Plasmidextraktion

Um das PCR-Produkt im pCR-Vektor zu analysieren, wurde eine Miniprep (12.3.2.9) mit 5 ml Ausgangskultur durchgeführt. Dazu wurd pro 5 ml LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin (12.2.3) enthielt, eine weiße Kolonie von den Platten gepickt und über Nacht bei 37 °C und 250 rpm geschüttelt. Da für die Transfektion der HEK-Zellen viel mehr CCL20-DNA benötigt wurde als für die Plasmidanalyse, wurde eine Maxiprep (12.3.2.10) mit 80 ml Übernachtkultur durchgeführt.

12.3.2.9 Miniprep

Die Plasmidextraktion erfolgte mittels dem Pure Link Quick Plasmid DNA Miniprep Kit (12.2.5). Dazu wurden die 5 ml der trüben Bakteriensuspension für 2 min bei 14,5 x rcf zent-rifugiert. Der gewonnene klare Mediumüberstand wurde abgenommen und das Pellet in 250 μL Resuspension-Puffer resuspendiert. Als Nächstes wurden 250 μL Lysis-Puffer hinzu-gefügt und das Ganze wurde vorsichtig geschwenkt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Dann wurden 350 μL Präzipitation-Puffer dazupipettiert und das Eppendorfgefäß wurde so lange kräftig geschüttelt bis eine homogene Lösung entstanden war, die für 10 min bei 14,5 x rcf zentrifugiert wurde. Der entstandene Überstand wurde auf die Membran gegeben und diese dann für 1 min bei 14,5 x rcf zentrifugiert, der Durchlauf verworfen und 500 μL Wasch-Puffer 10 auf die Membran gegeben. Nach Inkubation (1 min bei Raumtemperatur) und Zentrifugation (14,5 x rcf für 1 min) wurde der entstandene Durchlauf erneut verworfen, 700 μL Wasch-Puffer 9 auf die Membran gegeben und für 1 min bei 14,5 x rcf zentrifugiert.

Der Durchlauf wurde entsorgt und die Membran wiederum für 1 min bei 14,5 x rcf zentrifu-giert. Anschließend wurde der Membraneinsatz in das Recovery-Tube gesetzt, 75 μL des vor-geheizten TE-Puffers auf die Mitte der Membran gegeben und 1 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membran wurde daraufhin 2 min bei 14,5 x rcf zentrifugiert und der dadurch

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entstandene Durchlauf, der die Plasmid-DNA enthielt, abschließend im Photometer gemessen, um den DNA-Gehalt zu bestimmen.

Nach der Extraktion wurde das Produkt zur Sequenzierung zu SEQLAB nach Göttingen ge-schickt, um zu prüfen, ob es korrekt und vollständig in den Vektor integriert worden war. Da-zu wurden je Probe zwei Ansätze verschickt, die entweder Forward oder Reverse Primer (fi-nal je 20 pmol) enthielten.

Tabelle 20: Sequenzierungsansatz.

Reagenz Volumen Primer 1 µl DNA

Aqua dest.

600-700 ng x µl Gesamtvolumen 7 μL

12.3.2.10 Maxiprep

Für die Benutzung des EndoFree Plasmid Maxi Kit (12.2.5) wurde über Nacht bei 37 °C und 250 rpm eine 80 ml Bakteriensuspension in LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin herge-stellt. Die gesamte Zentrifugation fand in einer auf 4 °C gekühlten Zentrifuge statt. Zunächst wurden die 80 ml auf zwei 50 ml-Röhrchen aufgeteilt und bei 6000 x g für 15 min zentrifu-giert. Der Überstand wurde verworfen, jedes der zwei Bakterienpellets in 5 ml P1 resuspen-diert, anschließend 5 ml P2 dazugegeben und die Röhrchen 4-6-mal geschwenkt. Die Lösun-gen wurden 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, wobei sich die Lösung blau verfärbte, da LyseBlue^® in P2 enthalten war. Dann wurden 5 ml des vorgekühlten P3 zu der Zellsuspension gegeben und die Röhrchen erneut 4-6-mal geschwenkt, wodurch die Lösung wieder farblos wurde und ausflockte. Die beiden Röhrchen wurden zusammen auf einen Membranfilter ge-geben und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde der Verschluss entfernt und die Lösung mithilfe des Kolbens durch den Filter in ein neues 50 ml-Röhrchen gedrückt, so-dass in diesem eine klare Flüssigkeit übrig blieb. Der Flüssigkeit wurden 2,5 ml ER-Puffer beigesetzt, das Ganze wurde 10-mal geschwenkt und anschließend 30 min auf Eis inkubiert.

