Aus dem
Forschungsbereich Fortpflanzungsbiologiedes
Forschungsinstitutes fürdieBiologielandwirtschaftlicher Nutztiere,Dummerstorf und dem
Institut fürReproduktionsmedizin derTierärztlichenHochschuleHannover ___________________________________________________________________
Experimentelle Untersuchungen zur Effizienzsteigerung der In-vitro-Produktion von Rinderembryonen
durch Fertilisation aktivierter Oozyten sowie
durch Vorbehandlung züchterisch wertvoller Schlachtkühe mit eCG
INAUGURAL-DISSERTATION
zurErlangungdesGradeseiner
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durchdieTierärztlicheHochschuleHannover
Vorgelegtvon
Ute Marx
aus Trier
Hannover2002
Wissenschaftliche Betreuung: VRPDDr.habil. W.Kanitz Dr.T.Greising
Univ.-Prof.Dr.B.Meinecke
1.Gutachter: Univ.-Prof.Dr.B.Meinecke 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Niemann
Tagder mündlichenPrüfung: 30.Mai2002
Gefördert ausdenMittelnder Dr.Dr.h.c.Karl-Eibl-Stiftung
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNGUNDAUFGABENSTELLUNG ___________________ 13
2 SCHRIFTTUM ___________________________________________ 16
2.1 OogeneseundFollikelentwicklung _________________________ 16 2.1.1 Oozytenreifung___________________________________________ 19 2.1.1.1 UltrastrukturelleVorgängewährendderOozytenreifung ___________ 20 2.1.1.1.1 ReifungsvorgängeimZellkern _______________________________ 21 2.1.1.1.2 ReifungsvorgängeimZytoplasma ____________________________ 22 2.1.1.1.3 Reifungsvorgängeanden Cumuluszellen ______________________ 22 2.1.1.2 ZellphysiologischeAspektederOozytenreifung _________________ 23 2.1.1.2.1 DerMaturation-Promoting-Factor(MPF) _______________________ 24 2.1.1.2.2 DieMitogen-Acitvated-Protein-Kinase (MAPK) __________________ 25 2.1.1.2.3 ZusammenspielvonMPFundMAPK _________________________ 25 2.1.1.3 Oozytenreifung in vitro (IVM) ________________________________ 26 2.1.1.3.1 InduktionderOozytenreifung ________________________________ 27 2.1.1.3.2 Dauer der Reifung in vitro __________________________________ 29 2.1.1.3.3 Reifungsmedien und ihre Zusätze ____________________________ 30 2.1.1.3.3.1 Reifungsmedien __________________________________________ 30 2.1.1.3.3.2 Proteinquellen ___________________________________________ 31 2.1.1.3.3.3 Hormone _______________________________________________ 31 2.1.1.3.3.4 Granulosa-undCumuluszellen ______________________________ 34 2.2 Fertilisation_____________________________________________ 37 2.2.1 Fertilisationinvivo ________________________________________ 37 2.2.1.1 DieKapazitation__________________________________________ 37 2.2.1.2 DieAkrosomenreaktion ____________________________________ 37 2.2.2 Fertilisationinvitro(IVF) ___________________________________ 39 2.3 Kultivierunginvitro(IVC) _________________________________ 41
2.4 Eizellaktivierung und Parthenogenese bei Säugetieroozyten ____ 45 2.4.1 Parthenogenese__________________________________________ 46 2.4.2 SpontaneAktivierung ______________________________________ 46 2.4.2.1 SpontaneAktivierunginvivo ________________________________ 46 2.4.2.2 SpontaneAktivierunginvitro ________________________________ 48 2.4.3 KünstlicheAktivierung _____________________________________ 50 2.4.3.1 Kalzium-IonophoreA23187(Ca-I) ____________________________ 55 2.5 DieBedeutungvonCa2+fürdieBefruchtungundkünstliche
AktivierungvonOozyten__________________________________ 59
3 MATERIALUNDMETHODEN ______________________________ 65
3.1 In-vitro-ProduktionvonEmbryonenimRahmenvon
Aktivierungsexperimenten ________________________________ 65 3.1.1 Versuchstiere ____________________________________________ 65 3.1.2 PräparationderOozytenundIVM ____________________________ 65 3.1.2.1 GewinnungundBehandlungder Ovarien ______________________ 65 3.1.2.2 GewinnungderCumulus-Oozyten-Komplexe(COKs) _____________ 66 3.1.2.3 KlassifikationderCOKs ____________________________________ 66 3.1.2.4 In-vitro-ReifungderCOKs __________________________________ 67 3.1.2.5 Entfernung der Cumuluszellen nach IVM_______________________ 68 3.1.3 PräparationderSpermienundFertilisation _____________________ 68 3.1.3.1 Präparation der Spermien durch das Swim-up-Verfahren __________ 68 3.1.3.2 In-vitro-Fertilisation der Oozyten _____________________________ 69 3.1.4 AktivierungvonEizellenundCOKsmitKalzium-Ionophore A23187 __ 70 3.1.5 In-vitro-KultivierungvonEizellenundEmbryonen ________________ 70 3.1.5.1 IVCvonCOKsnachAktivierungbzw.AktivierungundIVF _________ 71 3.1.5.2 IVCvonEizellennachAktivierungbzw.AktivierungundIVF________ 71
3.2 In-vitro-Produktion von Embryonen selektierter Einzeltiere nach BehandlungmitequinemChoriongonadotropin(eCG) _________ 71 3.2.1 Versuchstiere ____________________________________________ 72 3.2.2 AuswahlderEizelldonoren undVorbehandlungder TieremiteCG
bzw.einemPlacebo_______________________________________ 72 3.2.3 GewinnungundReifungderOozyten _________________________ 73 3.2.4 BestimmungderEstradiol-17ß-KonzentrationimBlutserum der
Eizelldonoren ____________________________________________ 73 3.2.5 BestimmungderProgesteronkonzentrationimBlutserum der
Eizelldonoren ____________________________________________ 75 3.2.6 AuswahlderBullenundIVF_________________________________ 77 3.2.7 IVCderEmbryonen _______________________________________ 77 3.2.8 TiefgefrierkonservierungderEmbryonen _______________________ 78 3.2.9 Embryotransfer __________________________________________ 78 3.2.9.1 AuswahlundVorbehandlung derRezipienten ___________________ 79 3.2.9.2 FrischtransfervonEmbryonen _______________________________ 79 3.2.9.3 TransfervonEmbryonennachTiefgefrierkonservierung ___________ 80 3.3 AuswertungderVersuchsergebnisse _______________________ 80 3.3.1 Zytologische Auswertung der Versuchsergebnisse _______________ 80 3.3.1.1 BeurteilungderEmbryonen _________________________________ 80 3.3.1.2 Fixation, Färbung und mikroskopische Auswertung_______________ 81 3.3.2 Statistische Auswertung der Versuchsergebnisse ________________ 82 4 ERGEBNISSE ___________________________________________ 84
4.1 AktivierungvoninvitrogereiftenRindereizellen mitKalzium- IonophoreunterBerücksichtigungvonReifungszeitund
CumulusbesatzderEizellen, sowieder Zusammensetzungdes Aktivierungsmediums ____________________________________ 84 4.1.1 BestimmungderAktivierungsratevonRinderoozyten,welche24bzw.
30hinvitrogereift undanschließendmit Kalzium-Ionophorebehandelt wurden _________________________________________________ 84
4.1.2 Bestimmung der parthenogenetischen Entwicklungsfähigkeit von Rinderoozyten,welche24bzw.30h invitrogereift,anschließendmit Kalzium-Ionophorebehandeltundinvitrokultiviertwurden _________ 93 4.1.3 BestimmungderEntwicklungsfähigkeitvonRinderoozyten,welche
nacheiner In-vitro-Reifungvon24bzw.30hmitKalzium-Ionophore aktiviertundanschließendbefruchtetund kultiviertwurden_________ 99 4.1.4 BestimmungderEntwicklungsfähigkeitvonRindereizellennach
BehandlungmitKalzium-IonophorevoreinerIn-vitro-Reifung und
anschließendenBefruchtungundKultivierunginvitro ____________ 109 4.2 UntersuchungenzurIn-vitro-Embryonenproduktionvon
züchterischwertvollenEinzeltieren ________________________ 116 4.2.1 VersuchzurSteigerungder Embryonenausbeutenach Behandlung
derEizellspendermitequinemChoriongonadotropin ____________ 116 4.2.1.1 AuswertungderOvarmorphologie ___________________________ 118 4.2.1.2 Auswertung der Estradiol-17β- und Progesteronkonzentrationen im
Blutserum______________________________________________ 119 4.2.1.3 AuswertungderCOKs-Gewinnung __________________________ 120 4.2.1.4 Auswertung der Ergebnisse nach IVM, IVF und IVC _____________ 121 4.2.1.5 AuswertungderErgebnissenachTransferfrischerEmbryonen ____ 126 4.2.1.6 Auswertung von Angaben zum Trächtigkeitsverlauf, zur Geburt und
zur Vitalität der Kälber aus dem Transfer in vitro produzierter
Embryonen_____________________________________________ 127 5 DISKUSSION___________________________________________ 129
5.1 AktivierungsexperimentemitKalzium-Ionophore ____________ 129 5.1.1 BestimmungderAktivierungsrateundparthenogenetischen
EntwicklungsfähigkeitvonOozyten __________________________ 132 5.1.2 BestimmungderEntwicklungsfähigkeitinvitrogereifter,aktivierter
RinderoozytennachIVF __________________________________ 139 5.1.3 BestimmungderEntwicklungsfähigkeitvonRindereizellennach
AktivierungmitKalzium-IonophorevorderIVMundIVF __________ 147
5.2 In-vitro-Produktion von Embryonen selektierter Einzeltiere nach BehandlungmitequinemChoriongonadotropin _____________ 150
6 ZUSAMMENFASSUNG___________________________________ 163
7 SUMMARY ____________________________________________ 167
8 LITERATURVERZEICHNIS________________________________ 171
9 ANHANG ______________________________________________ 239
9.1 VerzeichnisderverwendetenMedien ______________________ 239
10 DANKSAGUNG_________________________________________ 246
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AR Aktivierungsrate
ATP Adenosin-triphosphat
BR Blastozystenrate
BR/EMget. Blastozystenratebezogenauf dieAnzahlgeteilterEmbryonen BR/EZges. Blastozystenratebezogenauf dieAnzahleingesetzterEizellen BRLC BuffaloRatLiverCells
BSA BovinesSerumAlbumin Ca2+ Kalziumionen
Ca-I Kalzium-IonophoreA23187
cADPR ZyklischeAdenosin-diphosphat-Ribose CaM Ca2+/CalmodulinabhängigeKinase cAMP ZyklischesAdenosin-monophosphat cdc2-Gen Celldivisioncycle2-Gen
COK Cumulus-Oozyten-Komplex CR1Medium CharlesRosenkrans1Medium CSF Cytostatic-Factor
DAG Diacylglycerol
DNA Desoxyribonukleinsäure
DPBS phosphatgepufferteSalzlösungnachDulbecco
E2 Estradiol-17β
eCG Equines Choriongonadotropin (früher: PMSG = Pregnant Mare SerumGonadotropin)
ECS ÖstrischesKuhserum EG Ethylenglycol
ER EndoplasmatischesRetikulum
ET Embryotransfer
FCS FetalesKälberserum
FSH FollikelstimulierendesHormon G2-Phase Secondgap-Phase
GnRH GonadotropinReleasing Hormon
G-Protein GTP-bindendes Protein GTP Guanosin-triphosphat GV Germinalvesicle
GVBD Germinalvesiclebreakdown
H+ Wasserstoffionen
H1 Histon1
ICSI IntrazytoplasmatischeSpermieninjektion I.E. InternationaleEinheit
IP3 Inositol-1,4,5-triphosphat IVF In-vitro-Fertilisation IVC In-vitro-Kultivierung
IVM In-vitro-Reifung(In-vitro-Maturation) IVP In-vitro-Produktion
LH LuteinisierendesHormon
MAPK(K) Mitogen-Activated-Protein-Kinase(-Kinase)
mDPBS modifiziertephosphatgepufferteSalzlösung nachDulbecco MEM Eagle´sMinimumEssentialMedium
Mg2+ Magnesiumionen
MPF Maturation-Promoting-Factor M-Phase Mitose-Phase
mRNA messenger-Ribonukleinsäure Na2+ Natriumionen
P4 Progesteron
PA Plasminogenaktivator
PIP2 Phosphatidyl-Inositol-biphosphat PRL Prolaktin
RIA RadioImmuno Assay RNA Ribonukleinsäure
SOFM SyntheticOviductFluidMedium TCM199 TissueCultureMedium 199
TR Teilungsrate
Einleitung 13
1 EINLEITUNG UND AUFGABENSTELLUNG
Die In-vitro-Produktion (IVP) von Rinderembryonen hat sich bis zum heutigen Zeitpunkt nicht nur zu einer wichtigen Basistechnologie für weiterführende wissenschaftliche Untersuchungen (intrazytoplasmatische Spermieninjektion [ICSI], Gentransfer, Kerntransfer, Geschlechtsbestimmung, Präimplantationsdiagnostik) entwickelt, sondern auch ihren festen Platz in der Arbeit von Zuchtverbänden gefunden. Experimentelle Arbeiten zur In-vitro-Reifung (IVM) und -Befruchtung (IVF) von Eizellen, sowie zur In-vitro-Kultivierung (IVC) von Embryonen bilden somit das Bindeglied zwischenreproduktionsbiologischerGrundlagenforschungund praktischer Anwendung derErkenntnisse.
