Proteinbiochemische Methoden

12.3.3.1 Proteinexpression in E. coli mittels IPTG-Induktion

Am Vortag wurde eine Kolonie von transformierten E. coli gepickt und in einer 5 ml Vorkul-tur (LB-Medium versetzt mit 100 μg/ml Ampicillin) bei 37 °C über Nacht angezogen. Nach Bestimmung der OD600 wurde eine 50 ml Kultur auf einen OD-Wert von 0,05 mittels der Vorkultur angeimpft und bei 37 °C inkubiert. Bei einer OD600 von 0,4-0,6 wurde eine Probe von 100 µl entnommen und anschließend die Expression mit drei verschiedenen Mengen IPTG (250, 500 und 750 μM) induziert. Die Kultur wurde über 8 h bei 30 °C und 250 rpm geschüttelt und währenddessen jede Stunde 100 μL Bakteriensuspension entnommen. Diese Proben wurden jeweils für 5 min bei 14.000 x g und 4 °C zentrifugiert, der Überstand abge-nommen und 25 μL 4 x Laemmli-Puffer (12.2.8.4) dazugegeben. Dann wurden die Proben 3 min bei 85 °C erhitzt, auf Eis abgekühlt und bis zur Analyse, die mittels SDS-PAGE erfolg-te, bei -20 °C eingefroren. Nachdem die letzte Probe entnommen war, wurde die Bakterien-suspension in ein 50 ml-Röhrchen überführt, bei 3000 x g und 4 °C für 15 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen, das Pellet resuspendiert und mit 50 ml BL21-Puffer (12.2.8.2) aufgefüllt. Dann wurde das Röhrchen erneut mit den zuvor genannten Einstellungen zentrifu-giert und anschließend der Überstand möglichst vollständig abgenommen, bevor das Pellet gewogen und bei -20 °C eingefroren wurde.

184 12.3.3.2 Proteinbestimmung

Um die in den Proben aus 12.3.1.2 und 12.3.3.1 enthaltene Menge an Protein zu bestimmen, wurde ein quantitatives Verfahren in Anlehnung an das von Lowry benutzt. Der Nachweis des BioRad Kits (12.2.5) basiert auf zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen, die zum Farbum-schlag führen. Im ersten Schritt bildet das Protein mit dem Kupfertartrat in alkalischer Lösung Komplexe, die anschließend das gelbe Folin-Ciocalteu-Reagenz reduzieren, sodass es zu ei-nem blauen Farbumschlag kommt. Nach Messung am Spektralphotometer bei 750 nm wird die Proteinmenge anhand einer BSA-Standardreihe (0, 4, 6, 8 und 10 µg) berechnet.

Als erstes wurde die Lösung A‘ angesetzt, indem 20 µl von Substanz S zu 1 ml Reagenz A gegeben wurde. Nach vortexen der Lösung A‘ wurden 25 µl A‘ pro Well einer 96-Well-Flachbodenplatte (12.2.2) pipettiert. Die BSA-Standardreihe wurde als Duplikat angesetzt durch Zugabe von 0, 2, 3, 4 oder 5 µl einer 2 mg/ml BSA-Lösung pro Well. Von den zu tes-tenden Proben wurden jeweils 2 µl pro Well pipettiert und anschließend in alle Wells 200 µl Lösung B gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 5-10 min wurde die Platte im Absorptions Reader (12.1) gemessen.

12.3.3.3 SDS-PAGE

Um einzelne Proteine einer Lösung ihrer Größe nach aufzutrennen, wurde eine SDS-PAGE durchgeführt. Hierbei bildet das Polyacrylamid (12.2.3) eine Gitterstruktur aus, die engma-schiger wird je höher die Konzentration des Polyacrylamids ist. Aufgrund des SDS haben alle Proteine eine einheitlich negative Ladung und wandern nach Anlegen einer elektrischen Spannung zur Anode, sodass sich anhand eines parallel laufenden Standards die Größe der Proteine bestimmen lässt. Durch kurzes Aufkochen der Probe und dem Zusatz von β-Mercaptoethanol im Laemmlipuffer (12.2.8.3) werden die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstrukturen der Proteine aufgelöst, sodass ihr Laufverhalten alleine von der Proteingrö-ße abhängig ist, wobei sich kleinere Proteine schneller und damit weiter durch das Gel bewe-gen als größere.

Zuerst wurde das Gel für die PAGE gegossen, das aus einem Sammel- und Trenngel (Tabelle 23) bestand. Die Proben, die jeweils 20 ng Protein enthielten, wurden mit 4 x Laemmli-Puffer versehen, der dementsprechend in einem Verhältnis von 1:4 eingesetzt wurde. Die Proben

185

wurden für 3 min bei 85 °C erhitzt, ehe eine Abkühlung auf Eis stattfand. Daraufhin wurden die Proben 3 min lang bei 14,5 x rcf zentrifugiert, bevor 20 µl pro Tasche pipettiert wurden.

In die erste Tasche kamen 5 µl eines Low Range Standards (12.2.3). Das Gel wurde um eine einheitliche Lauffront zu erhalten 10 min bei 100 V laufengelassen und anschließend weiter bei 150 V, bis die Lauffront das Ende des Gels erreicht hatte.

Tabelle 23: SDS-Gelzusammensetzung für Sammel- und Trenngel.

