3 MATERIAL UND METHODEN
3.2 In-vitro-Produktion von Embryonen selektierter Einzeltiere nach Behandlung mit equinem Choriongonadotropin (eCG)
Das unter Kapitel 3.1 beschriebene Verfahren zur In-vitro-Produktion (IVP) von Embryonen wurde auch für die Embryoproduktion bei selektierten Einzeltieren angewendet. IndiesemAbschnitt werdennurdieAbweichungenundBesonderheiten vono.g.Vorgehensweise erläutert.
Der gesamteVersuchwurde imET-Labor desBesamungsvereins inNeustadtan der Aisch durchgeführt. Die Bestimmung der Hormonkonzentrationen erfolgte im Labor
Material und Methoden 72
des Forschungsinstitutes für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere (FBN) in Dummerstorf.
3.2.1 Versuchstiere
Für den hier dargestellten Versuch wurden alle züchterisch wertvollen Kühe verwendet, die im Zeitraum Oktober 1999 bis April 2000 von Landwirten in Nordbayern für eine Embryoproduktion in vitro beim Besamungsverein Neustadt an derAisch angemeldetwordensind.DieGewinnung vonOvarienund Eizellenerfolgte nach der Schlachtungder Tiere. Die Tiere wurden gleichmäßig auf die Kontroll- und die Behandlungsgruppen aufgeteilt. Die 49 Spenderkühe gehörten den Rassen Deutsches Fleckvieh (n=42), Deutsche Schwarzbunte (n=3), Deutsche Rotbunte (n=1) und Gelbvieh (n=3) an. In einem Anamnesebogen (s. Kapitel 9.1) wurden alle relevanten DatenderSpendertiere erfasst.
3.2.2 AuswahlderEizelldonoren undVorbehandlungderTieremiteCGbzw.
einemPlacebo
Die 49 r wurden 3 Gruppen zugeordnet. Alle Kühe, die einen regelmäßigen Zyklus aufwiesen und aufgrund ihrer Konstitution nichtsofort geschlachtet werdenmussten, wurden der Untersuchungs- bzw. der Kontrollgruppe zugeordnet. Die Tiere der Untersuchungsgruppe (V) erhielten drei Tage vor der Schlachtung 2.500 I.E. eCG intramuskulär (Intergonan®, aus einer Charge, Fa. Intervet, Tönisvorst). Den Tieren der Kontrollgruppe (K) wurde zum gleichen Zeitpunkt 5 ml physiologische Kochsalzlösung (NaCl, Fa. Fresenius) intramuskulär appliziert. Zum Zeitpunkt der Behandlungbefandensich alleTiere zwischendem 8.und 15.Zyklustagund wiesen einen deutlichpalpierbarenGelbkörper auf.
Konnten Tiere aufgrund ihrer physischen Konstitution, bedingt durch Azyklie oder fehlende Bereitschaft des Landwirtes nicht vorbehandelt werden, wurden sie der O-Gruppe zugeordnet.
Material und Methoden 73
3.2.3 Gewinnung und Reifung der Oozyten
Während der Schlachtung wurden jeder Kuh zweiBlutproben entnommen. Die erste diente demAbstammungsnachweis,währenddiezweitefürdie Serumgewinnungzur Estradiol-17ß- undProgesteronbestimmunggenutztwurde.
Die Behandlung der Eierstöcke und die Oozytenisolierung erfolgten entsprechend der Beschreibung in den Kapiteln 3.1.2.1 und 3.1.2.2. Für die IVP der Embryonen wurden im Unterschied zu den Aktivierungsexperimenten alle Oozyten verwendet.
Sie wurden entsprechend ihrer Qualität in 5 Klassen eingeteilt und getrennt in einer Vierwell-Multischale (Fa. Nunc) weiterbehandelt. COKs der Klassen 1 und 2 wurden ineinem Wellzusammengefasst.
