Reifungsmedien und ihre Zusätze

Die erfolgreiche Reifung der Oozyte ist für die anschließende Befruchtung und WeiterentwicklungvongroßerBedeutung(MATTIOLI1996). Dieinvitroverwendeten Reifungsmedien üben einen signifikanten Einfluss auf die Fertilisation der Oozyten und deren folgende embryonale Entwicklung aus (CRITSER et al. 1986; ZUELKE und BRACKETT1990).

2.1.1.3.3.1 Reifungsmedien

Das am häufigsten verwendete Medium für die In-vitro-Reifung beim Rind ist das TCM 199 (Tissue Culture Medium 199), dem verschiedene Seren, Gonadotropine

(FSH und LH) und gegebenenfalls Steroidhormone (E2: Estradiol-17β; P4: Progesteron) zugesetzt werden (YOUNIS et al. 1989; MADISON et al. 1992;

BRACKETT und ZUELKE 1993; GREVE et al. 1993a). Aber auch mit anderen Medien lassen sich gute Reifungsergebnisse erzielen. Von sieben kommerziell erhältlichen Medien erwiesen sich fünf für eine IVM als verwendbar (Fa. Sigma St.

Louis (MO): SFRE 199-2 Medium; MEMα: Eagle´s Minimum Essential Medium-α;

MEMα/+: MEMα mit Deoxy- und Ribonucleotiden; 1:1 RPMI-1640:MEMα; Fa. Gibco Grand Island (NY): TCM199). Das Waymouth´s Medium MB 752/1 (Fa. Sigma)und das Ham´s F-12 (Ham´s nutrient mixture F-12; Fa. Sigma) erschienen als ungeeignet (ROSE und BAVISTER 1992). Von GÖTZ (1995) wurde das Modified Parker Medium (MPM)erfolgreicheingesetzt.

Seit einigenJahren findengenau definierbareMedien (z.B.SOFM:Synthetic Oviduct Fluid Medium), denen verschiedene Proteinquellen (Serum, BSA: bovines Serumalbumin, Aminosäuren)zugesetzt werden, immer breitere Anwendung (HOLM et al. 1997; AVERY et al. 1998; PALMA et al. 1999). Durch die genaue Definierbarkeit des SOFM können die IVP-Ergebnisse unterschiedlicher Labors besser miteinander verglichen werden. Zudem ist bei Kultivierung in SOFM die Transkriptionsaktivität derentwicklungsspezifischenGene vonEmbryonenderinvivo ähnlicher alsbei Kultivierungin TCM 199 (WRENZYCKI et al.2000). Die genannten Standardmedien wurden meist fürandere Zwecke entwickelt undentsprechen daher

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nicht der Zusammensetzung der Follikel- bzw. Eileiterflüssigkeit. Man benötigt daher bestimmte Zusätze wie Proteinquellen, Hormone und Cumulus- oder Granulosazellen.

2.1.1.3.3.2 Proteinquellen

AlsProteinquelle wirdvorallem Serumeingesetzt.Amhäufigsten wirdBlutserumvon Kühen verwandt, das zum Zeitpunkt ihrer stehenden Brunst, etwa 24 h vor der Ovulation gewonnen und hitzeinaktiviert wird (ECS: östrisches Kuhserum;

SCHELLANDER et al. 1990; GREVE et al. 1993a). Auch fetales Kälberserum (FCS:

MATSUOKA et al. 1992), Ochsen- (CAROLAN et al. 1993) und Bullenserum (KANITZ et al. 1996) werden vereinzelt eingesetzt. Angaben über die günstigste Konzentration des Serumzusatzes reichen von 10 (KIM et al. 1990; NAKAO und NAKATSUJI 1990; OCAÑA-QUERO et al. 1999) bis 20 % (FUKUI und ONO 1989;

KEEFER etal.1991;OCAÑA-QUEROetal. 1999).

