Bestimmung der Aktivierungsrate und parthenogenetischen Entwicklungsfähigkeit von Oozyten

In den ersten beiden Versuchen des hier dargestellten Versuchskomplexes wurde untersucht, inwieweit eine Behandlung von Eizellen bzw. COKs mit Ca-I unter den angewendeten Versuchsbedingungen zu einer parthenogenetischen Aktivierung von Rindereizellen führt. Außerdem wurde getestet, bis zu welchem Embryonalstadium dieEntwicklungder Parthenogenoneinder IVCvoranschreitet.

In Versuch 4.1.1 wurden Eizellen bzw.COKs nach einer 24- bzw.30-stündigen IVM und anschließender Ca-I-Behandlung für 24 h in vitro kultiviert. Die Kontrolle (K0) wurde sofort nach IVM fixiert. Unmittelbar nach der Reifung wurde eine spontane Aktivierungsrate von 8,8 % (IVM24h) und von 2,9 % (IVM30h)beobachtet. Wurden die gereiften Eizellen bzw. COKs über 24 h in vitro kultiviert, veränderte sich die spontane Aktivierungsrate nicht signifikant (K024h: 8,8 % bzw. K124h: 6,7 % und K224h: 12,5 %; K030h: 2,9 % bzw. K130h: 9,7 % und K230h: 10,0 %). Das Vorhandensein des Cumulusbesatzes während der IVC hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Aktivierungsrate unbehandelter Oozyten bzw. COKs.

Andere Forschungsgruppen arbeiteten vor allem mit Eizellen, die nach der IVM vom Cumulus oophorus befreit worden sind. Daher können diese Ergebnisse nur mit der Gruppe K2 verglichen werden. Die Angaben über spontane Aktivierungsraten von Oozyten, die über 24 h gereift wurden, liegen zwischen 0 und12 % (TROUNSON et al. 1977; NAGAI 1987; KONO et al. 1989; WARE et al. 1989; GREVE et al. 1993a;

SHI et al. 1993; VAN STEKELENBURG-HAMERS et al. 1993; YANG und SMITH 1993; PLANTE und KING 1996). Somit sind die eigenen Ergebnisse zur spontanen Aktivierung(12,5 %)mitdenLiteraturangabenvergleichbar.

Entgegen den Beobachtungen anderer Forschungsgruppen (WHITTINGHAM 1980;

KAUFMAN 1983; BARNES et al. 1993) nahm die Aktivierungsrate der Oozyten im eigenen Versuch mit zunehmender Reifungszeit nicht zu (K224h: 12,5 % bzw.

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K230h: 10,0 %). Der Parameter ist vergleichbar mit der von BODO et al. (1998) beobachteten Aktivierungsrate von 7,5 %, aber deutlich niedriger als die von NAGAI (1987), WARE et al. (1989), SHI et al. (1993) sowie VAN STEKELENBURG-HAMERSet al.(1993).SiebeobachtetenRatenzwischen18bis23 %.

Wurden die gereiften aber ansonsten unbehandelten Eizellen über 8 Tage weiter kultiviert, so war auch im eigenen Versuch mit zunehmender Reifungszeit die Tendenz zur Erhöhung der parthenogenetischen Entwicklungskompetenz erkennbar (Teilungsrate: K124h: 0 % bzw. K130h: 4,6 %; K224h: 0 % bzw. K230h: 1,2 %). Diese Beobachtung kann damit erklärt werden, dass bei alternden Eizellen der Mechanismus zum Erhalt des meiotischen Blocks verloren geht (BERGERE et al.

1992; PLANTE und KING 1993). Die Stabilität der Zytoplasmamembran nimmt mit zunehmender Reife der Eizelle ab. Die Oozyte wird empfindlicher gegenüber äußeren Einflüssen wie z.B. pH-Wert, Temperatur und Zusammensetzung des extrazellulären Milieus. Dadurch kann der meiotische Block leichter beeinflusst werden (WHITTINGHAM1980).WAREetal. (1989)vermuteten,dassältere Eizellen (ab 26 h IVM) auch empfindlicher auf das ”Handling” reagieren. Sie schlossen nicht aus, dass die Hyaluronidasebehandlung zur Entfernung des Cumulus oophorus bei 30 h gereiften Eizellen ein Auslöser für den Anstieg der Aktivierungsrate sein kann.

Da KAUFMAN (1983) Mäuseoozyten mit Hyaluronidase erfolgreich aktivieren konnte, kann man eine eigenständige Aktivierungskompetenz der Hyaluronidase nicht völlig ausschließen. In anderen Untersuchungen wird der Hyaluronidase allerdings nur eine geringe oder keine nennenswerte Aktivierungskompetenz zugeschrieben (NAGAI 1987; KING et al. 1988). Im eigenen Versuch ist eine Aktivierung durch die Hyaluronidasebehandlung ebenfalls auszuschließen, da die spontane Aktivierung nach Kultivierung cumulusfreier Eizellen (K2: 12,5 % und 10,0 %) nicht signifikant höher warals nachIVCvonCOKs(K1:6,7% und9,7%).