Seit der Geburt des ersten Kalbes nach Embryotransfer in vivo gereifter und in vitro fertilisierter Oozyten im Jahre 1981 (BRACKETT et al. 1982) wurden die Methoden der IVP von Rinderembryonen ständig weiterentwickelt. Im Jahr 1988 gelang es erstmals durch die Verwendung von speziellen Kultivierungsmedien befruchtete Rindereizellen in vitro zu präimplantativen Embryonen weiterzuentwickeln (GOTO et al. 1988; LU et al. 1988). Nachfolgend beschrieben BERG und BREM (1989) ein praktisch nutzbares Verfahren zur In-vitro-Reifung (IVM), -Fertilisation (IVF) und -Kultivierung(IVC)vonRinderembryonen.
Die Erfolgsrate der IVM und IVF erreicht heute 60 bis 80 % (SIRARD und BLONDIN 1996; GANDOLFI et al. 1997; HEYMANN 1997; AVERY et al. 1998; BOUSQUET et al. 1999), die Weiterentwicklungsrate zur Morula oder Blastozyste circa 30-40 % (GREVE et al. 1993a; KESKINTEPE und BRACKETT 1996; FARIN et al. 1997;
SAEKI et al.1997; HAGEMANNet al.1998). Trächtigkeitsraten,dienach Transferin vitro produzierter Embryonen erzielt werden, liegen bei etwa 40-60 % (GREVE et al.
1993b; WURTHet al. 1994; HASLERet al. 1995; REINDERS1995). Deutlicher wird die Effektivität des Verfahrens, wenn man sich vorAugen hält, dass von 10 Eizellen guter Qualität circa 8 erfolgreich gereift und befruchtet werden und sich davon durchschnittlich 3,2 in vitro zur Morula oder Blastozyste weiterentwickeln. Nach Frischtransfer dieser Embryonen resultieren im besten Fall 1,9 Trächtigkeiten. Unter Berücksichtigung einer Abortrate von etwa 8 % (AGCA et al. 1998), und einer
Einleitung 14
perinatalen Sterblichkeit der lebend geborenen Kälber von 14 % (KRUIP und DEN DAAS1997), erzieltmanletztendlichmaximal1,5 lebendeKälber.
Diese Ergebnisse rechtfertigen zwar eine praktische Anwendung der IVP von Rinderembryonen, zeigen jedochauch dieNotwendigkeit einerintensiven Forschung zurSteigerungderEffizienz desVerfahrens.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde angestrebt, die Effizienz des IVP-Verfahrens auf zweiunterschiedlichenWegenzuverbessern.
Im ersten Versuchsabschnitt wurdeversucht, auf den Aktivierungsmechanismus von Eizellen stimulierend einzuwirken. Die Aktivierung von Eizellen ist ein biologisches Phänomen, am Beginn der Embryonalentwicklung. Bei der Befruchtung wird die Aktivierung der Eizelle durch die Fusion des Spermiums mit der Eizellmembran ausgelöst. Es finden eine Reihe von zellphysiologischen und biochemischen Vorgängen in der Oozyte statt, die letztendlich die Arretierung der meiotischen Reifeteilung in der Metaphase II aufheben, und so die Vorkernbildung, als Voraussetzung füreineerfolgreicheBefruchtung,ermöglichen.
Ein wichtigerProzessinnerhalb der Aktivierungskaskadeist deroszillierende Anstieg der Ca2+-Konzentration in der Oozyte, der durch die Fusion der beiden Gameten induziert wird (Ca2+: Kalziumionen; FISSORE und ROBL 1993). Experimentell kann dieser Ca2+-Anstieg entweder durch direkte Injektion der Ionen in das Ooplasma
(FULTON und WHITTINGHAM 1978) oder durch den Einsatz einer Ca2+-transportierenden Ionophore erreicht werden (STEINHARDT et al. 1974).
Da der Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration für die Aktivierung der Eizelle und die Induktion der Embryonalentwicklung bei der Befruchtung eine sehr große Rolle spielt, kann vermutet werden, dass eine Erhöhung des intrazytoplasmatischen Ca2+-SpiegelsimRahmen vonBefruchtungsexperimentennichtohneEinflussauf die Effizienz desIVP-SystemsbeimRindbleibt.
Aus diesem Grunde wurde die Eizellaktivierung mit Kalzium-Ionophore A23187 (Ca-I) im Rahmen der IVF in den Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit gestellt. Es wurde untersucht, ob die Befruchtung aktivierter bzw. nicht aktivierter Eizellen zu Unterschieden in der präimplantativen Embryonalentwicklung, gemessen an der
Einleitung 15
Blastozystenrate, führt. Die Aktivierung der Eizellen bzw. Cumulus-Oozyten- Komplexe (COKs) erfolgte durch Behandlung mit Kalzium-Ionophore (Ca-I) vor bzw.
nach derIVM.Unter BerücksichtigungvonReifungszeit undIonenzusammensetzung des Aktivierungsmediums wurde die Entwicklungskompetenz aktivierter, fertilisierter Eizellen undCOKs bestimmt undihrerparthenogenetischenEntwicklungskompetenz gegenübergestellt.
Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der praktischen Anwendung des IVP-Verfahrens bei züchterisch wertvollen Einzeltieren im Rahmen der routinemäßigen Embryonenproduktion. Es wurde versucht, durch eine Vorbehandlung der Eizellspender mit equinem Choriongonadotropin (eCG) die Entwicklungsfähigkeit der gewonnenen Oozyten im verwendeten IVP-System zu verbessern.
Schrifttum 16
2 SCHRIFTTUM
2.1 OogeneseundFollikelentwicklung
Der Begriff Oogenese beschreibt alle Vorgänge, in deren Verlauf weibliche Urgeschlechtszellen (primordiale Keimzellen) nach dem Einwandern in die Gonadenanlage zu befruchtungsfähigen Eizellen (Ova) heranreifen. Die Oogenese kann ineinenprä-undeinen postnatalenAbschnitt unterteiltwerden.
Beim Rindsetzt dieOogenese bereitsimfrühen embryonalen Stadiumein. Während und nach der Einwanderung in die Gonadenanlage beginnt die mitotische Vermehrung der primordialen Keimzellen. Durch Interzellularbrücken werden sie zu Keimballen verbunden und ihre Differenzierung zu Oogonien beginnt (RÜSSE und SINOWATZ 1991). Zum Zeitpunkt der Geburt ist die proliferative, mitotische Vermehrung der diploiden Oogonien abgeschlossen. Beim Rind können mehr als zwei Millionen Keimzellen entstehen. Im Verlauf der Oogenese degenerieren allerdings 95 % von ihnen, so dass ein Kalb zum Zeitpunkt der Geburt im Durchschnitt nurnochüberca.200 000Oozytenverfügt(ERICKSON1966).
Ein Teil der Oogonien geht bereits ab dem 75. bis 80. Tag der Gravidität in die Meiose über (LAVOIR et al. 1992). AusMesenchymzellen des Reteovarii bildet sich eine einzellige Schicht aus Granulosazellen um die Eizellen. Es entstehen primäre Oozyten mit einer Größe von circa 30-50 µm, die in den Primärfollikeln liegen (RÜSSE 1983). Nachdem sich die DNA (Desoxyribonukleinsäure) repliziert hat, durchlaufen die Primäroozyten die Stadien des Leptotän, Zygotän und Pachytän der Prophase der ersten meiotischen Teilung. Im Diplotän wird die Meiose der Primäroozyten für eine längere Ruhephase, dem sogenannten Dictyotänstadium arretiert. Diese Ruhephase wird erst mit der präovulatorischen Reifungsinduktion unterbrochen (LEIBFRIED-RUTLEDGE et al. 1989). RNA (Ribonukleinsäure) und Proteine werden in der Eizelle weiterhin synthetisiert. So wird ein Vorrat für die spätere Embryonalentwicklung angelegt (SIRARD et al. 1992; SIRARD et al. 1998).