3.2.4 Bestimmung der Estradiol-17ß-Konzentration im Blutserum der Eizelldonoren
Die auf dem Schlachthof gewonnene Blutprobe wurde für 15 Minuten bei 1500 x g zentrifugiert und jeweils 1,5 ml des Plasmas in Plastikröhrchen (Fa. Eppendorf) eingefroren.
Die Bestimmung der Estradiol-17ß-Konzentration im Blutserum der Eizelldonoren erfolgte mit Hilfe der RIA-Technik (Radio Immuno Assay). Die Aufarbeitung der Proben erfolgte über 2 Tage. Am ersten Tag wurden die Proben extrahiert und am zweitenTagerfolgte dieAufarbeitungfürdieSzintillationsmessung.
Zur Extraktion von Estradiol-17ß aus den gesammelten Blutproben wurden jeweils 5 ml Ether mit 1 ml Blutplasma gemischt und für 10 Minuten auf dem Schüttler bewegt. Danach wurden die Proben für eine Stunde in der Kühltruhe bei -20 °C ausgefroren, der Überstand wurde dekantiert und bei 40 °C im Wasserbad eingedampft. DieProbenröhrchen wurdenmit 1 mlEther nachgespült und erneut bis zur Trocknungeingedampft.Die AufarbeitungderProben erfolgteerst 24h nach der Extraktion.In diesemZeitraumwurdendie ProbenimKühlschrankaufbewahrt.
Die Bestimmung der Konzentration an Estradiol-17ß in den einzelnen Proben erfolgte nachInkubationder ProbenmitTracerund AntiserumimSzintillationszähler.
Material und Methoden 74
Dazu wurde zunächst eine Eichkurve angefertigt. Aus konvektioniertem Estradiol-17ß wurden zunächst zwei Lösungen angesetzt, um, wie nachfolgend angegeben, dieEstradiol-17ß-Standardsherzustellen:
Lösung 1: 10 mgEstradiol-17ß / 500mlEthanol Lösung 2: 1,2 mlLösung1 / 100mlEthanol
Verdünnung1: 0,1 mlLösung2 + 4,9 mlPuffer = 480pg /100ml Verdünnung2: 1 mlVerdünnung1 + 1 mlPuffer = 240pg /100ml Verdünnung3: 1 mlVerdünnung2 + 1 mlPuffer = 120pg /100ml Verdünnung4: 1 mlVerdünnung3 + 1 mlPuffer = 60pg /100ml Verdünnung5: 1 mlVerdünnung4 + 1 mlPuffer = 30pg /100ml Verdünnung6: 1 mlVerdünnung5 + 1 mlPuffer = 15pg /100ml Verdünnung7: 1 mlVerdünnung6 + 1 mlPuffer = 7,5pg/100ml Anschließend wurden die Arbeitsverdünnungen von Tracer und Antiserum hergestellt.
Standards und Proben wurden danach entsprechend eines Schemas in Probenröhrchenpipettiert:
Bezeichnung Puffer1 Standard Tracer Antiserum Aktivkohle 3xMin:Totalaktivität 0,4 ml - 0,1ml - 0,5ml
3xMax:Restaktivität 0,9 ml - 0,1ml -
-6xBo:Leerwert 0,3 ml - 0,1ml 0,1ml 0,5ml
3xjedenStandard 0,2 ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,5ml
3xBo 0,3 ml - 0,1ml 0,1ml 0,5ml
Probenin2fachBestimmung:
Extrakt
0,3 ml - 0,1ml 0,1ml 0,5ml
3xBo 0,3 ml - 0,1ml 0,1ml 0,5ml
Material und Methoden 75
Nach Zugabe aller Substanzen wurden alle Röhrchen 10 Sekunden auf dem Schüttler bewegt, für 30 Minuten bei 37 °C inkubiert und anschließend für 2 h im Kühlschrank aufbewahrt.