Kurz vor Ende der Inkubation wurde der Membranfilter mit 10 ml QBT-Puffer äquilibriert

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und danach das Lysat auf den Filter gegeben. Der Durchlauf wurde verworfen und die Memb-ran zweimal mit 30 ml QC-Puffer gespült, wobei der Durchlauf jeweils weggeschüttet wurde.

Die in der Membran enthaltene DNA wurde mit 15 ml QN-Puffer eluiert und in einem neuen Röhrchen aufgefangen. Zum Präzipitieren wurden 10,5 ml Isopropanol hinzugegeben, die Flüssigkeiten gut gemixt und danach für 30 min bei 15.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, das Pellet in 5 ml 70 %-igen Ethanol gelöst und erneut bei 15.000 x g für 10 min zentrifugiert. Danach wurde der Überstand vorsichtig abgenommen und das Pellet an der Luft getrocknet. Abschließend wurde das Pellet in einer angemessenen Menge TE-Puffer gelöst (200 µl) und mit dem Photometer die optische Dichte gemessen, um den DNA-Gehalt zu bestimmen.

12.3.2.11 Restriktionsverdau

Um zu überprüfen, ob das vollständige PCR-Produkt in den Vektor eingefügt worden war, wurde dieses mit Hilfe von Restriktionsenzymen (12.2.3), die an bestimmten Stellen außer-halb des eingefügten Stückes im Vektor schneiden, wieder aus dem Plasmid geschnitten. An-schließend erfolgte eine Größenkontrolle der Schnittstücke durch Gelelektrophorese. Als Kontrolle lief immer eine ungeschnittene Probe mit, um diese mit den verdauten Proben zu vergleichen.

Der Ansatz wurde wie in Tabelle 21 beschrieben angesetzt und 60-90 min bei 37 °C inkubiert und dann ebenso wie die unverdaute Probe mit 4 µl Orange Dye (12.2.3) gemischt und auf ein 0,4 %-iges Agarosegel (12.3.2.5) aufgetragen. In die erste Tasche wurden 3 µl eines 1 kb Größenstandards (12.2.3) pipettiert und in die restlichen Taschen jeweils 25 µl einer Probe.

Das Gel lief bei 85 V bis sich die Banden gut voneinander getrennt hatten, was einer Laufzeit von ca. 80 min entsprach. Das Gel wurde unter UV-Licht begutachtet, die dem Vektor ent-sprechenden Banden ausgeschnitten und, wie in 12.3.2.6 beschrieben, mit dem Gel Extraktion Kit extrahiert und am Photometer gemessen.

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Die Ligation des geschnittenen und extrahierten Vektors mit der CCL20-DNA erfolgte mit der T4 DNA Ligase (12.2.3) über 3 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Dabei wurden drei verschiedene Ansätze, die jeweils ein anderes Verhältnis von Insert zu Vektor (1:1, 1:3, 3:1) enthielten, pipettiert. Nach den 3 h wurden von jedem Ansatz 5 µl in ein auf Eis für ca. 10 min angetautes One Shot Top10 E. coli-Röhrchen gegeben und dieses, wie bei 12.3.2.7 beschrieben, weiter bearbeitet und auf LB-Platten, die Ampicillin enthielten, ausgespatelt.