Im letzten Schritt der In-vitro-Produktion werden die Rinderzygoten im Anschluss an die IVF bis zum Entwicklungsstadium der Morula oder Blastozyste kultiviert.
Während der IVC erweist sich die Entwicklungsphase vom 8- zum 16-Zeller, in der auch die Umstellung des Stoffwechsels vom maternalen auf das embryonale Genom erfolgt, als besonders kritisch. Das Phänomen des "In-Vitro-Blocks" konnte bei verschiedenen Tierarten beobachtetwerden (TELFORD et al. 1990). In derLiteratur werden eine Reihe von Kulturmedien, Kokulturen und Serumzusätzen beschrieben, mit deren Hilfe dieser Block in vitro überwunden und die Entwicklungsraten verbessertwerdenkönnen.
Die Kulturmedien setzen sich meist sehr komplex zusammen und unterscheiden sich im wesentlichen im Gehalt an Energiesubstraten, Aminosäuren und Nukleinsäurevorstufen. Am häufigsten wird das Medium TCM 199 verwendet (AOYAGI et al. 1990; FUNAHASHI et al. 1991; PALMA und BREM 1996;
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PEUCKMANN 2000). In Tabelle 1 sind einige Kulturmedien aufgeführt, die zur IVP verwendetwerden.
Tabelle 1:ÜbersichtüberKulturmedien zurIVCvonRinderzygoten
Medium Medium Autor
TCM199 TissueCultureMedium199 AOYAGI et al. 1990;
FUNAHASHI et al. 1991;
PALMA und BREM 1996;
PEUCKMANN2000 MénézoB2Medium MénézoB2Medium PLANTE und KING 1992;
SEMPLEetal.1993 MPM ModifiziertesParkerMedium BERG und BREM 1990;
PAVLOKetal.1992 MMM ModifiziertesMénézoMedium BEHRENS1992 HECM1 HamsterEssentialCultureMedium BAVISTERetal. 1992 SOFM SyntheticOviductFluidMedium ENRIGHT et al. 1999;
HOLM et al. 2000
Zur Überwindung des In-vitro-Blocks war es lange Zeit notwendig, die in vitro produzierten Embryonen in einem In-vivo-System (z.B. Kaninchen- oder Schafeileiter) eine begrenzte Zeit zu kultivieren (EYESTONE und FIRST 1986). Erst mit einer Kokultivierung auf einschichtigen Zellrasen (Monolayer oder Feederlayer) gelang es, diesen Block auch unter In-vitro-Bedingungen zu überwinden. Dadurch konnte dasIVP-Verfahrenenorm vereinfachtwerden, undesgewannzunehmend an Bedeutung für die Tierzucht (HAHN und BÜRKLE 1990; MERMILLOD et al. 1993;
THOMAS und SEIDEL 1993; BIELANSKI 1994). Für die IVC werden vorwiegend Monolayer oder konditionierte Medien von somatischen Zellen verwendet. So kann auf einem Cumuluszellmonolayer kultiviert werden, der sich aus den, den Embryonen anhaftenden Cumuluszellen während der IVC selbst bildet (BERG und BREM1991;REINTJES 1991;PEUCKMANN2000).InTabelle2sinddiewichtigsten
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Zelltypen zusammengefasst, die zur Kokultivierung von Rinderzygoten verwendet werden.
Tabelle 2:ÜbersichtderwichtigstenZelltypenzurKokultivierungvonRinderzygoten
Zelltyp Autor
Bovine Oviduct Epithelian Cells (BOEC)
AYOAGI et al. 1990; ECTORS et al. 1993;
BIELANSKI1994;TROUNSON etal.1994;
Granulosazellen BERGundBREM1990; CAROLANetal.1994;
Cumuluszellen BERG und BREM 1991; REINTJES 1991;
KOBAYASHIetal.1994; PEUCKMANN2000 BuffaloRatLiverCells(BRLC) REHMANetal.1994;KRÄUSSLICH etal.1997 Amnionsackzellen AOYAGI et al. 1990
Trophoblastvesikel HEYMAN et al. 1987; NAKAO und NAKATSUJI 1990
Kanincheneileiterzellen PROKOFIEVetal.1992
FetaleuterineEpithelzellen RODRIGUEZetal.1990;SCODRASet al.1991 Uteruszellen JIANGetal.1991
Die unterstützende Wirkungder somatischen Zellen auf die Entwicklungskompetenz der Embryonen während der IVC wird durch die Absonderung entwicklungsfördernder Stoffe sowie die Inaktivierung entwicklungshemmender Stoffe (z.B. durch Chelatbildung oder Verstoffwechselung) erklärt (BAVISTER et al.
1992; WATERMANundPOWELL1992).
Serum wird dem Kulturmedium zugesetzt, um den Embryonen wichtige Nährstoffe für ihreEntwicklungzurVerfügung zustellen.EsscheintvoralleminKombinationmit der Kokultivierung von somatischen Zellen einen positiven Einfluss auszuüben (FUKUI et al. 1991). SHAMSUDDIN et al. (1994) beobachteten in einem zellfreien System einen negativen Effekt des zugesetzten Serums. Zur Kultivierung von Rinderembryonen wurde hitzeinaktiviertes Serum vom Rentier (PROKOFIEV et al.