Reagenz Sammelgel 15 % Trenngel

Polyacrylamid 0,67 ml 13,8 ml

Aqua dest. 2,7 ml 1,7 ml

Puffer, pH 8,8 - 2 ml

Puffer, pH 6,8 500 µl -

10 % APS 40 µl 75 µl

TEMED 8 µl 5 µl

Bromphenolblau 25 µl -

12.3.3.4 Coomassie-Färbung

Bei Coomassie-Brilliant-Blau (12.2.3) handelt es sich um einen Triphenylmethan-Farbstoff, der durch Anlagerung an basische Seitenketten eine unspezifische Anfärbung von Proteinen bedingt. Dabei liegt die Nachweisgrenze bei 0,5 μg Protein pro Bande.

Um die Coomassie-Färbung durchzuführen, wurde das fertige SDS-Gel von der Platte gelöst und in die Coomassie-Färbelösung (12.2.8.4) gelegt, kurz in der Mikrowelle aufgekocht und danach für 30 min auf einem unter dem Abzug befindlichen Schüttler gestellt. Dann wurde die Färbelösung durch Abkippen entfernt, das Gel einige Male mit Aqua dest. gewaschen, bevor es zweimal für jeweils 6 min in der Mikrowelle (12.1) mit 200 ml Aqua dest. gekocht wurde, was zu einer schnelleren Entfärbung des Gels führte. Um das Gel weiter zu entfärben, wurde es für 1-2 h unter dem Abzug in Coomassie-Entfärber (12.2.8.4) geschwenkt, bevor es über Nacht weiter in Aqua dest. entfärbte und anschließend ausgewertet wurde.

12.3.3.5 Silberfärbung

Bei der Silberfärbung handelt es sich um eine von Kerenyi und Gallyas entwickelte Methode, die auf der Entwicklung von Fotografien basiert. Dabei binden die Silberionen an negativ geladene Seitenketten von Proteinen und werden durch Formaldehyd zu elementarem Silber

186

reduziert, sodass sich vorhandene Proteine dunkel färben. Die Nachweisgrenze dieser Metho-de liegt bei 0,1-1 ng Protein pro BanMetho-de und ist damit Metho-deutlich sensitiver als die Coomassie-Färbung.

Zum Fixieren der Proteine wurde das fertige SDS-Gel für 30 min in 50 %-igen Ethanol, das mit 10 %-iger Essigsäure versetzt war, geschwenkt und dann dreimal für jeweils 10 min in Aqua dest. auf dem Schüttler rehydriert. Anschließend wurde es erst eine Minute lang in 0,02 % Na2S3O3 geschwenkt und danach zweimal für je 1 min in Aqua dest. gewaschen. Dann wurde es im Dunkeln für 30 min in 0,1 % AgNO3 geschüttelt und danach wieder zweimal für je 1 min mit Aqua dest. gewaschen. Zur Entwicklung wurde es in 2 % Na2CO3, das 45 μL von 37 %-igen Formaldehyd enthielt, geschwenkt; durch die Zugabe von 1 % Essigsäure konnte die Reaktion gestoppt werden.

12.3.3.6 Westernblot

Um Proteine anhand eines Ak nachzuweisen, war es notwendig, die Proteine zuerst vom SDS-Gel auf eine Nitrozellulose Membran (12.2.2) zu transferieren. Es wurde ein Semi-Dry-Verfahren angewendet. Dazu wurden die Membran, das SDS-Gel und die Filterpapierzu-schnitte (12.2.2) in den Transferpuffer (12.2.8.4) gelegt. Zum Blotten wurden drei dicke Fil-terpapiere (12.2.2) übereinandergelegt, darauf die Membran, dann das SDS-Gel – das falten-frei und ohne Luftblasen aufliegen musste – und abschließend wieder drei dicke Filterpapiere gelegt. Der Stapel wurde gut angedrückt und mit etwas Transferpuffer beträufelt, damit der Strom besser geleitet werden konnte. Das Blotgerät (12.1) wurde auf 10 V eingestellt und für 60 min laufengelassen.

12.3.3.7 Immunblot

Nach dem Westernblot wurde die Membran mit einer Pinzette (12.2.2) abgenommen, zum Blocken in 50 ml TBS mit 3 % BSA (12.2.8.4) oder 5 % Magermilchpulver (12.2.8.4) gelegt und für 60 min unter Schwenken darin belassen. Der Primär-Ak (3 ml Penta-His-Ak (12.2.3)) wurde in einer Lösung, die aus gleichen Teilen TBS-Tween (12.2.8.4) und 3 %-igen BSA-TBS oder reinem TBS – falls mit Milch geblockt wurde – bestand, in einer Verdünnung von 1:1000 angesetzt. Nachdem der Ak auf die Oberseite pipettiert worden war, wurde die Membran in Plastik eingeschweißt (12.1) und über Nacht schwenkend (12.1) im Kühlschrank

187

inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Membran aus der Plastikhülle entfernt und dreimal für je 15 min schwenkend mit TBS-Tween gewaschen. Anschließend wurde TBS auf die Memb-ran gegeben und nach einigen Minuten abgekippt, bevor 15 ml eines goat anti-mouse IgG-HRP Ak (1:5000 in TBS) (12.2.3), dazugegeben und für 1 h schwenkend inkubiert wurde.

Danach wurde die Membran wieder dreimal für jeweils 15 min schwenkend mit TBS-Tween und zum Schluss erneut mit TBS gewaschen. Zur Entwicklung wurden die beiden Substanzen des SuperSignal West Dura Trial Kit (12.2.5) für den Gebrauch mit horseradish peroxidase labels zu gleichen Anteilen miteinander gemischt und auf eine aufgeschnittene Plastiktüte geträufelt, worauf anschließend die Oberseite der Membran gelegt und der Ansatz für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Danach wurde der Ansatz mithilfe einer Lumines-zenz-Kamera (12.1) ausgewertet.