Bestimmung der Entwicklungsfähigkeit von Rindereizellen nach Aktivierung mit Kalzium-Ionophore vor der IVM und IVF

In diesem Versuch sollte untersucht werden, ob eine Ca-I-Behandlungvon COKs zu Beginn derIn-vitro-ReifungeinenEinflussaufdienachfolgendeReifung,Befruchtung und Weiterentwicklung ausübt. Da ein kompakter Cumulusbesatz bei der Reifung essentiell ist (HAZELEGER und STUBBINGS 1992; MADISON et al. 1992), wurden nur COKs behandelt. Die Reifungszeit und das Aktivierungsmedium (mit bzw. ohne Ca²⁺undMg²⁺)wurdenwiederumvariiert.

Eine 18-stündige Reifung erfolgte neben einer Reifung über 24 bzw. 30 h, um abzuklären, ob durch die Ca-I-Behandlung eventuell die Reifungsphase verkürzt werden kann. Ohne Behandlung der COKs mit Ca-I wurde deutlich, dass die Reifungsrate nach einer18-stündigen IVM(63,8%)signifikant niedrigerwaralsnach 24-stündiger IVM(93,5 %).Eine Ca-I-BehandlungvorderReifung hattesowohlnach 18- als auch nach 24-stündiger Reifung keinen Einfluss auf die Reifungsrate (K18h: 63,8%bzw.G118h: 73,3%und G218h:69,2 %;K24h:93,5%bzw.G124h:91,4 % und G224h: 90,7 %). Aufgrund der geringeren Reifungsrate nach 18 h, müsste man annehmen, dass die Entwicklung dieser Eizellen nach Befruchtung und Kultivierung ebenfalls gering ist. Die Weiterentwicklungsraten der Blastozysten nach IVF und IVC sind aberzuallen 3Reifungszeitenannäherndgleich(BR/EZ ges.:K18h:19,9 %bzw.

K24h: 22,2 % bzw. K30h: 20,0 %). Gleiche Beobachtungen machten auch PROKOFIEV et al. (1992). DOMINKO und FIRST (1992) und TODOROV (1994) konnten sogar mit 16-18 h maturierten Eizellen bessere Blastozystenraten erzielen als mit 24 h gereiften. Im vorliegenden Versuch hatte sich nach 18 h Reifung der größte Teil der unreifen COKs bereits bis zur TelophaseI entwickelt. Die Endreifungdieser Eizellen könnte daher auch während der ersten Stunden der folgenden Befruchtungsphase erfolgt sein,solangenochbefruchtungsfähigeSpermien vorhandenwaren.

DurchBehandlungderCOKsmitCa-IvorIVMund Befruchtungkonntenurmiteinem Behandlungsschema eine signifikante Steigerung der Weiterentwicklungsrate erzielt werden.

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Wurden COKs im Ca²⁺/Mg²⁺-haltigen Aktivierungsmedium behandelt (G1) und 30 h lang gereift, so konnte eine Blastozystenrate bezüglich aller eingesetzten Eizellen von 36,8 %erreicht werden. DieseEmbryonenausbeute warsignifikant höherals die der Kontrolle (20,0 %) und der vergleichbar behandelten Gruppen kürzerer Reifungszeiten (G118h: 23,3 % und G124h: 21,9 %). Die hier erzielte Blastozystenrate war vergleichbar mit den besten Ergebnissen nach Ca-I-Behandlung aus Versuch 4.1.3 (40,3%und38,0 %).

Das Ergebnis zeigt, dass eine Ca-I-Behandlung der COKs vor einer 30-stündigen IVM einen positiven Einfluss auf die Entwicklungskompetenz der befruchteten Eizellen ausüben kann.

Da MC CONNELL et al. (1995) durch Behandlung von Mäuseoozyten mit Ca-I zu verschiedenen Zeitpunkten während der IVM keine Aktivierung erzielen konnten, scheint eine Aktivierungder Eizellenerst nachErreichen desMetaphase II-Stadiums möglichzusein. Möglicherweiseist dieseBeobachtungtierartspezifisch oderdieCa-I hat im vorliegenden Versuch andere physiologische Reifeprozesse außer der Kernreifung in Gang gesetzt, die für die Entwicklung der befruchteten Oozyten notwendig sind. MC CONNELL et al. (1995) sind der Meinung, dass die Fähigkeit der Oozyte von der Ca-I aktiviert zu werden, von der chromosomalen Reife abhängig ist.