1992) vom Stier (MATSUOKA et al. 1992), vom Menschen (MATSUYAMA et al.
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1993), vom Kalb (FCS; HAMANO und KUWAYAMA 1993; TAKAHASHI und FIRST 1993) und von der Kuh (ECS; BERG und BREM 1990; JIANG et al. 1991;
CARNEGIE et al. 1997) eingesetzt. Die besten Ergebnisse wurden allerdings mit FCS und ECS erzielt (FUKUI et al. 1991; MATSUOKA et al. 1992). In der Regel werden die Seren dem Kulturmedium in einer Konzentration von 1-20 % zugesetzt (LUTTERBACH et al. 1987; JIANG et al. 1990; NAKAO und NAKATSUJI 1990;
MADISON et al. 1992; PROKOFIEV et al. 1992; TAKAHASHI und FIRST 1993;
MILLER etal.1994;CARNEGIEet al.1997).
Neben der Undefinierbarkeit dieser IVC-Systeme (Kulturmedien, Kokulturen, Sera) stellt auch die Vergleichbarkeit der in unterschiedlichen Systemen erzielten IVP-Ergebnisse ein erhebliches Problem dar. Daher versucht man definierbare und standardisierbare Kultursysteme zu entwickeln (BAVISTER et al. 1992). Hierzu zählt z.B. das Chatot-Ziomek-Bavister-Medium (CZBM; CHATOT et al. 1989). Mit diesem Medium konnten der Kultivierung mit TCM 199 vergleichbare Blastozystenraten erzielt werden (KIM et al. 1990; HERNANDEZ-LEDEZMA et al. 1993). KAJIHARA et al. (1999) verwendeten mitErfolg das Charles Rosenkrans1 Medium (CR1Medium;
ROSENKRANS et al. 1990). Auch das „Synthetic Oviduct Fluid Medium“ (SOFM) gewinnt für dieIVC zunehmend anBedeutung(MATSUYAMA etal. 1993; ENRIGHT et al. 1999; HOLM et al. 2000). Bei Verwendung des SOFM wird sowohl von niedrigeren (CROSIER und FARIN 1998) als auch von höheren Blastozystenraten (FUKUI et al. 1991) berichtet als nach IVC mit TCM 199. FANCSOVITS et al. (1998) verglichen die definierten Medien CR1 und SOFM, denen jeweils BSA zugesetzt wurde, mitdem herkömmlichenTCM199,das eineGranulosazell-Kokultur und10 % ECS enthielt. In allen drei Medien wurde der In-vitro-Block in gleichem Maße überwunden. In SOFMentwickelten sichaber signifikant wenigerBlastozystenals im CR1-Medium undTCM199(33%bzw.45%).
Um die somatischen Zellen im IVC-System besser zu definieren, werden transformierte, permanente Zelllinien von BRLC (VAN INZEN et al. 1992;
KRÄUSSLICH et al. 1997) oder bovine fetale Eileiterepithelzellen (SINGH und MC NAMARA 1992) eingesetzt. Eine Kokultivierung mit Vero-Zellen, die aus Nierengewebe von Grünaffen isoliert werden, scheint ebenfalls gute embryonale
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Entwicklungsraten zu erzeugen (CARNEGIE et al. 1997). Die im IVC-System verwendeten Sera können durch Surfaktantbestandteile ersetzt werden (PALASZ et al. 1993). Z.B. werden Polyvinylpyrrolidon(PVP) und Polyvinylalkohol (PVA) bovines Serumalbumin(BSA)substituiert (ROSEundBAVISTER1992;ROSENKRANSet al.
1993). Dieses enthält allerdings ebenfalls undefinierte Bestandteile, wie Fette (MÉNÉZO et al. 1982) und Wachstumsfaktoren (KANE 1985). Den WachstumsfaktorenEGF (Epidermal growthfactor), IGF-I(Insulin-likegrowthfactor), TGF-ß 1(Transforminggrowthfactor)undPDGF(Platelet derivedgrowthfactor)wird ein positiver Effekt auf die embryonale Entwicklung zugeschrieben (PALMA und BREM 1996;MOREIRA 2002). DerNachteilder Serumbestandteilebestehtnicht nur in ihrer Undefinierbarkeitsondern auch inihrer morphologischen Qualitätsminderung der Embryonen (ABE et al. 1999). Bei Verwendung von Kälberserum im Kulturmedium konnte im Vergleich zu serumfreiem Kulturmedium eine verstärkte Anhäufung von Lipideinschlüssen im Zytoplasma der Zellen beobachtet werden (ABE et al.1999). WRENZYCKIetal. (2000)entwickelten semiquantitative RT-PCR-Assays, mit denen relative Gehalte spezifischer Gentranskripte in Rinderembryonen untersucht werdenkönnen. SiefandengroßeUnterschiede indenrelativenGehalten spezifischer Gentranskripte zwischen in vivo und in vitro produzierten Rinderembryonen, die für die frühe Embryonalentwicklung eine wichtige Rolle spielen. Auch führen verschiedene Proteinzusätze (BSA, ECS oder PVA) zu Veränderungen in den relativen Gehalten dieser Transkripte.