Während der weiteren Entwicklung der Eizelle und der Follikulogenese arretiert der Zellkernder EizelleimDictyotänstadiumderProphase I.
Schrifttum 17
Die Follikelpopulation eines Tieres unterteilt sich in einen ruhenden Pool aus Primordialfollikeln und einen wachsenden Pool aus Primär-, Sekundär- und Tertiärfollikeln (SCHUFFENHAUER et al. 1987). Die Bildung der Primordialfollikel ist bis zur Geburt abgeschlossen. In einem dynamischen Prozess treten immer wieder Primordialfollikel in die zweite Reifeperiode über. Die primordialen Keimzellen vergrößern und differenzieren sich. Das umgebende flache Follikelepithel wird kubisch und der Primordialfollikel zum Primärfollikel. Proliferiert das Epithel und wird mehrschichtig, spricht man von Sekundärfollikeln (BECKERS et al. 1996). Von der Eizelle selbst und/oder den Granulosazellen werden Glycoproteine (ZP1, ZP2, ZP3) synthetisiert, aus denen die Zona pellucida gebildet wird (BLEIL und WASSARMAN 1980a; SHIMIZU et al. 1983; BECKERS et al. 1996). Ihre Funktion besteht in der speziesspezifischen Spermienerkennung (ZP3), in der Auslösung der Spermienkapazitation und Akrosomenreaktion während der Befruchtung sowie in einer schützenden Hülle fürdie Oozyte(BECKERS et al.1996). DerSekundärfollikel wird somit aus der Oozyte, die von der Zona pellucida und einer mehrlagigen Granulosazellschicht umgeben ist, gebildet. Bei der Weiterentwicklung zum Tertiärfollikel gruppieren sich Thekazellen um den Follikel. Die Granulosazellen beginnen mit der Sekretion von Follikelflüssigkeit, was zur Bildung eines Antrums führt. In diesem Hohlraum wird die Oozyte exzentrisch in einen Granulosazellhaufen, den Cumulus oophorus, eingebettet. Der endgültige Durchmesser dieser Tertiärfollikel beträgt 1,8-2 mm (BECKERS et al. 1996). In dieser Wachstumsphase nimmt auch der Zellkern der Oozyte erheblich an Größe zu. Er wird aufgrund seiner prominenten Erscheinung auch als Germinalvesikel (GV) bezeichnet. Die Chromosomen liegen als diffuse Bivalente im Kernplasma vor (CROZET 1989;
WASSARMAN und ALBERTINI 1994) und durch die ausgeprägte RNA-Synthese ist mindestenseinNukleolusausgebildet.
Die Aktivierung der Primordialfollikel und das frühe Follikelwachstum sind noch nicht hormonabhängig (RÜSSE und SINOWATZ 1991), denn auch in hypophysektomierten Tieren kann ein Follikelwachstum beobachtet werden (JONES und KROHN 1961; FADDY et al. 1976; EDWARDS et al. 1977). Die Mechanismen dafür sind noch weitgehend unklar (BUCCIONE et al. 1990). Es wird ein von der
Schrifttum 18
Oozyte ausgehendes Messenger-System oder eine genetische Programmierung der Eizellevermutet, überdiedieAbläufe gesteuertwerden(BAKER1972).
Im Zyklus geschlechtsreifer Tiere wird das periodische Heranreifen einer kleinen Anzahl von Tertiärfollikeln hormonell kontrolliert (BRITT 1988; FORTUNE 1994).
DRIANCOURT (1995) berichtet von einer Gonadotropinabhängigkeit der Follikel ab einem Durchmesser von 2 mm. Bei Rindern wachsen die Follikel innerhalb eines Zyklus in 2-4 Reifungswellen heran (ADAMS 1994; BO et al. 1995; WOERNER 1997). Dabei überwiegen Zyklen mit zwei- oder dreiwelliger Follikelentwicklung.
Mittels histologischer Untersuchungen von Ovarien wurde erstmals die Hypothese aufgestellt, dass das Follikelwachstum beim Rind wellenförmig abläuft (RAJAKOWSKI 1960). Dies wird durch zahlreiche ultrasonographische Untersuchungen belegt (PIERSON und GINTHER 1987; FORTUNE et al. 1988;
KASTELIC 1994). Während einer Welle wächst jeweils ein Follikel zu einem dominanten Follikel heran. Ein dominanter Follikel hat einen hemmenden Einfluss auf untergeordnete Follikel und unterdrückt das Erscheinen der nächsten Follikelwelle (PIERSONund GINTHER1987; KO etal.1991). DerdominanteFollikel ist für einige Tage präsent und bildet sich anschließend wieder zurück. Jeder Follikelwelle geht ein Anstieg der FSH-Konzentration im Blutplasma voraus (ADAMS et al. 1992; FSH: Follikelstimulierendes Hormon), jeder Follikelregression ein Absinken des FSH-Spiegels (SUNDERLAND et al. 1994). Durch Einsetzen der Luteolyse sinkt der Progesteronspiegel. Der negative Feed-Back-Mechanismus, den das Progesteron (P4) auf die Frequenz der LH-Ausschüttung ausübt, wird aufgehoben(LH:LuteinisierendesHormon).DerTertiärfollikel derletztenZykluswelle kann ovulieren(ROCHEundBOLAND1991; MIHMet al.1996).
Durch die präovulatorische Frequenzsteigerung der LH-Freisetzung aus der Hypophyse erhält die Oozyte das Signal zur Fortsetzung der Meiose. Die RNA- und Proteinsynthese in der Eizelle werden beendet, bevor die Kernmembran aufgelöst wird und die Chromatinkondensation einsetzt. Die 1. Reifeteilung endet mit der Reduktion des Chromosomensatzes und der Ausschleusung eines abortiven Polkörpers in den perivitellinen Spaltraum der Eizelle (SCHNORR 1985). Die entstandene sekundäre Oozyte geht ohne Interphase direkt in die Metaphase II der
Schrifttum 19
zweiten Reifeteilung über. In diesem Stadium arretiert die Oozyte erneut bis zur Fusion desSpermiumsmitder Eizellmembran.
Vom gonadotropen Impulsbis zurMetaphase II, mit deren Erreichendie Oozyte ihre Reife, d.h. Befruchtungskompetenzerlangt hat,vergehenin vivoetwa24h(HYTTEL et al. 1989). Erste Metaphase II-Stadien können zwar schon nach 19 h beobachtet werden, die Reifungsvorgänge im Zytoplasma der Eizelle, wie die Anordnung der kortikalen Granula entlang der Plasmamembran sind aber erst frühestens nach 21-22 h abgeschlossen (HYTTEL et al. 1986b). Fortsetzung und Vollendung der zweiten Reifeteilung in der Oozyte erfolgen erst im Verlauf der Befruchtung (KOLB 1984). Mit der Ausschleusung des zweiten Polkörperchens schafft die haploide Eizelle die Voraussetzung für die Ausbildung des weiblichen Vorkerns und die Syngamiemit demmännlichenPronukleus.
2.1.1 Oozytenreifung
Während der Wachstumsphase werden durch RNA- und Proteinsynthese Reserven angelegt, die für die folgende Reifung und Befruchtung essentiell sind (BLEIL und WASSARMAN 1980a; SHIMIZU et al. 1983). Dennoch besitzen diese Oozytennoch keine Kompetenz die Meiose fortzuführen (SORENSEN und WASSARMAN 1976).
Erst nach Abschluss des Größenwachstums (FAIR et al. 1995; YONG et al. 1997), wenn die Eizellenach Isolation aus dem Follikel spontan in der Lage ist, die Meiose fortzusetzen (WICKRAMASINGHE et al. 1991), kann sie als meiotisch kompetent bezeichnet werden. Ab diesem Zeitpunkt besitzt die Eizelle die Fähigkeit, den meiotischen Block im Dictyotänstadium der Prophase I zu überwinden und die Meiose bis zur Metaphase II fortzuführen, mit der sie ihre endgültige Befruchtungskompetenz erlangt. Diesen Abschnitt bezeichnet man als Oozytenreifung. Die komplexen Reifungsprozesse werden in vivo durch einen LH-Ausstoss in Gang gesetzt (TSAFRIRI et al. 1976) und unterliegen dem Einfluss einerReihe vonhemmendenundförderndenFaktoren(HYTTELetal.1997).
AlswichtigstesKriteriumfürdieReifeundBefruchtungsfähigkeiteinerEizellewirddie Kernreife angesehen, d.h. das Erreichen des Metaphase II-Stadiums. Die Kernreife
Schrifttum 20
allein ist aber kein Indiz für eine erfolgreich abgeschlossene Oozytenreifung (TROUNSONet al.1977).EsgibtEizellen,diezwarkompetentsind,ihreKernreifung zu vollenden, sich aber nicht zu Blastozysten weiterentwickeln können. Ein Grund dafür könntez.B.ineiner unvollständigenoderfehlerhaftenZytoplasmareifungliegen (EPPIG et al. 1994). Zu einer erfolgreich abgeschlossenen Oozytenreifung gehören ebenso strukturelle und biochemische Veränderungen im Eizellzytoplasma (THIBAULT 1977; MOOR et al. 1981; EPPIG 1993), sowie an den Cumuluszellen (MOOR et al.1980; EPPIG 1993; ZHANGet al. 1995). Kern-und Zytoplasmareifung treten miteinander in Wechselwirkung (EPPIG 1996). Die Eizelle erhält ihre Kompetenz zur Kernreifungvor der zur Zytoplasmareifung (DOWNS 1993). Ebenso laufen einigeProzesse sowie die Bildungvon Faktoren im Zytoplasma,die vor allem für eine erfolgreiche präimplantative Embryonalentwicklung bedeutend sind, auch ohne die Koordination mit der Kernreifung ab (EPPIG 1996). Außerdem dauert die Zytoplasmareifung länger an als die Kernreifung, denn trotz erfolgreich abgeschlossener Kernreifung, besitzt die Eizelle nicht zwangsläufigihre vollständige Befruchtungs- und embryonale Entwicklungskompetenz (Kaninchen: CHANG 1955;
Rind:LEIBFRIED-RUTLEDGE etal.1987).
2.1.1.1 Ultrastrukturelle Vorgänge während der Oozytenreifung
Im Laufe der Reifung finden Veränderungen im Nukleolus (CROZET 1989) sowie eine Umorganisation der Zellorganellen (HYTTEL et al. 1986a) und der zytoplasmatischen Granula statt (CRAN 1989).