2.1.1.3.3.3 Hormone

Die bedeutende Rolle von Hormonen bei der Regulation des Follikelwachstums und der Follikelreifung in vivo macht die Zugabe von Hormonen auch bei der IVM erforderlich. In vivo wird durch die Ausschüttung des Gonadotropin-Releasing-Hormons (GnRH) aus dem Hypothalamus die Freisetzung der Gonadotropine FSH und LH in der Hypophyse induziert. Während einer Follikelreifungswelle erreichen sie bestimmte Konzentrationen und bewirken die Oozytenreifung sowie die Ovulation des dominanten Follikels (DRIANCOURT 1996). Die genauen Mechanismen für die Wirkung der Hormone sind noch weitgehend unbekannt (ZUELKE und BRACKETT 1993). Ihre Wirkung wird wohl durch die Cumulus- und Follikelzellen (Theka- und Granulosazellen) vermittelt, da die Eizellmembran selbst keine Rezeptoren für Gonadotropine besitzt (MATTIOLI 1996). Während des Follikelwachstums steigt die Anzahl der FSH-Rezeptoren an den Granulosazellen und die der LH-Rezeptoren an den Thekazellen (RÜSSE und SINOWATZ 1991). In den Granulosazellen wird Inhibin gebildet, das über einen negativen Feed-back-Mechanismus die

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kontrollierte FSH-Freisetzung hemmt (ECHTERNKAMP und SCHANBACHER 1990).

Die Aufgabe der Thekazellen besteht in der Sekretion von Androgenen, die in den Granulosazellen zuÖstrogenen(E2)aromatisiertwerden.

Im In-vitro-System werden dem Maturationsmedium die Gonadotropine als Serumbestandteil und/oder in Form von Hormonpräparaten zugesetzt. Der Einfluss der Hormone auf die Reifung kann anhand der Kernreifung, der Cumuluszellexpansion sowie der Befruchtungs-und Weiterentwicklungsrateermittelt werden(SÜSS etal.1990).

LH scheint einen positiven Einfluss auf die Meiose auszuüben. Mit einer Supplementation von LH kann eine gesteigerte Weiterentwicklungsrate nach Befruchtung erzielt werden (BRACKETT et al. 1989; ZUELKE und BRACKETT 1990). LH aktiviert die Adenylat-Zyklase und bewirkt damit einen Anstieg des meiosehemmenden cAMP(HOMA1995). Außerdemstimuliert esdieProduktion von Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3), was einen intrazellulären Anstieg der Ca²⁺ in der OozytezurFolgehat(HOMA1995). DurcheineDepolarisationderOozytenmembran kommt eszumÖffnender Ca²⁺-Kanäle unddamitzueinem verstärktenCa²⁺-Influx in die Eizelle (MATTIOLI et al. 1991b). Die aktivierende Wirkung der Ca²⁺ überwiegt gegenüber der des cAMP und der meiotische Block kann überwunden werden.

LH hat zudem einen positiven Einfluss auf den Metabolismus der Eizelle. Es stimuliert die Glycolyse, die mitochondriale Glucose-Oxidation sowie den Tricarboxylsäurezyklus und stellt der Eizelle damit die Energie zur Verfügung, die sie für die Weiterentwicklung benötigt (ZUELKE und BRACKETT 1992).

FSH scheint die Kernreifung zu verzögern (ABEYDEERA et al. 1999), da es den meiosehemmenden cAMP-Spiegel vorübergehend anhebt (SÜSS et al. 1990). Eine Steigerung der Blastozystenrate konnte durch Zugabe verschiedener FSH-Konzentrationen nicht erzielt werden (BARAÑAO und SALAMONE 1995).

EYESTONE und DE BOER (1993) sind da gegenteiliger Meinung. Für die Cumuluszellexpansion ist das Vorhandensein von FSH jedoch unumstritten eine notwendige Vorraussetzung (HENSLEIGH und HUNTER 1983; FUKUI und ONO 1989).