Diese wird aber von einigen zytoplasmatischen Faktoren beeinflusst, die vom Beginn der Reifung bis zu ihrer Aktivität einige Zeit benötigen. Vermutlich ist dazu ein bestimmter intrazellulärer Ca²⁺-Spiegel oder das Vorhandensein von speziellen proteolytischen Übertragungswegen notwendig (MC CONNELL et al. 1995). Es konnte beobachtet werden, dass die Synthese eines bestimmten Proteinkomplexes (35kDa) zeitlich mit der Fähigkeit der Oozyte, auf die Ca-I zu antworten, zusammenfällt. Daher wird eine Mitbeteiligung dieses Proteinkomplexes an dem AktivierungsmechanismusderCa-Ivermutet(MCCONNELLet al.1995).

Außerdem wirkt die Ca-I wahrscheinlich auch bei unreifen Eizellen über eine Erhöhung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration, denn TOMBES et al. (1992) konnten bei Eizellen in der Entwicklungsphase zwischen dem GV-Stadium und der reifen Oozyte (Metaphase II) als Antwort auf eine Ca-I-Behandlung einen 3-4fachen

Diskussion 149

Anstieg der Ca²⁺-Freisetzung feststellen. Auch RACOWSKY (1986) gelang es bei Mäuse- und Hamsteroozyten, den cAMP-vermittelten Meioseblock bei unreifen Eizellen durch die Ca-I teilweise aufzuheben. Mit Ca²⁺-Kanal-Blockern konnte der Block noch verstärkt werden. Der reifungsstimulierende Effekt der Ca-I scheint allerdings von der Anwesenheit extrazellulärerCa²⁺während derAktivierung und der folgenden Reifungszeit abhängig zu sein. Möglicherweise stimuliert die Ca-I bei unreifen COKs den Influx von extrazellulären Ca²⁺. Jedenfalls lassen einige Studien vermuten, dass Ca²⁺-freies Medium keinen Einfluss auf den GVBD hat (LEIBFRIED und FIRST1979b;MARUSKAet al.1984).

Auch wennHOMAet al.(1993)undLIHEet al.(1997)eineBeteiligungvonCa²⁺ am Ablauf der Meiose für sehr wahrscheinlich halten, ist die Rolle der Ca²⁺ für den GVBD und die Reifungsvorgänge biszum Metaphase II-Stadium immer noch unklar.

HOMA (1991) konnte durch Behandlung von Rinderoozyten mit dem Ca²⁺-Chelator BAPTA den GVBD verhindern. Vermutlich wird die intrazelluläre Ca²⁺-Freisetzung über den Inositol-Phospholipid-Übertragungsweg induziert, denn LI HE et al. (1997) hemmten durch Injektion von Heparin, einem IP3-Rezeptor-Antagonist, die Eizellreifung und Aktivierung von Kinasen. Auch HOMA et al. (1991) erzielten durch direkte Mikroinjektion von IP3 die Induktion des GVBD. In anderen Studien wurde gezeigt, dassunreife Eizellen sensitiv sindfür Mechanismen,welchedie Freisetzung von IP3 und Ca²⁺ auslösen (PERES et al. 1991; CARROL und SWANN 1992). Die Ca²⁺-Freisetzung bei der Fortsetzung der Meiose findet aber nicht nur über die Freisetzung aus IP3-Speichern statt, sondern auch aus IP3-nicht-sensitiven Speichern (BETTERIDGE 1993). Neben dem IP3-Rezeptor wird im Zusammenhang mit der Steigerung der zytoplasmatischen Ca²⁺-Konzentration in Mäuse-, Schweine- und Rindereizellen auch der sogenannte Ryanodine-Rezeptor erwähnt (SWANN 1992; YUE et al. 1995; MACHATY et al. 1997). Der Erwerb der Fähigkeit der Eizelle zur vollständigen Ca²⁺-Freisetzung während der Maturation scheint ein wichtiger Indikator fürdiezytoplasmatischeReifung zusein(LIHEetal.1997).

Abschließend kann festgehalten werden, dass eine Behandlung von Eizellen und COKs mit Ca-I vor bzw. nach der IVM unter bestimmten Versuchsbedingungen zu

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einer gesteigerten Teilungs- und Weiterentwicklungsrate zur Blastozyste nach IVF führen kann. In weiterführendenUntersuchungen muss die Wirkung der Ca-Iauf die Ei- bzw. Cumuluszellen genauer, z.B. durch Messung der intrazellulären Ca²⁺ -Konzentration undderAktivitätbestimmter Proteinkinasennachgewiesen werden.

5.2 In-vitro-Produktion von Embryonen selektierter Einzeltiere nach