Während der RNA- und Proteinsynthese im GV-Stadium, die für die weitere Entwicklung der Eizelle notwendig ist, erfährt die Oozyte ein enormes Größenwachstum (EPPIG et al. 1996; CROZET et al. 1998). Der Durchmesser wird so als praktikables Auswahlkriterium zur Bestimmung der Entwicklungskompetenz einer Eizelle angesehen (FAIR et al. 1995; HYTTEL et al. 1999). Mit einem Durchmesser von 110 µm (FAIR et al. 1995; HYTTEL et al. 1999) bis 130 µm (BECKERS et al. 1996; OTOI et al. 1997) ist diese am größten. Bei Oozyten mit
Schrifttum 21
einem Durchmesser von weniger als 110 µm konnte keine synchrone Kern- und Zytoplasmareifunginvitrofestgestelltwerden(LONERGANet al.1994).
2.1.1.1.1 ReifungsvorgängeimZellkern
Zu Beginn der Reifung befindet sich der Nukleus (GV) im Dictyotänstadium der Prophase I. Die Chromosomen liegen in Form von diffusen Bivalenten im Kernplasma vor (WASSARMAN und ALBERTINI 1994). Es ist mindestens ein Nukleolus ausgebildet (MOTLIK et al. 1984; CROZET 1989). Die morphologischen Veränderungen während derKernreifung laufen bei fast allenWirbeltieren gleich ab.
Mit der Aufhebung des meiotischen Blocks kommt es zur Auflösung des Nukleolus, zurChromosomenkondensation, zumAbbau derKernmembranundzumAufbaudes Spindelapparates(Maus: DONAHUE1968,Mensch: SANTHANANTHANetal.1991, Pferd: GRONDAHL et al. 1995, Rind: MOTLIK et al. 1978; KRUIP et al. 1983;
HYTTEL et al. 1986b, Schwein: MOTLIK und FULKA 1976; CRAN 1985). Nur beim Kaninchen liegen die Chromosomen bereits vor Maturationsbeginn als kondensierte Bivalente imKernplasmavor(MOTLIKetal. 1989).
Die Auflösung der Kernmembran wird als Germinal vesicle breakdown (GVBD) bezeichnet (EPPIG 1993; WASSARMAN und ALBERTINI 1994). Sie ist etwa 4-8 h nach dem LH-Peak abgeschlossen (KRUIP et al. 1983). Währenddessen laufen Kernreifungsprozesse ab (MOTLIK und FULKA 1976). Es kommt zur Kondensation des Chromatins. Die Chromosomen gehen unter weiterer Kontraktion in die Metaphase I über, in der sie sich paarweise in der Mitte der Oozyte anordnen (HYTTEL et al. 1987). In der Anaphase werden die gepaarten Chromosomen durch die Spindelfasern getrennt und an ihrePoole gezogen. Mit der Telophase,in der die Ausschleusung des ersten Polkörperchens in den perivitellinen Spaltraum erfolgt (SCHNORR 1985), wird die erste Reifeteilung etwa 19-20 h nach dem LH-Peak beendet (KRUIP et al. 1983). Die Eizelle geht jetzt sofort in die Metaphase II über.
Das Chromatin kondensiert erneut, die Chromosomen werden im peripheren Ooplasma deutlich sichtbar. In dieser Phase, kurz vor oder während der Ovulation,
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arretiert die Meiose ein zweites Mal bis zum Eindringen des Spermiums in die Eizelle.
2.1.1.1.2 ReifungsvorgängeimZytoplasma
Zur gleichen Zeit finden eine Reihe von Veränderungen im Zytoplasma der Eizelle statt. Sie stehen mit den Kernreifungsprozessen in Wechselwirkung (EPPIG 1996).
Die Ultrastruktur des Zytoplasmas vor der meiotischen Reifeteilung ist durch viele gleichmäßig verteilte Vesikel, Zusammenballungen von Mitochondrien und peripheren kortikalen Granula sowie durch deutlich entwickelte Golgiapparate und Zisternen des glatten endoplasmatischen Retikulums gekennzeichnet (KRUIP et al.
1983; HYTTEL etal. 1986b). DieZona pellucidaumschließt die Oozyteund wirdvon zahlreichen Fortsätzen der Cumuluszellen penetriert. Sie bilden enge Zellverbindungen in Einstülpungen mit der Ooplasmamembran aus (HYTTEL et al.
1989). DerperivitellineSpaltraumistkaum zusehen.
Mit Beginn der zytoplasmatischen Reifung wird eine Vergrößerung des perivitellinen Spaltraumes erkennbar (KRUIP et al. 1983). Die Mitochondrien ordnen sich gemeinsam mit den Fetttröpfchen verstärkt im zentralen Zytoplasma an, währenddessen der Golgiapparat reduziert wird (HYTTEL et al. 1986b). Unmittelbar unterhalb des Oolemms reihen sich die kortikalen Granula perlschnurartig auf (SANTHANANTHAN und TROUNSON 1982; KRUIP et al. 1983). Diese Umstrukturierung ist für die Ausbildung des Polyspermieblockes bei der Befruchtung von großer Bedeutung (DUCIBELLA 1991) und damit essentiell für den Ablauf einer erfolgreichen Oozytenreifung(CRAN1989;HYTTEL etal.1989).
2.1.1.1.3 ReifungsvorgängeandenCumuluszellen
Parallel zur Kern- und Zytoplasmareifung kommt es zu Veränderungen an den Cumuluszellen. Die Cumuluszellen sind untereinander (GILULA et al. 1978) und mit der Oozyte durch Gap junctions verbunden, über die metabolische Stoffe und Signalmoleküle übertragen werden können (BUCCIONE et al. 1990). Dieser enge Kontakt geht währendder Reifunglangsam verloren(HYTTEL etal. 1986a;SÜSS et
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al. 1990; EPPIG 1991) und ist etwa 9-12 h nach dem LH-Peak aufgehoben (HYTTEL et al. 1986b). Außerdem führt eine vermehrte Synthese von Glycosaminoglycanen (DEKEL et al. 1979; EPPIG 1979) sowie Veränderungen im Zytoskelett der Cumuluszellen (SUTOVSKY et al. 1993; 1994) zur Cumuluszellexpansion oder Muzifikation (EPPIG 1982). Durch die Gonadotropinstimulation sezernieren gereifte Oozyten Stoffe, welche die Cumuluszellen zur Sekretion des Proteoglycans Hyaluronsäure befähigen (BUCCIONE et al. 1990). GILULA et al. (1978) vermuten das Vorkommen eines Plasminogenaktivators (PA), der für die Expansion der Cumuluszellschicht verantwortlichist.ErwirdvonderOozyteunddenCumuluszellen synthetisiert (CHOI et al. 1998b). Der PA wandelt das in der Follikelflüssigkeit befindlichePlasminogen, dasvon derMembranagranulosa synthetisiertwird,in eine Plasminprotease um und führt so zur Desintegration im Cumulus-Oozyten-Komplex (COK). Die vollständige Cumuluszellexpansion ist etwa 9-12 h nach dem LH-Peak abgeschlossen (HYTTELetal.1986b).
2.1.1.2 ZellphysiologischeAspektederOozytenreifung
Unter zellphysiologischen Gesichtspunkten betrachtet, befindet sich die Eizelle zum Zeitpunkt dermeiotischenBlockade imDictyotänzwischenderG2-(Second gap)und der M-Phase (Mitose) des Zellzyklus (MOOR et al. 1990). Die DNA-Synthese hat bereits in der S-Phase (Synthese) des Zellzyklus während der frühen Fetalentwicklung stattgefunden. Zum Zeitpunkt der Geburt arretiert dann der meiotische Zellzyklus in der G2-Phase. In dieser Phase werden DNA-Anomalien repariert sowie Protein- und RNA-Reserven zur Erlangung der meiotischen Kompetenz und für die spätere Weiterentwicklung angelegt, bevor die Eizelle in die M-Phase eintritt (SCHULTZ und WASSARMAN 1977; BACHVAROVA 1981;
CHESNEL und EPPIG 1995; VANTERY et al. 1997). Die Eizelle arretiert solange in der G2-Phase bis sie ihre volle meiotische Kompetenz, d.h. die Fähigkeit die Meiose bis zum Metaphase II-Stadium fortzusetzen, sowie ihre Kompetenz zur zytoplasmatischen Reifung erlangt hat (EPPIG 1996). Die Regulation des Zellzyklus ist noch nicht bis ins Detailgeklärt. Es konnten einzelne Schlüsselproteine gefunden werden, die beim GVBD sowie beim Eintritt in einen neuen Zellzyklus eine Rolle
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spielen. Dazu gehören der Maturation-Promoting-Factor (MPF) und die Mitogen- Activated-Protein-Kinase(MAPK).
2.1.1.2.1 DerMaturation-Promoting-Factor(MPF)
Durch Grundlagenforschung an Hefepilzen, Seeigel- und Froscheizellen wurde das cdc2-Gen (Cell-division-cycle-Gen2) entdeckt, das ein Schlüsselprotein in der Induktion der Eizellreifung - das p34-Protein - codiert (MASUI und MARKERT 1971;
DUNPHY et al. 1988; LABBE et al. 1989). Das phosphorylierte p34-Protein bildet zusammen mit Cyclin B (GAUTIER et al. 1989), das in der Interphase angereichert wird, den Prä-MPF(GAUTIER et al.1991). Solangeder Prä-MPFinaktiv ist,befindet sich die Eizelle noch in der G2-Phase (O´CONNELL und NURSE 1994). Durch Dephosphorylierung des p34-Proteins und Phosphorylierung des Cyclin-Proteins wird derMPF aktiviert(LEE et al.1992). Dader MPFdas exogeneSubstrat Histon 1 (H1) aktiviert, kann seine Aktivität an der des H1 gemessen werden (ARION et al.
1988; LEWIN1990).
Während der Eizellreifungwird einbiphasischer Verlauf der H1-Aktivitätmit jeeinem Maximum inderMetaphase IundIIbeobachtet(MATTIOLI etal.1991a;LEVESQUE und SIRARD 1996; VANTERY et al. 1996; MEINECKE et al. 1997a; PAVLOK et al.