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Da im Serum (ECS, FCS oder Bullenserum) bereits Hormone enthalten sind, ist die zusätzliche Supplementation von Hormonzusätzen zum Reifungsmediumumstritten.

Bei Verwendung vonFCS-haltigem Reifungsmediumkann keinzusätzlicher positiver Effekt einer LH/E2 bzw. FSH/E2-Supplementation gefunden werden (GOTO und IRITANI 1992). Auch der Zusatzvon FSH undLH zu Bullenserum-supplementiertem Reifungsmedium führt zu keinem besseren Ergebnis in der Embryonenproduktion (ARLOTTO 1998).

Bei gleichzeitiger Zugabe von Gonadotropinen und Steroiden (E2; P4) zum serumhaltigen Reifungsmedium (z.B. die Kombination von E2 mit FSH und LH) scheint eine Steigerung der Fertilisierungsrate möglich zu sein (FUKUSHIMA und FUKUI 1985; YOUNIS et al. 1989). Dieselbe Hormonsupplementation wird auch im serumfreien Reifungsmedium gebraucht (SAEKI et al. 1991). Zum Teil wirkt sich ein E2-Zusatz ehernegativ auf die Reifung aus(RYAN etal. 1999). Besser scheinen die Entwicklungsraten ineinem Maturationsmediumzusein, dasFSH, LHundP4enthält (RYAN et al. 1999). GRIMES und IRELAND (1986) sprechen dem P4 jedoch einen positiven Einfluss aufdie Kernreifungab. DieWirkungderSteroide E2undP4auf die ReifungistanscheinendbedeutsameralsdiederGonadotropine(FUKUIetal.1982).

Auch dem TSH (Thyreotropes Hormon) wird ein positiver Einfluss sowohl auf die Cumuluszellexpansion als auch auf die Reifungs- und Entwicklungsfähigkeit von COKs zugesprochen (YOUNIS und BRACKETT 1992). Das Hormon ist auch in der Lage, die zytoplasmatische Glucose-Oxidation und die Aktivität des Pentosezyklus zu steigern.

Die Verwendung des gonadotropen Hormons Prolaktin (PRL) bei der IVM verbessert zwar nicht direkt die Oozytenreifung, führt aber zu einer Erhöhung der Blastozystenrate. GranulosazellenimMaturationsmediumwerdenunterdemEinfluss von PRL zur Bildung von Faktoren veranlasst, die vermutlich die Zytoplasmareifung anregen (KUZMINA et al. 1998). Aufgrund der verzögerten Kernreifung in vitro, verbunden mit einer verbesserten Zytoplasmareifung ist auch die Entwicklungskompetenz der Oozyten nach PRL-Behandlung verbessert (KANITZ et al. 1996; HELEIL 1999). So sind nach Zugabe von PRL zum Reifungsmedium

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deutlich mehr intakte Metaphase II-Stadien vorhanden. Keine Verbesserung durch PRLkonnten SAEKIetal. (1991)erreichen.

Wachstumshormon (GH) und Wachstumsfaktoren (Epidermal growth factor [EGF]; Insulin-like growth factor I [IGF-I]) können sowohl auf die Kernreifungund die Cumuluszellexpansion (HARPER und BRACKETT 1993) als auch auf die embryonale Entwicklung einen positiven Effekt haben (BEVERS et al. 1998;

MOREIRAet al.2002).

GnRH, das im Hypothalamus gebildet wird, führt erst im Befruchtungsmedium zu einer gesteigerten Teilungsrate (FUNSTON und SEIDEL 1995). EineGenexpression (mRNA; messenger-Ribonukleinsäure) für GnRH-Rezeptoren konnte in reifen bovinen COKs gefunden werden, nicht aber die Rezeptoren selbst (FUNSTON und SEIDEL 1995). Dies lässt vermuten, dass die Wirkung des GnRH über eigene Rezeptoren vermittelt wird. In den Gonaden konnten bisher nur bei Ratten eigene GnRH-Rezeptoren identifiziertwerden(ACKLANDetal.1992).

