektrischen Spannung zur Anode, sodass sich anhand eines parallel laufenden Standards die Größe der Proteine bestimmen lässt. Durch kurzes Aufkochen der Probe und dem Zusatz von β-Mercaptoethanol im Laemmlipuffer (12.2.8.3) werden die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstrukturen der Proteine aufgelöst, sodass ihr Laufverhalten alleine von der Proteingrö-ße abhängig ist, wobei sich kleinere Proteine schneller und damit weiter durch das Gel bewe-gen als größere.

Zuerst wurde das Gel für die PAGE gegossen, das aus einem Sammel- und Trenngel (Tabelle 23) bestand. Die Proben, die jeweils 20 ng Protein enthielten, wurden mit 4 x Laemmli-Puffer versehen, der dementsprechend in einem Verhältnis von 1:4 eingesetzt wurde. Die Proben

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wurden für 3 min bei 85 °C erhitzt, ehe eine Abkühlung auf Eis stattfand. Daraufhin wurden die Proben 3 min lang bei 14,5 x rcf zentrifugiert, bevor 20 µl pro Tasche pipettiert wurden.

In die erste Tasche kamen 5 µl eines Low Range Standards (12.2.3). Das Gel wurde um eine einheitliche Lauffront zu erhalten 10 min bei 100 V laufengelassen und anschließend weiter bei 150 V, bis die Lauffront das Ende des Gels erreicht hatte.

Tabelle 23: SDS-Gelzusammensetzung für Sammel- und Trenngel.

Reagenz Sammelgel 15 % Trenngel

Polyacrylamid 0,67 ml 13,8 ml

Aqua dest. 2,7 ml 1,7 ml

Puffer, pH 8,8 - 2 ml

Puffer, pH 6,8 500 µl -

10 % APS 40 µl 75 µl

TEMED 8 µl 5 µl

Bromphenolblau 25 µl -

12.3.3.4 Coomassie-Färbung

Bei Coomassie-Brilliant-Blau (12.2.3) handelt es sich um einen Triphenylmethan-Farbstoff, der durch Anlagerung an basische Seitenketten eine unspezifische Anfärbung von Proteinen bedingt. Dabei liegt die Nachweisgrenze bei 0,5 μg Protein pro Bande.

Um die Coomassie-Färbung durchzuführen, wurde das fertige SDS-Gel von der Platte gelöst und in die Coomassie-Färbelösung (12.2.8.4) gelegt, kurz in der Mikrowelle aufgekocht und danach für 30 min auf einem unter dem Abzug befindlichen Schüttler gestellt. Dann wurde die Färbelösung durch Abkippen entfernt, das Gel einige Male mit Aqua dest. gewaschen, bevor es zweimal für jeweils 6 min in der Mikrowelle (12.1) mit 200 ml Aqua dest. gekocht wurde, was zu einer schnelleren Entfärbung des Gels führte. Um das Gel weiter zu entfärben, wurde es für 1-2 h unter dem Abzug in Coomassie-Entfärber (12.2.8.4) geschwenkt, bevor es über Nacht weiter in Aqua dest. entfärbte und anschließend ausgewertet wurde.

12.3.3.5 Silberfärbung

Bei der Silberfärbung handelt es sich um eine von Kerenyi und Gallyas entwickelte Methode, die auf der Entwicklung von Fotografien basiert. Dabei binden die Silberionen an negativ geladene Seitenketten von Proteinen und werden durch Formaldehyd zu elementarem Silber

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reduziert, sodass sich vorhandene Proteine dunkel färben. Die Nachweisgrenze dieser Metho-de liegt bei 0,1-1 ng Protein pro BanMetho-de und ist damit Metho-deutlich sensitiver als die Coomassie-Färbung.

Zum Fixieren der Proteine wurde das fertige SDS-Gel für 30 min in 50 %-igen Ethanol, das mit 10 %-iger Essigsäure versetzt war, geschwenkt und dann dreimal für jeweils 10 min in Aqua dest. auf dem Schüttler rehydriert. Anschließend wurde es erst eine Minute lang in 0,02 % Na2S3O3 geschwenkt und danach zweimal für je 1 min in Aqua dest. gewaschen. Dann wurde es im Dunkeln für 30 min in 0,1 % AgNO3 geschüttelt und danach wieder zweimal für je 1 min mit Aqua dest. gewaschen. Zur Entwicklung wurde es in 2 % Na2CO3, das 45 μL von 37 %-igen Formaldehyd enthielt, geschwenkt; durch die Zugabe von 1 % Essigsäure konnte die Reaktion gestoppt werden.

12.3.3.6 Westernblot

Um Proteine anhand eines Ak nachzuweisen, war es notwendig, die Proteine zuerst vom SDS-Gel auf eine Nitrozellulose Membran (12.2.2) zu transferieren. Es wurde ein Semi-Dry-Verfahren angewendet. Dazu wurden die Membran, das SDS-Gel und die Filterpapierzu-schnitte (12.2.2) in den Transferpuffer (12.2.8.4) gelegt. Zum Blotten wurden drei dicke Fil-terpapiere (12.2.2) übereinandergelegt, darauf die Membran, dann das SDS-Gel – das falten-frei und ohne Luftblasen aufliegen musste – und abschließend wieder drei dicke Filterpapiere gelegt. Der Stapel wurde gut angedrückt und mit etwas Transferpuffer beträufelt, damit der Strom besser geleitet werden konnte. Das Blotgerät (12.1) wurde auf 10 V eingestellt und für 60 min laufengelassen.