1997; LIU et al. 1998b). Der MPF setzt eine Enzymkaskade in Gang, welche die Eizelle in die Metaphase überführt (EPPIG 1993). In der Metaphase II arretiert die Eizelle bis zur Aktivierung durch Befruchtung oder einen künstlichen Stimulus. Zu diesem Zeitpunkt kommt es zum Abbau des Cyclins und damit zur Inaktivierung des MPF (COLLAS et al. 1993b; MACHATY et al. 1996; YAMAUCHI et al. 1998). Diese ist für das Verlassen der Metaphase notwendig (KALOUS et al. 1993b; WEHREND und MEINECKE 1998). Dem MPF wird während der Metaphase eine Rolle bei der Auflösung der Kernmembran, der Chromosomenkondensation und der Organisation des Zytoskelettszugeschrieben(EPPIG1993).
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2.1.1.2.2 Die Mitogen-Acitvated-Protein-Kinase (MAPK)
Die Mitogen-Activated-Protein-Kinase (MAPK) ist ein Enzym, das während der Reifung durch eine Reihe von Enzymen (u.a. c-Mos-Protein) aktiviertwird (POSADA et al. 1993; FISSORE et al. 1996; HUANG et al. 1996; MATTEN et al. 1996). Bei Froschoozyten wird die Synthese des c-Mos-Proteins durch Progesteron induziert (KOSAKO et al. 1994a). Damit wird über die Phosphorylierung einer MAPKK (Mitogen-Activated-Protein-Kinase-Kinase) die MAPK aktiviert (KOSAKO et al.
1994a). In Oozyten vom Rind und Schwein werden 2 MAPK während der Reifung aktiviert(FISSOREet al.1996;VANTERYetal. 1996).MOTLIKetal.(1998)konnten beim Rind nach ca.8 h IVM50 % undnach 24 hIVM 100 %derAktivität derbeiden MAPKmessen.
Die Aktivierung der MAPK erfordert ebenso wie die des MPF (FULKA et al. 1988) eine aktive Proteinsynthese in der Oozyte (INOUE et al. 1996; MEINECKE et al.
1997b). Die MAPK steigt kontinuierlich nach Eintritt des GVBD bis zur Metaphase II an, um dann beider Befruchtungwieder inaktiviertzuwerden (PAVLOKet al.1997).
Ihre Funktion wird in der Phosphorylierung einer Reihe von Zielproteinen gesehen, die bei der Modulation der Genexpression, der Organisation des Zytoskeletts (VERLHAC et al. 1994; ZERNICKA-GOETZ et al. 1997) sowie bei der Aktivierung anderer Kinasen und Proteine eine wichtige Rolle spielen (S6 Kinase II der Ribosomen: STURGILL et al. 1988; p220 Mikrotubulus-assoziiert: SHIINA et al.
1992).
2.1.1.2.3 Zusammenspiel vonMPFundMAPK
Beim Rind werden der MPF und die MAPK nach Induktion der Eizellreifung gleichzeitig aktiviert (FISSORE et al. 1996). Ihre Aktivität steigt bis zur Metaphase I an. Während der Ana- und Telophase I lässt die MPF-Aktivität nach. Gleichzeitig bleibt die MAPK-Aktivität bis zur Aufhebung des meiotischen Blocks in der Metaphase II hoch. Die MPF-Aktivität steigt beim Übergang von der Telophase I zur Metaphase II erneut an (WHITAKER 1996). Das genaue Zusammenspiel von MPF und MAPK istnoch unklar (STOJKOVIC etal.1999). Durch Mikroinjektionvon MAPK
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in eine arretierte Eizelle kann deren MPF aktiviert und damit der GVBD ausgelöst werden (HACCARD et al. 1995). Auch KOSAKO et al. (1994a) vermuten einen positiven Feedback zwischen der MAPKK/MAPK-Kaskade und des MPF.
Andererseits induziert eine niedrige Konzentration von aktiver MAPK über das c-Mos-Protein als Komponente des CSF (Cytostatic-Factor) oder über die MAPKK/MAPK-Kaskade eine Arretierung in der Metaphase (KOSAKO et al. 1994b;
WUetal.1997).
Nach dem heutigen Wissensstand wird vermutet, dass der MPF und die MAPK eine wichtige Rolle bei der Regulation der Oozytenreifung spielen. Ihre physiologische Relevanz für die Eizellreifung konnte aber noch nicht nachgewiesen werden (WEHRENDund MEINECKE1998).Sicherlichsind auchnochandereEnzyme indie Regulation der Eizellreifung involviert. So wurde bei der Maus eine weitere Kinase (Nek2)gefunden(RHEEundWOLGEMUTH1997).
2.1.1.3 Oozytenreifungin vitro(IVM)
Die Bedingungen für die Oozyten im In-vitro-System konnten bisher noch nicht so modifiziert werden, dass eine - den In-vivo-Verhältnissen vergleichbare - optimale Reifung und Entwicklungskompetenz der Oozyten erreicht wird (TROUNSON et al.
1997; HYTTEL et al. 1986a; 1986b; GREVE et al. 1987). Das genaue zeitliche Zusammenspiel der vielfältigen Reifungsvorgänge scheint in vitro oft fehlerhaft abzulaufen. Läuft die Reifung im In-vitro-System verzögert ab, so führt dies meist zu einer schlechteren Entwicklungskompetenz der Eizellen. Oozyten, die eine frühe Ausschleusung (nach 16-20 h IVM) des 1. Polkörpers zeigen, entwickeln sich eher zu Blastozysten als Eizellen, deren Reifung erst zu einem späteren Zeitpunkt abgeschlossen ist (DOMINKO und FIRST 1992; VAN DER WESTERLAKEN et al.
1992). Außerdem ist die geringe Entwicklungsfähigkeit in vitro gereifter Oozyten durch unzureichende funktionelle und biochemische Reifungsvorgänge im Zytoplasma der Eizellen begründet (HYTTEL et al. 1986a; GREVE et al. 1987;
WEHRENDundMEINECKE 1998).
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2.1.1.3.1 Induktion der Oozytenreifung
In vivo arretiert die Eizelle im Dictyotänstadium der Prophase I. Es wurden viele Untersuchungen durchgeführt, um den Mechanismus der Blockierung aufzuklären.
Mehrere Arbeiten schreiben den Follikelzellen dabei eine entscheidende Bedeutung zu. PINCUS und ENZMANN haben bereits 1935 beim Kaninchen festgestellt, dass die Kernreifungin vitrospontanvoranschreitet, wenndieOozyteausihrerfollikulären Umgebung entfernt wird. Dieses Phänomen konnte auch bei anderen Tierarten beobachtet werden (Rind: SCHUETZ 1969; Pferd: HINRICHSet al.1995; Ratteund Schwein: FLEMING et al. 1985). In In-vitro-Versuchen wurde ebenfalls ein reifungshemmender Einfluss von Follikelflüssigkeit bzw. Follikelzellen beobachtet (SIRARD und BILODEAU 1992; FOULADI-NASHTA et al. 1998; SIROTKIN et al.
1998; SAHA et al. 2000). In vivo wird deren inhibitorische Wirkung durch die plötzliche LH-Ausschüttung aus der Hypophyse aufgehoben. Daraufhin wird die Meiose fortgesetzt und die Ovulation ausgelöst (HYTTEL et al. 1989; TSAFRIRIund DEKEL 1994). Im In-vitro-System gelang es TSAFRIRI et al. (1976) ebenfalls durch Zugabe von LH, die meiosehemmende Wirkung von zugesetzten Granulosazellen aufzuheben. Die inhibitorische Wirkung der somatischen Follikelzellen scheint nicht speziesspezifisch zu sein. So kann z.B. mit Schweinegranulosazellen die spontane Kernreifung von bovinen COKs reversibel gehemmt werden (TSAFRIRI et al. 1976;
KALOUS etal.1993a).
Wie lang dieser hemmende Effekt von Follikelzellen und -flüssigkeit andauert, ist umstritten. KATO und SEIDEL (1998) wiesen bereits 20 h nach einer LH-Zugabe aktivierende Faktoren in der Follikelflüssigkeit nach. SIRARD und COENEN (1993) konnten dagegen die Meiose in einer Follikelzellen-Kokultur bis zu 24 h reversibel hemmen. In hohen Konzentrationen kann die Follikelflüssigkeit sogar im Fertilisierungsmedium noch eine inhibierende Wirkung auf die Befruchtungs- und Weiterentwicklungsrateausüben (CHOIetal.1998a).
Diegenauen FaktorenindenFollikelzellenund der-flüssigkeit,diefürdieArretierung der Kernreifung verantwortlich sind, konnten bis heute noch nicht genau identifiziert werden. SATO und KOIDE (1984) schreiben einem Faktor in den Granulosazellen
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diese Fähigkeit zu, dessen Aktivität von einem Signal der Thekazellen beeinflusst wird (KOTSUJI et al. 1994). RICHARD und SIRARD (1996a, b) vermuten, dass die Thekazellen selbst einen meiosehemmendenFaktor produzieren. Andererseits kann aber beim Rind allein durch die Zugabe von Granulosazellen oder Follikelflüssigkeit eine Meiosearretierung in der Oozyte hervorgerufen werden (AKUFO et al. 1988;
SIRARD und BILODEAU 1990). Es wird ein meiose-inhibierender Faktor (Oocyte- Maturation-Inhibitor, OMI) sowohl in der Follikelflüssigkeit als auch in einer Granulosazell-Kokultur in vitro vermutet (TSAFRIRI et al. 1982; DOWNS 1993). Bei Schweinen (DOWNS et al. 1985) und Mäusen (EPPIG und DOWNS 1987) konnte das niedermolekulare Polypeptid Hypoxanthin in der Follikelflüssigkeit identifiziert werden. Die Wirkung des Hypoxanthins soll über die Erhaltung eines hohen cAMP- Spiegels ablaufen (zyklisches Adenosin-monophosphat: DOWNS et al. 1989).
Allerdings gelangesSIRARD(1990) beibovinenOozytennicht,mitHypoxanthinund Adenosin einenMeioseblockhervorzurufen.
Das cAMP ist ein Signalmolekül (Second messenger) für viele Botenstoffe (z.B. Peptidhormone). Die Botenstoffe binden an einen G-Protein-gekoppelten
Rezeptor auf der Zellmembran, der ein membranständiges Enzym (z.B. Adenylat- Zyklase) aktiviert. Dieses Enzym katalysiert die Produktion des intrazellulären Mediators cAMP aus ATP (Adenosin-triphosphat). Das cAMP aktiviert auf direktem Wege Kinasen, die wiederum den Aktivierungszustand spezifischer Zielproteine verändern (ALBERTS et al. 1995).
Ein Anstieg von cAMP oder die Aufrechterhaltung hoher cAMP-Spiegel in der Eizelle bewirken die Blockierung der Meiose (THIBAULT et al. 1987; SIRARD 1990).