2.1.1.3.3.4 Granulosa-undCumuluszellen

Neben dem Zusatz von Proteinquellen und Hormonen zum Reifungsmedium wird auch der Zugabe von somatischen Zellen, z.B. von Granulosazellen ein positiver Effekt auf die Entwicklungskompetenz von Rindereizellen zugesprochen (CRITSER et al. 1986; LUTTERBACH et al. 1987; LU et al. 1988, SIRARD und BILODEAU 1990; O´DOHERTY et al. 1996; ALM et al. 1998). Dieser Effekt ist mit der Bildung von E2 durch die Granulosazellen (FUKUI und ONO 1989) oder durch die Bildung anderer Faktoren erklärbar (SIRARD und BILODEAU 1990). Granulosazellen bilden das für die Eizellen als Energiequelle nutzbare Pyruvat (EPPIG 1977). Allerdings ist die positive Wirkung der Granulosazellen dosisabhängig (SIRARD et al. 1992).

Während niedrige Dosierungen (1,0-7,5 x 10⁶Zellen/ml) stimulierend auf die Meiose wirken (FUKUI und ONO 1989; SIRARD und BILODEAU 1990; MOCHIZUKI et al.

1991), erreicht man mit höheren Dosierungen (z.B. 10,0 x 10⁶ Zellen/ml) eher einen hemmenden Effekt (MOCHIZUKI et al. 1991). Bei steigender Granulosazellkonzentration nimmt deren Nährstoffverbrauch aus dem

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Reifungsmedium so stark zu, dass es für die Eizelle zu einem Energiedefizit kommt (MOCHIZUKIetal. 1991).

Die Expansion der Cumuluszellen während der Eizellreifung stellt ein wichtiges Kriterium für eine erfolgreiche Reifung dar. Gap junctions an den Zellfortsätzen ermöglichen den Transport von StoffenzwischenKeimzelle und somatischen Zellen, diebei derKoordinationund RegulationderReifungsvorgängeanderEizellebeteiligt sind (EPPIG 1991; MATTIOLI 1996; SIRARD et al. 1998). Viele Untersuchungen belegen die wichtige und notwendige Rolle eines intakten Cumulus-Oozyten-Komplexes (COK) für die Eizellreifung, da die IVM cumulusfreier (=denudierter) Eizellen in einer deutlich reduzierten Entwicklungskapazität der Oozyte resultiert (SHIOYA et al. 1988; LEIBFRIED-RUTLEDGE et al. 1989; YOUNIS et al. 1989;

MOCHIZUKI et al. 1991; HAZELEGER und STUBBINGS 1992; MADISON et al.

1992; CHIANundNIWA1994;ZHANGetal.1995).ImGegensatzdazukonnten KIM et al. (1996) bei Reduzierung der Cumuluszellzahl keinen Unterschied in der Entwicklungskompetenz der gereiften Eizellen feststellen. Es besteht eine direkte Korrelation zwischen der Dichte der Cumuluszellschicht und der Entwicklungsfähigkeit der gereiften Oozyten (HASHIMOTO et al. 1998). Dabei optimieren die Cumuluszellen entweder die Weiterentwicklung der Eizellen und/oder inaktivieren entwicklungshemmende Komponenten im Medium (HASHIMOTO et al.