Im Anschluss daran wurden alle Röhrchen mit Aktivkohle beschickt. Die Aktivkohle wurde bereits 10 Minuten vor der Zugabe zu den Proben im Eisbad gerührt. Die Zugabe der Aktivkohle zu den Probenröhrchen erfolgte unter Rühren ebenfalls im Eisbad. Die Röhrchen wurden 15 Sekunden geschüttelt und für 10 Minuten im Eisbad belassen.
Nach der 10-minütigen Aufbewahrung der Proben im Eisbad wurden die Proben bei 3000U/Minute und4°Czentrifugiert.VomÜberstandwurden500µlentnommenund mit2,5 mlSzintillatorflüssigkeitgemischt.
Die Messung der Proben erfolgte im Flüssigkeitsszintillationszähler (LKB, Turku, Finnland). Aussagen über Bindungsfähigkeit der Aktivkohle bzw. über die BindungsfähigkeitdesAntiserums wurdenwiefolgt getroffen:
Aussagen überBindungsfähigkeitder Aktivkohle =MIN:MAX=Wert(%) Aussagen überBindungsfähigkeitdes Antiserums =B0 :MAX=Wert(%).
Der Estradiol-17ß-Gehalt der untersuchten Proben kann aus der Eichkurve abgelesen werden und wurde im Versuch über den Flüssigkeitsszintillationszähler ausgegeben.
3.2.5 Bestimmung der Progesteronkonzentration im Blutserum der Eizelldonoren
Die auf dem Schlachthof gewonnene Blutprobe wurde für 15 Minuten bei 1500 x g zentrifugiert und jeweils 1,5 ml des Plasmas in Plastikröhrchen (Fa. Eppendorf) eingefroren.
Die Bestimmung der Progesteronkonzentration im Blutserum der Eizelldonoren erfolgte ebenfalls mit Hilfe der RIA-Technik. Im Gegensatz zur Bestimmung von Estradiol-17ß handelt es sich bei der Progesteronbestimmung um einen
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Assay, d.h. die Proben wurden nicht extrahiert. Es wurden 50 µl Blutplasma direkt in dieProbenröhrchenpipettiert.
Um denGehalt anProgesteron(P4)in denProben bestimmenzukönnen, muss eine Eichkurvemit bekannterMengeanReinsthormonmitjedem Assaybestimmt werden.
Dazuwurdeauseiner StandardlösungeineStandardreihehergestellt:
Lösung 1: 10 mgP4 / 100mlEthanol
Lösung 2: 100µlLösung1(10 µgP4) / 100mlEthanol
Verdünnung1: 0,4 mlLösung2 + 4,6 mlPuffer = 800pg /100ml Verdünnung2: 1 mlVerdünnung1 + 1 mlPuffer = 400pg /100ml Verdünnung3: 1 mlVerdünnung2 + 1 mlPuffer = 200pg /100ml Verdünnung4: 1 mlVerdünnung3 + 1 mlPuffer = 100pg /100ml Verdünnung5: 1 mlVerdünnung4 + 1 mlPuffer = 50pg /100ml Verdünnung6: 1 mlVerdünnung5 + 1 mlPuffer = 25pg /100ml Verdünnung7: 1 mlVerdünnung6 + 1 mlPuffer = 12,5pg/100ml Anschließend wurden die Arbeitsverdünnungen von Tracer und Antiserum hergestellt.
Standards und Proben wurden danach entsprechend eines Schemas in Probenröhrchenpipettiert:
Bezeichnung Puffer 1 Standard Tracer Antiserum Aktivkohle 3xMin:Totalaktivität 0,4ml - 0,1 ml - 0,5ml
3xMax:Restaktivität 0,9ml - 0,1 ml -
-6xBo:Leerwert 0,3ml - 0,1 ml 0,1ml 0,5ml
3x jedenStandard 0,2ml 0,1ml 0,1 ml 0,1ml 0,5ml
3xBo 0,3ml - 0,1 ml 0,1ml 0,5ml
Proben in2fach Bestimmung:
je50µlBlutserum
0,25ml - 0,1 ml 0,1ml 0,5ml
3xBo 0,3ml - 0,1 ml 0,1ml 0,5ml
Material und Methoden 77
Das weitere Vorgehen zur Aufbereitung der Proben bis zur Messung im Flüssigkeitsszintillationszähler (LKB, Turku, Finnland) entsprach dem zur Estradiol-17ß-Bestimmung.