DOWNS (1993) konnte durch Zugabe von cAMP oder Stoffen, welche die cAMP- Konzentration erhöhen (z.B. Forskolin, FSH), einen meiotischen Block im GV- Stadium hervorrufen. Der cAMP-Antagonist Rp-cAMP hebt den blockierenden Effekt wieder auf. Bei Verwendung der invasiven Adenylat-Zyklase (iAC) von Bordetella pertussis, welche die endogene cAMP-Konzentration erhöht, konnte bei hoher Dosierungein hemmenderEinfluss aufdieMeiosebeobachtetwerden,währendeine geringe Dosierung eher förderlich wirkte (LUCIANO et al. 1998, 1999). Ein starker cAMP-Anstieg und sein nachfolgender Abfall sind wichtige Vorgänge für die
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Aufhebung der Meiosearretierung bei Rindereizellen (SHULTZ et al. 1983;
BILODEAU etal.1993;AKTAS etal.1995a,b).
Zusammenfassend bleiben die molekularen Grundlagen und der genaue Wirkungsmechanismus des Zusammenspiels von somatischen Zellen und Oozyte immer nochunklar(NIEMANNundMEINECKE1993).
2.1.1.3.2 Dauerder Reifunginvitro
Die Reifungszeit in vitro ist ein wesentlicher Einflussfaktor für die Weiterentwicklungsfähigkeit der Eizellen nach Befruchtung und Kultivierung. Es gilt, die optimale Reifungszeit für eine Oozytenpopulation in vitro zu bestimmen. Zum einen soll solange gereift werden, bis möglichst viele Oozyten ihr Reifestadium,d.h.
die Metaphase II erreicht haben. Andererseits soll das Auftreten von Degenerationserscheinungen durch eine zu lange Reifung, welches die Weiterentwicklungsfähigkeit der Oozyten negativ beeinflusst, so gering wie möglich gehalten werden.
Die Angaben zur optimalen Reifungszeit variieren zwischen 14 und 24 h. Einige Forschungslabors erzielenbereits mit 14 (SEMPLE et al. 1993) bis 16 h (DOMINKO und FIRST 1992) in vitro gereiften Oozyten die besten IVP-Ergebnisse.
Untersuchungen von SÜSS und WÜTHRICH (1985) sowie SIRARD et al. (1989) belegen jedoch, dass erst nach 16-18 h IVM erste Metaphase II-Stadien zu beobachten sind. Daher wird eine mindestens 18-stündige Reifungszeit empfohlen (SIRARD et al. 1989; PROKOFIEV et al. 1992; TODOROV 1994). Mit einer Reifungszeit von 24 h erzielen SHAMSUDDIN et al. (1993) und MONAGHAN et al.
(1993) ihre höchsten Blastozystenraten (BR). Wird die Reifungszeit auf 28-48 h verlängert, so führt dies zu einer erhöhten Polyspermierate sowie einer geringeren Entwicklungskompetenz der befruchteten Oozyten (CHIAN et al. 1992). In Untersuchungen von OCAÑA-QUERO et al. (1999) erhöht sich mit längerer Maturationszeit (48h)dieAnzahldiploiderOozytenvon2,6 %(24hIVM)auf11,4 %.
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2.1.1.3.3 Reifungsmedien und ihre Zusätze
Die erfolgreiche Reifung der Oozyte ist für die anschließende Befruchtung und WeiterentwicklungvongroßerBedeutung(MATTIOLI1996). Dieinvitroverwendeten Reifungsmedien üben einen signifikanten Einfluss auf die Fertilisation der Oozyten und deren folgende embryonale Entwicklung aus (CRITSER et al. 1986; ZUELKE und BRACKETT1990).
2.1.1.3.3.1 Reifungsmedien
Das am häufigsten verwendete Medium für die In-vitro-Reifung beim Rind ist das TCM 199 (Tissue Culture Medium 199), dem verschiedene Seren, Gonadotropine
(FSH und LH) und gegebenenfalls Steroidhormone (E2: Estradiol-17β; P4: Progesteron) zugesetzt werden (YOUNIS et al. 1989; MADISON et al. 1992;
BRACKETT und ZUELKE 1993; GREVE et al. 1993a). Aber auch mit anderen Medien lassen sich gute Reifungsergebnisse erzielen. Von sieben kommerziell erhältlichen Medien erwiesen sich fünf für eine IVM als verwendbar (Fa. Sigma St.
Louis (MO): SFRE 199-2 Medium; MEMα: Eagle´s Minimum Essential Medium-α;
MEMα/+: MEMα mit Deoxy- und Ribonucleotiden; 1:1 RPMI-1640:MEMα; Fa. Gibco Grand Island (NY): TCM199). Das Waymouth´s Medium MB 752/1 (Fa. Sigma)und das Ham´s F-12 (Ham´s nutrient mixture F-12; Fa. Sigma) erschienen als ungeeignet (ROSE und BAVISTER 1992). Von GÖTZ (1995) wurde das Modified Parker Medium (MPM)erfolgreicheingesetzt.
Seit einigenJahren findengenau definierbareMedien (z.B.SOFM:Synthetic Oviduct Fluid Medium), denen verschiedene Proteinquellen (Serum, BSA: bovines Serumalbumin, Aminosäuren)zugesetzt werden, immer breitere Anwendung (HOLM et al. 1997; AVERY et al. 1998; PALMA et al. 1999). Durch die genaue Definierbarkeit des SOFM können die IVP-Ergebnisse unterschiedlicher Labors besser miteinander verglichen werden. Zudem ist bei Kultivierung in SOFM die Transkriptionsaktivität derentwicklungsspezifischenGene vonEmbryonenderinvivo ähnlicher alsbei Kultivierungin TCM 199 (WRENZYCKI et al.2000). Die genannten Standardmedien wurden meist fürandere Zwecke entwickelt undentsprechen daher
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nicht der Zusammensetzung der Follikel- bzw. Eileiterflüssigkeit. Man benötigt daher bestimmte Zusätze wie Proteinquellen, Hormone und Cumulus- oder Granulosazellen.
2.1.1.3.3.2 Proteinquellen
AlsProteinquelle wirdvorallem Serumeingesetzt.Amhäufigsten wirdBlutserumvon Kühen verwandt, das zum Zeitpunkt ihrer stehenden Brunst, etwa 24 h vor der Ovulation gewonnen und hitzeinaktiviert wird (ECS: östrisches Kuhserum;
SCHELLANDER et al. 1990; GREVE et al. 1993a). Auch fetales Kälberserum (FCS:
MATSUOKA et al. 1992), Ochsen- (CAROLAN et al. 1993) und Bullenserum (KANITZ et al. 1996) werden vereinzelt eingesetzt. Angaben über die günstigste Konzentration des Serumzusatzes reichen von 10 (KIM et al. 1990; NAKAO und NAKATSUJI 1990; OCAÑA-QUERO et al. 1999) bis 20 % (FUKUI und ONO 1989;
KEEFER etal.1991;OCAÑA-QUEROetal. 1999).
2.1.1.3.3.3 Hormone
Die bedeutende Rolle von Hormonen bei der Regulation des Follikelwachstums und der Follikelreifung in vivo macht die Zugabe von Hormonen auch bei der IVM erforderlich. In vivo wird durch die Ausschüttung des Gonadotropin-Releasing- Hormons (GnRH) aus dem Hypothalamus die Freisetzung der Gonadotropine FSH und LH in der Hypophyse induziert. Während einer Follikelreifungswelle erreichen sie bestimmte Konzentrationen und bewirken die Oozytenreifung sowie die Ovulation des dominanten Follikels (DRIANCOURT 1996). Die genauen Mechanismen für die Wirkung der Hormone sind noch weitgehend unbekannt (ZUELKE und BRACKETT 1993). Ihre Wirkung wird wohl durch die Cumulus- und Follikelzellen (Theka- und Granulosazellen) vermittelt, da die Eizellmembran selbst keine Rezeptoren für Gonadotropine besitzt (MATTIOLI 1996). Während des Follikelwachstums steigt die Anzahl der FSH-Rezeptoren an den Granulosazellen und die der LH-Rezeptoren an den Thekazellen (RÜSSE und SINOWATZ 1991). In den Granulosazellen wird Inhibin gebildet, das über einen negativen Feed-back-Mechanismus die GnRH-
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kontrollierte FSH-Freisetzung hemmt (ECHTERNKAMP und SCHANBACHER 1990).
Die Aufgabe der Thekazellen besteht in der Sekretion von Androgenen, die in den Granulosazellen zuÖstrogenen(E2)aromatisiertwerden.
Im In-vitro-System werden dem Maturationsmedium die Gonadotropine als Serumbestandteil und/oder in Form von Hormonpräparaten zugesetzt. Der Einfluss der Hormone auf die Reifung kann anhand der Kernreifung, der Cumuluszellexpansion sowie der Befruchtungs-und Weiterentwicklungsrateermittelt werden(SÜSS etal.1990).
LH scheint einen positiven Einfluss auf die Meiose auszuüben. Mit einer Supplementation von LH kann eine gesteigerte Weiterentwicklungsrate nach Befruchtung erzielt werden (BRACKETT et al. 1989; ZUELKE und BRACKETT 1990). LH aktiviert die Adenylat-Zyklase und bewirkt damit einen Anstieg des meiosehemmenden cAMP(HOMA1995). Außerdemstimuliert esdieProduktion von Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3), was einen intrazellulären Anstieg der Ca2+ in der OozytezurFolgehat(HOMA1995). DurcheineDepolarisationderOozytenmembran kommt eszumÖffnender Ca2+-Kanäle unddamitzueinem verstärktenCa2+-Influx in die Eizelle (MATTIOLI et al. 1991b). Die aktivierende Wirkung der Ca2+ überwiegt gegenüber der des cAMP und der meiotische Block kann überwunden werden.
LH hat zudem einen positiven Einfluss auf den Metabolismus der Eizelle. Es stimuliert die Glycolyse, die mitochondriale Glucose-Oxidation sowie den Tricarboxylsäurezyklus und stellt der Eizelle damit die Energie zur Verfügung, die sie für die Weiterentwicklung benötigt (ZUELKE und BRACKETT 1992).
FSH scheint die Kernreifung zu verzögern (ABEYDEERA et al. 1999), da es den meiosehemmenden cAMP-Spiegel vorübergehend anhebt (SÜSS et al. 1990). Eine Steigerung der Blastozystenrate konnte durch Zugabe verschiedener FSH- Konzentrationen nicht erzielt werden (BARAÑAO und SALAMONE 1995).
EYESTONE und DE BOER (1993) sind da gegenteiliger Meinung. Für die Cumuluszellexpansion ist das Vorhandensein von FSH jedoch unumstritten eine notwendige Vorraussetzung (HENSLEIGH und HUNTER 1983; FUKUI und ONO 1989).