12.3.3.7 Immunblot

Nach dem Westernblot wurde die Membran mit einer Pinzette (12.2.2) abgenommen, zum Blocken in 50 ml TBS mit 3 % BSA (12.2.8.4) oder 5 % Magermilchpulver (12.2.8.4) gelegt und für 60 min unter Schwenken darin belassen. Der Primär-Ak (3 ml Penta-His-Ak (12.2.3)) wurde in einer Lösung, die aus gleichen Teilen TBS-Tween (12.2.8.4) und 3 %-igen BSA-TBS oder reinem TBS – falls mit Milch geblockt wurde – bestand, in einer Verdünnung von 1:1000 angesetzt. Nachdem der Ak auf die Oberseite pipettiert worden war, wurde die Membran in Plastik eingeschweißt (12.1) und über Nacht schwenkend (12.1) im Kühlschrank

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inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Membran aus der Plastikhülle entfernt und dreimal für je 15 min schwenkend mit TBS-Tween gewaschen. Anschließend wurde TBS auf die Memb-ran gegeben und nach einigen Minuten abgekippt, bevor 15 ml eines goat anti-mouse IgG-HRP Ak (1:5000 in TBS) (12.2.3), dazugegeben und für 1 h schwenkend inkubiert wurde.

Danach wurde die Membran wieder dreimal für jeweils 15 min schwenkend mit TBS-Tween und zum Schluss erneut mit TBS gewaschen. Zur Entwicklung wurden die beiden Substanzen des SuperSignal West Dura Trial Kit (12.2.5) für den Gebrauch mit horseradish peroxidase labels zu gleichen Anteilen miteinander gemischt und auf eine aufgeschnittene Plastiktüte geträufelt, worauf anschließend die Oberseite der Membran gelegt und der Ansatz für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Danach wurde der Ansatz mithilfe einer Lumines-zenz-Kamera (12.1) ausgewertet.

12.3.4 Ergebnisse der CCL20-Versuche

Durch die Sequenzierung wurde eine 100 %-ige Übereinstimmung des PCR-Produktes mit dem gesuchten CCL20-Gen nachgewiesen. Das PCR-Produkt wurde in einen kompatiblen HEK-Zell-Vektor eingebracht und anschließend wurden damit die HEK-Zellen transfeziert.

CCL20 war jedoch weder in den Kulturüberständen noch in den HEK-Zell-Lysaten durch coomassie- oder silbergefärbte SDS-Gele nachweisbar. Ebenso war keine CCL20-spezifische Bande der Zellüberstände und -lysate der BL21-transformierten E. coli, die nach Auftrennung mittels SDS-PAGE mit einer Coomassie- oder Silberfärbung versehen wurden, nachzuweisen.

Die Transfektion schien erfolgreich zu verlaufen, da die GFP-Kontrolle unter dem Fluores-zenzmikroskop grün fluoreszierte. Aus diesem Grund wurde die HEK-Zell-Transfektion mit einem neuen Plasmid, das ein His-tag enthielt, durchgeführt, sodass anhand eines Western und Immunnblotes ein CCL20-Nachweis möglich gewesen wäre. Allerdings war selbst auf diesem Wege kein Nachweis des CCL20-Proteins in den Überständen oder Zelllysaten der HEK-Zellen möglich, sodass dieser Versuchsteil der Doktorarbeit letztendlich nicht weiter verfolgt wurde.

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13 Danksagung

Nach zwei Jahren bleibt nur noch DANKESCHÖN zu sagen!

Zuerst bedanke ich mich bei Herrn Apl. Prof. Dr. med. vet. Hans-Joachim Schuberth für die Möglichkeit, diese Arbeit in der Immunologie zu schreiben, denn ich hätte mir keinen besse-ren Ort für eine Doktorarbeit vorstellen können. Die Betreuung war herrvoragend und Sie haben es mit konstruktiver Kritik und freundlicher Unterstützung ermöglicht diese Arbeit ent-stehen zu lassen. Sie hatten immer neue Ideen parat, wenn die Versuche keine oder

Zuerst bedanke ich mich bei Herrn Apl. Prof. Dr. med. vet. Hans-Joachim Schuberth für die Möglichkeit, diese Arbeit in der Immunologie zu schreiben, denn ich hätte mir keinen besse-ren Ort für eine Doktorarbeit vorstellen können. Die Betreuung war herrvoragend und Sie haben es mit konstruktiver Kritik und freundlicher Unterstützung ermöglicht diese Arbeit ent-stehen zu lassen. Sie hatten immer neue Ideen parat, wenn die Versuche keine oder

Im Dokument Prüfung der antibakteriellen Aktivität boviner Immunzellen und Chemokine in vitro (Seite 177-0)