Aussagen überBindungsfähigkeitder Aktivkohlebzw.überdieBindungsfähigkeitdes Antiserums wurdenwiefolgtgetroffen:
Aussagen überBindungsfähigkeitder Aktivkohle =MIN:MAX=Wert(%) Aussagen überBindungsfähigkeitdes Antiserums =B0 :MAX=Wert(%).
Der Progesterongehalt der untersuchten Proben kann aus der Eichkurve abgelesen werdenund wurdeimVersuchüberden Flüssigkeitsszintillationszählerausgegeben.
3.2.6 Auswahl der Bullen und IVF
Die IVF der gereiften Eizellen erfolgte mit tiefgefrierkonserviertem/aufgetautem Sperma von 19 verschiedenen Bullen, die den Rassen Deutsches Fleckvieh, Deutsche Schwarzbunte, Deutsche Rotbunte und Gelbvieh angehörten.
Spermatozoen von drei der genutzten Fleckviehbullen (Samurai, Humlang, Hordur) wurden in früheren Arbeiten (ASTIZ BLANCO1999; PEUCKMANN 2000) bereits mit positiven Ergebnissen für eine In-vitro-Befruchtung verwendet. Ejakulate dieser Bullen wurden für dieIVF der Eizellen/COKsvon37 Spendertieren genutzt(Samurai n=21; Hordur n=7; Humlang n=9). Alle anderen Bullen kamen nur einmalig zum Einsatz. Um das Risiko schlechter Fertilisationsraten bei nicht getesteten Bullen zu minimieren, wurden die Eizellen/COKs von 8 Tieren mit Mischsperma von zwei verschiedenen Bullenfertilisiert.
Die IVF der Eizellen und COKs erfolgte unter Nutzung der in Kapitel 3.1.3 beschriebenenMethode.
3.2.7 IVCderEmbryonen
In vitro fertilisierte Oozyten selektierter Einzeltiere wurden wie in Kapitel 3.1.5.1 beschrieben biszumTag9invitrokultiviert.
Material und Methoden 78
3.2.8 Tiefgefrierkonservierung der Embryonen
An den Tagen 7 bis 9 der Embryokultivierung wurden die erzeugten Blastozysten in möglichst frühem Expansionsstadium tiefgefroren. Das Einfriermedium (s. Kapitel 9.1)enthielt 10%Ethylenglycol(EG;Fa.Sigma)und 0,1MSucrose(Fa.Serva).
Die Blastozysten wurden aus der Kultivierungsschale entnommen und in Transportmedium (s. Kapitel 9.1) gewaschen. Danach folgte eine Äquilibrierungszeit von20 MinutenimEinfriermediumbeiRaumtemperatur.WährenddieserZeitwurden die Embryonen in Pailletten (Paillettes Bovines®: 0,25 ml; Fa. Albrecht, Aulendorf) aufgezogen. Die Randsäulen enthielten Transportmedium, die Mittelsäule, getrennt durch zwei Luftblasen, das Einfriermedium mit dem Embryo. Verschlossen wurden die Pailletten mit einem beschrifteten Plastikstöpsel (Fa. Wörrlein, Ansbach). Nach Äquilibrierung wurden die Pailletten in das Spiritusbad des Einfriergerätes (Modell SK91, Fa. Haake, Hamburg) bei einer Temperatur von -7 °C eingesetzt. An einem Programmgeber (PG 20, Fa. Haake) konnte die Solltemperatur eingestellt werden, die durch ein elektronisches Thermostat (Modell F3, Fa. Haake) im Spiritusbad geregelt wurde. Fünf Minuten später wurde durch Berühren einer Randsäule mittels einer in flüssigem Stickstoff gekühlten Metallöse die Kristallisation ausgelöst. Nach vollständiger Kristallisation der Pailletten wurde das Spiritusbad mit einer Kühlrate von 0,4 °C/Minute auf eine Endtemperatur von -32 °C abgesenkt. Zuletzt wurden die Pailletten zügig in flüssigen Stickstoff überführt und in beschrifteten Lifts im Stickstoffcontainer gelagert.