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Da im Serum (ECS, FCS oder Bullenserum) bereits Hormone enthalten sind, ist die zusätzliche Supplementation von Hormonzusätzen zum Reifungsmediumumstritten.
Bei Verwendung vonFCS-haltigem Reifungsmediumkann keinzusätzlicher positiver Effekt einer LH/E2 bzw. FSH/E2-Supplementation gefunden werden (GOTO und IRITANI 1992). Auch der Zusatzvon FSH undLH zu Bullenserum-supplementiertem Reifungsmedium führt zu keinem besseren Ergebnis in der Embryonenproduktion (ARLOTTO 1998).
Bei gleichzeitiger Zugabe von Gonadotropinen und Steroiden (E2; P4) zum serumhaltigen Reifungsmedium (z.B. die Kombination von E2 mit FSH und LH) scheint eine Steigerung der Fertilisierungsrate möglich zu sein (FUKUSHIMA und FUKUI 1985; YOUNIS et al. 1989). Dieselbe Hormonsupplementation wird auch im serumfreien Reifungsmedium gebraucht (SAEKI et al. 1991). Zum Teil wirkt sich ein E2-Zusatz ehernegativ auf die Reifung aus(RYAN etal. 1999). Besser scheinen die Entwicklungsraten ineinem Maturationsmediumzusein, dasFSH, LHundP4enthält (RYAN et al. 1999). GRIMES und IRELAND (1986) sprechen dem P4 jedoch einen positiven Einfluss aufdie Kernreifungab. DieWirkungderSteroide E2undP4auf die ReifungistanscheinendbedeutsameralsdiederGonadotropine(FUKUIetal.1982).
Auch dem TSH (Thyreotropes Hormon) wird ein positiver Einfluss sowohl auf die Cumuluszellexpansion als auch auf die Reifungs- und Entwicklungsfähigkeit von COKs zugesprochen (YOUNIS und BRACKETT 1992). Das Hormon ist auch in der Lage, die zytoplasmatische Glucose-Oxidation und die Aktivität des Pentosezyklus zu steigern.
Die Verwendung des gonadotropen Hormons Prolaktin (PRL) bei der IVM verbessert zwar nicht direkt die Oozytenreifung, führt aber zu einer Erhöhung der Blastozystenrate. GranulosazellenimMaturationsmediumwerdenunterdemEinfluss von PRL zur Bildung von Faktoren veranlasst, die vermutlich die Zytoplasmareifung anregen (KUZMINA et al. 1998). Aufgrund der verzögerten Kernreifung in vitro, verbunden mit einer verbesserten Zytoplasmareifung ist auch die Entwicklungskompetenz der Oozyten nach PRL-Behandlung verbessert (KANITZ et al. 1996; HELEIL 1999). So sind nach Zugabe von PRL zum Reifungsmedium
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deutlich mehr intakte Metaphase II-Stadien vorhanden. Keine Verbesserung durch PRLkonnten SAEKIetal. (1991)erreichen.
Wachstumshormon (GH) und Wachstumsfaktoren (Epidermal growth factor [EGF]; Insulin-like growth factor I [IGF-I]) können sowohl auf die Kernreifungund die Cumuluszellexpansion (HARPER und BRACKETT 1993) als auch auf die embryonale Entwicklung einen positiven Effekt haben (BEVERS et al. 1998;
MOREIRAet al.2002).
GnRH, das im Hypothalamus gebildet wird, führt erst im Befruchtungsmedium zu einer gesteigerten Teilungsrate (FUNSTON und SEIDEL 1995). EineGenexpression (mRNA; messenger-Ribonukleinsäure) für GnRH-Rezeptoren konnte in reifen bovinen COKs gefunden werden, nicht aber die Rezeptoren selbst (FUNSTON und SEIDEL 1995). Dies lässt vermuten, dass die Wirkung des GnRH über eigene Rezeptoren vermittelt wird. In den Gonaden konnten bisher nur bei Ratten eigene GnRH-Rezeptoren identifiziertwerden(ACKLANDetal.1992).
2.1.1.3.3.4 Granulosa-undCumuluszellen
Neben dem Zusatz von Proteinquellen und Hormonen zum Reifungsmedium wird auch der Zugabe von somatischen Zellen, z.B. von Granulosazellen ein positiver Effekt auf die Entwicklungskompetenz von Rindereizellen zugesprochen (CRITSER et al. 1986; LUTTERBACH et al. 1987; LU et al. 1988, SIRARD und BILODEAU 1990; O´DOHERTY et al. 1996; ALM et al. 1998). Dieser Effekt ist mit der Bildung von E2 durch die Granulosazellen (FUKUI und ONO 1989) oder durch die Bildung anderer Faktoren erklärbar (SIRARD und BILODEAU 1990). Granulosazellen bilden das für die Eizellen als Energiequelle nutzbare Pyruvat (EPPIG 1977). Allerdings ist die positive Wirkung der Granulosazellen dosisabhängig (SIRARD et al. 1992).
Während niedrige Dosierungen (1,0-7,5 x 106Zellen/ml) stimulierend auf die Meiose wirken (FUKUI und ONO 1989; SIRARD und BILODEAU 1990; MOCHIZUKI et al.
1991), erreicht man mit höheren Dosierungen (z.B. 10,0 x 106 Zellen/ml) eher einen hemmenden Effekt (MOCHIZUKI et al. 1991). Bei steigender Granulosazellkonzentration nimmt deren Nährstoffverbrauch aus dem
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Reifungsmedium so stark zu, dass es für die Eizelle zu einem Energiedefizit kommt (MOCHIZUKIetal. 1991).
Die Expansion der Cumuluszellen während der Eizellreifung stellt ein wichtiges Kriterium für eine erfolgreiche Reifung dar. Gap junctions an den Zellfortsätzen ermöglichen den Transport von StoffenzwischenKeimzelle und somatischen Zellen, diebei derKoordinationund RegulationderReifungsvorgängeanderEizellebeteiligt sind (EPPIG 1991; MATTIOLI 1996; SIRARD et al. 1998). Viele Untersuchungen belegen die wichtige und notwendige Rolle eines intakten Cumulus-Oozyten- Komplexes (COK) für die Eizellreifung, da die IVM cumulusfreier (=denudierter) Eizellen in einer deutlich reduzierten Entwicklungskapazität der Oozyte resultiert (SHIOYA et al. 1988; LEIBFRIED-RUTLEDGE et al. 1989; YOUNIS et al. 1989;
MOCHIZUKI et al. 1991; HAZELEGER und STUBBINGS 1992; MADISON et al.
1992; CHIANundNIWA1994;ZHANGetal.1995).ImGegensatzdazukonnten KIM et al. (1996) bei Reduzierung der Cumuluszellzahl keinen Unterschied in der Entwicklungskompetenz der gereiften Eizellen feststellen. Es besteht eine direkte Korrelation zwischen der Dichte der Cumuluszellschicht und der Entwicklungsfähigkeit der gereiften Oozyten (HASHIMOTO et al. 1998). Dabei optimieren die Cumuluszellen entweder die Weiterentwicklung der Eizellen und/oder inaktivieren entwicklungshemmende Komponenten im Medium (HASHIMOTO et al.
1998). So kommtden CumuluszellenalsRezeptorträger undBildnerverschiedenster Syntheseprodukte für die Reifungsvorgänge in der Oozyte eine große Rolle zu. Sie produzieren Faktoren, welche die Zytoplasmareifung unterstützen (VANDERHYDEN und ARMSTRONG 1989; CHIAN et al. 1994). Es wird ihnen auch eine nutritive Funktion zugeschrieben (SATO et al. 1977; DE LOOS et al. 1991; ZUELKE und BRACKETT 1992). Ein metabolischer Austausch zwischen Cumuluszellen und Oozyte findet über die Gap junctions statt (DE LOOS et al. 1991; ZUELKE und BRACKETT 1992). Cumuluszellen spielen nicht nur bei den zytoplasmatischen sondern auch bei den nukleären Reifungsvorgängen eine wichtige Rolle. FSH- stimulierte Cumuluszellen erzielen einen regulierenden Effekt auf die cAMP- abhängige-Protein-Kinase und damit auch auf die Chromatinkondensation sowie die AktivierungdesMPF(TATEMOTOundTERADA 1998).
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Inwieweit die interzellulären Verbindungen für die Eizellreifung erforderlich sind, ist umstritten. So erweist sich eine leichte Auflockerung der Cumuluszellschicht durch eine Hyaluronidasebehandlung sogar als vorteilhaft für die Weiterentwicklungsfähigkeit der Eizellen (HAWK et al. 1992). Mit denudierten Oozyten, die auf einem Cumuluszell-Monolayer gereift wurden, konnte eine normale Fertilisation und embryonale Entwicklung erreicht werden (DOMINKO und FIRST 1991). ZHANG et al. (1995) erklären diese Ergebnisse durch eine nicht vollständige Denudation der Eizellen, deren verbleibende Cumuluszellkontakte ihre Wirkung entfalten können. Fest steht, dass im Verlauf der Cumuluszellexpansion die Verbindungen der Cumuluszellen zur Oozyte verloren gehen (MOOR et al. 1980;
EPPIG und WARD-BAILEY 1982, SUZUKI et al. 1994). In vivo haben qualitative Studien ergeben, dass die Verbindungen zwischen Cumuluszellen und Eizelle etwa 9-12 h nach dem LH-Peak aufgehoben werden (HYTTEL et al. 1986b). In vitro ermittelte HYTTEL (1987) in einem semiquantitativen Versuch, dass ein Verlust der interzellulären Verbindungen bereits nach 3 h IVM beginnt, aber erst nach 12-18 h vollständig abgeschlossen ist. Über diesen Zeitraum erstreckte sich auch die Cumuluszellexpansion (HYTTELetal.1986a).
Während der Reifung entwickelt sich zwischen den Zellen des Cumulus oophorus durch eine vermehrte Synthese von Glycosaminoglycanen (DEKEL et al. 1979;
EPPIG 1979) eine muköse extrazelluläre Matrix (HENSLEIGH und HUNTER 1983).
Dies führt zur Auflockerung des Zellverbandes (HENSLEIGH und HUNTER 1983).