1998). So kommtden CumuluszellenalsRezeptorträger undBildnerverschiedenster Syntheseprodukte für die Reifungsvorgänge in der Oozyte eine große Rolle zu. Sie produzieren Faktoren, welche die Zytoplasmareifung unterstützen (VANDERHYDEN und ARMSTRONG 1989; CHIAN et al. 1994). Es wird ihnen auch eine nutritive Funktion zugeschrieben (SATO et al. 1977; DE LOOS et al. 1991; ZUELKE und BRACKETT 1992). Ein metabolischer Austausch zwischen Cumuluszellen und Oozyte findet über die Gap junctions statt (DE LOOS et al. 1991; ZUELKE und BRACKETT 1992). Cumuluszellen spielen nicht nur bei den zytoplasmatischen sondern auch bei den nukleären Reifungsvorgängen eine wichtige Rolle. FSH-stimulierte Cumuluszellen erzielen einen regulierenden Effekt auf die cAMP-abhängige-Protein-Kinase und damit auch auf die Chromatinkondensation sowie die AktivierungdesMPF(TATEMOTOundTERADA 1998).

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Inwieweit die interzellulären Verbindungen für die Eizellreifung erforderlich sind, ist umstritten. So erweist sich eine leichte Auflockerung der Cumuluszellschicht durch eine Hyaluronidasebehandlung sogar als vorteilhaft für die Weiterentwicklungsfähigkeit der Eizellen (HAWK et al. 1992). Mit denudierten Oozyten, die auf einem Cumuluszell-Monolayer gereift wurden, konnte eine normale Fertilisation und embryonale Entwicklung erreicht werden (DOMINKO und FIRST 1991). ZHANG et al. (1995) erklären diese Ergebnisse durch eine nicht vollständige Denudation der Eizellen, deren verbleibende Cumuluszellkontakte ihre Wirkung entfalten können. Fest steht, dass im Verlauf der Cumuluszellexpansion die Verbindungen der Cumuluszellen zur Oozyte verloren gehen (MOOR et al. 1980;

EPPIG und WARD-BAILEY 1982, SUZUKI et al. 1994). In vivo haben qualitative Studien ergeben, dass die Verbindungen zwischen Cumuluszellen und Eizelle etwa 9-12 h nach dem LH-Peak aufgehoben werden (HYTTEL et al. 1986b). In vitro ermittelte HYTTEL (1987) in einem semiquantitativen Versuch, dass ein Verlust der interzellulären Verbindungen bereits nach 3 h IVM beginnt, aber erst nach 12-18 h vollständig abgeschlossen ist. Über diesen Zeitraum erstreckte sich auch die Cumuluszellexpansion (HYTTELetal.1986a).

Während der Reifung entwickelt sich zwischen den Zellen des Cumulus oophorus durch eine vermehrte Synthese von Glycosaminoglycanen (DEKEL et al. 1979;

EPPIG 1979) eine muköse extrazelluläre Matrix (HENSLEIGH und HUNTER 1983).

Dies führt zur Auflockerung des Zellverbandes (HENSLEIGH und HUNTER 1983).

Die Cumuluszellexpansion kann nur unter dem Einfluss von FSH stattfinden (FUKUI und ONO 1989; EYESTONE und DE BOER 1993). Es kommt zur Sekretion von Hyaluronsäure (BALL et al. 1982). Der Prozess der Cumuluszellexpansion scheint bei den Tierarten unterschiedlich abzulaufen. Oozyten von Mäusen sezernieren einen für die Cumuluszellexpansion notwendigen Stoff (Cumulus-Expansion-Enabling-Factor: EPPIG et al. 1993; VANDERHYDEN 1993). Bei Schweinen wurde ein Plasminogenaktivator(PA) entdeckt, der eine lytische Zone um die Eizelle bildet (CHOI et al. 1998b). Er wird in unterschiedlicher Weise von den Cumuluszellen und der Oozyte selbst produziert (CHOI et al. 1998b). Die Funktion dieser muzinösen Cumulusmasse in vivosoll im Transport der Eizelle im Eileiter und inder Produktion

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von chemotaktischen Faktoren für das Spermium bestehen sowie zur Erhöhung der Spermienmotilitätbeitragen(BRADLEYund GARBERS1983).

2.2 Fertilisation