3.2.9 Embryotransfer
Die in vitro produzierten Embryonen der selektierten Spenderkühe wurden je nach Anzahl der vorhandenen Empfängertiere entweder frisch oder tiefgefroren/aufgetaut auf vorbereitete Rezipienten übertragen. Es wurden nur Blastozysten sehr guter bis guter Qualität transferiert bzw. tiefgefroren. Die Embryonen hatten eine runde bis leicht unregelmäßige Form. Die Zona pellucida war intakt, das Blastozoel und der Trophoblast deutlich erkennbar. Die Blastomeren waren uniform und zeigten eine
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gleichmäßige Verteilung über den ganzen Embryo (LINDNER und WRIGHT 1983;
KAUFFOLDund THAMM1985).
Je Rezipient wurde ein Embryo in das ipsilaterale Uterushorn übertragen. Dazu wurde ein vorgewärmtes sterilisiertes Transfergerät (Modell Hannover, Fa. Wörrlein, Ansbach) verwendet. Alle Transfers wurdenvom selben ET-Team durchgeführt. Die Trächtigkeitsuntersuchungen wurden durch rektale Palpation, frühestens 6 Wochen nach Transfer,vorgenommen.
3.2.9.1 AuswahlundVorbehandlungderRezipienten
Als Rezipienten wurden vor allem Jungrinder der Rasse Deutsches Fleckvieh genutzt, deren Zyklus bei palpierbarem Corpus luteum mit einem Prostaglandinpräparat synchronisiert wurde. Die Synchronisation der Rezipienten erfolgte zweiTage vor Schlachtungdes Eizelldonors. Ziel der Prostaglandininjektion war die Brunstinduktion an Tag 3 nach Injektion, d.h. zu dem Zeitpunkt, an dem im Labor dieIVFdurchgeführtwurde.
Kühe undJungrinder,diezudiesem Zeitpunkteinenatürliche Brunstzeigten,wurden ebenfallsalsRezipientenverwendet.
An Tag 7 nach der Brunst erfolgte der Embryotransfer, wenn sich bei den Rezipienten ein palpierbarer Gelbkörper gebildet hatte.
3.2.9.2 Frischtransfer von Embryonen
Für den Frischtransfer wurden die Embryonen aus der Kultivierungsschale entnommen und in äquilibriertem Transportmedium (s. Kapitel 9.1) gewaschen. In eine Paillette (Paillettes Bovines®: 0,25 ml; Fa. Cassou) wurden dann drei durch Luftblasen getrennte Säulen Transportmedium aufgezogen, in deren mittlerer Säule sich der Embryo befand. Der Transport der Embryonen zum Rezipienten erfolgte in einer Styroporbox, deren Innentemperatur mit einer Wasserflasche auf 35 °C gehalten wurde.
Material und Methoden 80
3.2.9.3 Transfer von Embryonen nach Tiefgefrierkonservierung
Unabhängig vom Alter der Embryonen erfolgte der Embryotransfer immer am 7.Zyklustagdes Rezipienten.Tag0desZykluswarderTagder Brunst.
Die Pailletten mit tiefgefrierkonservierten Embryonen wurden unmittelbar vor Ort auftgetaut. Dazu wurden sie zuerst 10 Sekunden an der Luft bewegt und anschließend 20 Sekunden in ein ca. 25 °C warmes Wasserbad gelegt. Der Plastikstöpsel wurde entfernt, die Paillette in das Transfergerät eingelegt und die Embryonen sofortübertragen.