Die Cumuluszellexpansion kann nur unter dem Einfluss von FSH stattfinden (FUKUI und ONO 1989; EYESTONE und DE BOER 1993). Es kommt zur Sekretion von Hyaluronsäure (BALL et al. 1982). Der Prozess der Cumuluszellexpansion scheint bei den Tierarten unterschiedlich abzulaufen. Oozyten von Mäusen sezernieren einen für die Cumuluszellexpansion notwendigen Stoff (Cumulus-Expansion- Enabling-Factor: EPPIG et al. 1993; VANDERHYDEN 1993). Bei Schweinen wurde ein Plasminogenaktivator(PA) entdeckt, der eine lytische Zone um die Eizelle bildet (CHOI et al. 1998b). Er wird in unterschiedlicher Weise von den Cumuluszellen und der Oozyte selbst produziert (CHOI et al. 1998b). Die Funktion dieser muzinösen Cumulusmasse in vivosoll im Transport der Eizelle im Eileiter und inder Produktion
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von chemotaktischen Faktoren für das Spermium bestehen sowie zur Erhöhung der Spermienmotilitätbeitragen(BRADLEYund GARBERS1983).
2.2 Fertilisation
2.2.1 Fertilisationinvivo
Im Gegensatz zur Oozyte haben Säugetierspermien ihre Reifeteilungen zum Zeitpunkt der Befruchtung bereits beendet. Sie müssen allerdings noch einige Umwandlungsprozesse durchlaufen, bis sie ihre endgültige Befruchtungsfähigkeit erlangt haben. Diese Prozesse finden in vivo auf dem Weg von der Cervix bis zum Eileiter statt (HUNTER et al. 1987; YANAGIMACHI 1994) und dauern beim Rind etwa 6-8 h an (GRUNERT und BERCHTHOLD 1995; HUNTER 1997). Es laufen im Wesentlichen zweiVorgängeab:
§ Kapazitation
§ Akrosomenreaktion.
2.2.1.1 DieKapazitation
Die Kapazitation wurde erstmalig von CHANG (1951) und AUSTIN (1951) beobachtet, und von AUSTIN (1952) unter diesem Begriff definiert. Es laufen eine Reihe biochemischer und biophysikalischer Vorgänge am Spermium ab, die noch nicht bis ins Detail geklärt sind. In o.g. Prozessen kommt es zu Veränderungen der intrazellulären Ionenkonzentrationen,desMetabolismus, desMembranpotentialsund zu Modifikationen der Membranstruktur (TÖPFER-PETERSEN et al. 1996).
Letztendlich dienen all diese Veränderungen dazu, das Spermium auf die anschließende Zona pellucida-induzierte Akrosomenreaktion vorzubereiten.
Außerdem wird dem Spermium eine hyperaktive Motilität verliehen, die ihm eine aktiveBewegungzurEizellehinermöglicht (SUAREZetal.1991).
2.2.1.2 DieAkrosomenreaktion
Bei der folgenden Akrosomenreaktion fusioniert die äußere Akrosomenmembran mit der darunterliegendenPlasmamembran(YANAGIMACHIund USUI1974). Durch die
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entstehenden Poren kann der Inhalt der Akrosomen abgegeben werden. Es handelt sich vorwiegend um lytische Enzyme (z.B. Hyaluronidase und Akrosin), die für die Auflösung des Cumulus oophorus (HARRISON 1982) und die Penetration der Zona pellucida verantwortlichsind(GREEN1988). BeimRind kanndieAkrosomenreaktion erst mit Bindung des Spermiums an die Zona pellucida vollständig ablaufen (CROZET 1984). Die Penetration istbeendet,wenn das Spermium den perivitellinen Raum derOozyteerreichthat.
Mit der Rezeptor-vermittelten Bindung des Spermienkopfes an die Plasmamembran der Oozyte beginnt die Fusion von Spermium und Eizelle (CRAN 1989). Bei dieser Interaktion des Spermienkopfes mit der Oozyte kommt es zur Auslösung der kortikalen Reaktion. Die Membranen der kortikalen Granula fusionieren mit dem Oolemm und geben ihren Inhalt in den perivitellinen Raum ab. Die freigegebenen Enzyme bewirken die Zonareaktion (zona hardening), d.h. sie zerstören die Bindungsstellen für Spermien an der Oozytenmembran und verhindern somit die Penetration weiterer Spermien(Polyspermieblock: SCHNORR1985). DieBedeutung der kortikalen Reaktion für die Ausbildung des Polyspermieblockes, wurde in der Literatur vielfach beschrieben (BARROS und YANAGIMACHI 1972; GWATKIN et al.
1973; SCHUEL1978;GULYAS1979; WOLF1981;SCHMELLetal. 1983).
Weitere Vorgänge bis zur Syngamie der beiden Vorkerne sind die Dekondensation des Spermienkopfes, die Fortsetzung der meiotischen Reifeteilung im weiblichen Kern mit Ausschleusung des 2. Polkörperchens und die Ausbildung der beiden Vorkerne. Mit abschließendem Größenwachstum der Vorkerne, wobei der männliche etwas größer erscheint (KING et al. 1985b), und ihrem Aufeinandertreffen im Zentrum der Eizelle kommt es zu deren Verschmelzung (XUund GREVE 1988). Die Vermischung (Amphimixis) der männlichen und weiblichen Chromosomen und die Anordnung in der Teilungsebene beenden die Syngamie. Das Ergebnis der Befruchtung ist die Zygote, die den Ausgangspunkt für die ersten mitotischen Furchungsteilungen darstellt(SCHNORR1985).
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2.2.2 Fertilisation in vitro (IVF)
Grundlegend unterscheidet sich die IVF nicht von den Vorgängen bei der Befruchtung in vivo. Voraussetzung für eine erfolgreiche Befruchtung ist eine abgeschlossene Reifung der Oozyte und die Kapazitation des Spermiums. Die Komplexität der Befruchtungsvorgänge erklärt die Problematik, im In-vitro-System optimale Bedingungen für eineBefruchtungzuschaffen.Die Fertilisationinvitroläuft oft nur unvollständig oder fehlerhaft ab. Ein Problem stellt dabei die asynchrone Entwicklung der beiden Vorkerne im Ooplasma dar (XU und GREVE 1988). Von einer gehäuft auftretenden Polyspermie wird ebenfalls berichtet (HYTTEL et al.
1988). Die Ursache dafür ist vermutlicheine unzureichende Verteilung derkortikalen Granula währendderZytoplasmareifung(HYTTEL etal.1989).
Faktoren, welche die Polyspermierate beeinflussen, sind die Spermiendichte im Fertilisierungsmedium sowie die Dauer der Kokultur von Oozyten und Spermien (LONG et al.1993). Die Angaben überdie optimale Spermienkonzentrationvariieren zwischen0,5und 6x106Spermien/ml(LINGundLU1990;SAEKIetal.1990; LONG et al. 1993; HEERES et al. 1996). Am häufigsten wird eine Spermienkonzentration von 1 x 106Spermien/ml im Fertilisierungsmedien verwendet (PARRISH et al. 1988;
FUKUI1990; GREVEetal.1993a; PALMAetal.1993).
Die Länge der gemeinsamen Inkubation von Oozyten und Spermien wird durch den zunehmenden negativen Einfluss absterbender Samenzellen sowie eine zunehmende Polyspermierate limitiert. Meist werden die Oozyten 18-24 h im Fertlisierungsmedium inkubiert (YOUNIS et al. 1989; CHIAN et al. 1992; JIANG et al.
1992; BRACKETT und ZUELKE 1993; LAZZARI undGALLI 1993; SHAMSUDDIN et al.1994). COXetal.(1993)sowieLONGetal. (1993)erzieltensogarschonnach 8h Inkubation bei den meisten Eizellen eine Spermienpenetration. Eine Verlängerung der Inkubationszeit auf 48 h führt zu niedrigeren Fertilisierungsraten (YOUNIS und BRACKETT 1990).
Für die Kapazitation der Spermien werden dem Fertilisierungsmedium Glycosaminoglycane zugesetzt. LEE und AX (1984) konnten diese im Reproduktionstrakt der Kuh nachweisen und machten sie dort für die
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Destabilisierung der Spermienmembran verantwortlich. WEGNER und KILLIAN (1992) fandenebenfallseinN-Acetylglycosamin,dass sowohlinvivoalsauch invitro von Eileiterepithelzellen synthetisiert wird. Es soll zur Modifizierung der Zona pellucida beitragen und damit dieInteraktion mit dem Spermium beeinflussen.Im In- vitro-System erreichten LENZ et al. (1983) durch Zugabe des Glycosaminoglycans Chondroitinsulfat A zum Fertilisierungsmedium eine Steigerung der Befruchtungsrate. Heute verwendet man vor allem Heparin (HANDROW et al.1982;
PARRISH et al. 1985; VAJTA et al. 1992; GREVE et al. 1993a; AVERY et al. 1994;
KANITZ et al. 1996; SAUNDERS und PARK 1999; SOMMERFIELD und NIEMANN 1999). Eine Kombination aus Heparin, Hypotaurin und Epinephrin hat sich ebenfalls bewährt (MILLER et al. 1994; KANITZ et al. 2000). Heparin wird dem Kapazitationsmedium in Konzentrationen von 1-100 µg/ml zugesetzt (MILLER et al.
1994; SAEKI et al.1995). Da dieHeparin-induzierte Spermienkapazitationbeijedem Bullen unterschiedlich stark abläuft, sollte die Heparinkonzentration für jeden Bullen in vitro individuell bestimmt werden (FUKUI et al. 1990; HILLERY et al. 1990;
STREICHER 1998;GILLESet al.2000).
Die genauen zellphysiologischenMechanismen, diebei derBindung desSpermiums an die Zona pellucida der Oozyte und bei der Auslösung der Akrosomenreaktion ablaufen, sind noch unklar. Das Vorhandensein von Spermienrezeptoren an der Zona wird vermutet, konnte aber bisher nur bei der Maus bestätigt werden (BLEIL und WASSARMAN 1980b; WASSARMAN 1987). Beim Rind wurden bisher 4 Zona- Proteine gefunden, deren Bedeutung allerdings noch nicht bekannt ist (TOPPER et al. 1993). Vermutlich dienen sie als Liganden für den Kontakt der Spermien mit der Zona und als primäre Agonisten für die Auslösung der Akrosomenreaktion (BLEIL und WASSARMAN 1983). Bei Mäuseeizellen werden über diese Agonisten unterschiedliche Signalübertragungswege aktiviert, die letztendlich zur akrosomalen Exozytose führen. Ein Übertragungsweg wird über G-Protein-vermittelte Rezeptoren in Gang gesetzt (YANAGIMACHI 1994; TÖPFER-PETERSEN et al. 1995). Das G- Protein fungiert als second messenger und aktiviert die Phospholipase C. Diese katalysiert die Umsetzung von Phosphatidyl-Inositol in Diacylglycerol und Inositol- triphosphat, das einen Influx von Ca2+ bewirkt (KOPFund GERTON 1991; STOREY