Die zytologische Auswertungvon Eizellen, welche über 24 bzw.30 h gereift wurden, ergab, dass 82-93 % das Metaphase II-Stadium erreicht hatten. Im Mittel war ein Anteil von 6,4 % (0-15 %) der gereiften Eizellen degeneriert oder zeigte Anomalien.

Die spontan aktivierten Oozyten befanden sich im Anaphase II- und Telophase II-Stadium. Nach 8 Tagen IVC zeigte ein großer Teil der nicht aktivierten Eizellen

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bereits Degenerationserscheinungen. Von den spontan aktivierten Eizellen hatten sich einige weiterentwickelt. Es konnten Eizellen mit 1 oder 2 Vorkernen beobachtet werden. Teilungsstadien mit bis zu 3 bis 16 Zellen entwickelten sich nur nach IVC von Eizellen, die über 30 h gereift wurden (K1: 4,6 % bzw. K2: 1,2 %). YANG und SMITH (1993) sowie PRESICCE undYANG (1994) berichteten über deutlichhöhere spontane parthenogenetischeTeilungsraten(9%bzw.11%).

Bis zum Vorkernstadium scheinen sich 85 % der Parthenogenone normal zu entwickeln (WARE et al. 1989). Der größte Teil ist haploid (74 %; KING et al. 1988).

Diese entwickeln sich ähnlich wie haploide Mäuseparthenogenone viel langsamer zur Blastozyste weiter (PLANTE und KING 1996) und haben eine geringere Überlebensrate als diploide Parthenogenone (KAUFMAN et al. 1977). Ob die Parthenogenone bereits im 2-Zellstadium meist haploid sind (PLANTE und KING 1996) oder sich noch bis zum 4-Zellstadium in der gleichen Zeit wie befruchtete Oozyten teilen (SIRARD et al. 1986) ist unklar. Unter dem Phasen-Kontrast-Mikroskop können die Parthenogenone bis zum 8-Zellstadium nicht von in vitro fertilisierten Embryonenunterschiedenwerden(PLANTEundKING 1996).

Bis zum 8. Tag der Kultivierung entwickelten sich im eigenen Versuch keine spontan aktivierten Eizellen zu Blastozysten weiter. Spontan aktivierte Rinderoozyten entwickeln sich nur sehr selten zu Blastozysten (1 %; YANG und SMITH 1993). Auch eine Verlängerung der IVC auf 9-14 Tage erhöht den Anteil parthenogenetischer Blastozystennicht (PLANTEundKING1996).

Die wenigen, in der Literatur beschriebenen, parthenogenetisch entwickelten Blastozysten zeigten deutliche strukturelle Unterschiede zu Embryonen, die aus IVF entstanden waren. Sie wiesen einen hohen Anteil an perivitellinem Zellmaterial auf, der ein Hinweis auf ein schlechtes Entwicklungspotential ist (VANBLERKOM 1989).

Die Blastomeren enthielten azentrische oder auch mehrere Kerne, was auf eine Deorganisation des Zytoskeletts zurückgeführt werden konnte (WEBB et al. 1986;

PLANTE und KING 1996). Eine vergleichsweise geringe Zahl an Mikrovilli und Fetttröpfchen ließ auf einen herabgesetzten Metabolismus schließen. Außerdem behinderten Kernanomalien möglicherweise die Ribosomen und damit die

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Proteinsynthese (VAN BLERKOM 1989). Aus diesen Beobachtungen kann geschlussfolgert werden, dass spontan aktivierte Rindereizellen meist der Retardierung verfallenundsichnurselten zuBlastozystenweiterentwickeln.

Durch dieBehandlungderCOKsbzw.Eizellenmit Ca-IwarimvorliegendenVersuch unter bestimmten Versuchsbedingungen eine Steigerung der Aktivierungsrate möglich. Ein signifikanter Anstieg der Aktivierungsrate wurde nach einer Ca-I-Behandlung von 24 h gereiften COKs erzielt (K1: 6,7 % bzw. G1: 19,6 % und G2: 22,1 %).

Ähnlich wie bei den Kontrollgruppen konnte mitzunehmenderReifungszeit vor allem bei Behandlung der Eizellen bzw. COKs im Ca²⁺/Mg²⁺-freien Aktivierungsmedium eine Erhöhung ihrer parthenogenetischen Entwicklungsfähigkeit in einer 8-tägigen IVC beobachtet werden (Teilungsrate: G224h: 0 % bzw. G230h: 12,1 %; G424h: 5 % bzw. G430h:57,1 %). Auch inVersuchen vonWHITTINGHAM (1980), BARNESet al.

(1993) und KAUFMAN (1983) wurde der Einfluss der Reifungszeit auf die AktivierungskompetenzderEizellendeutlich.

Bei einer IVC über 24 h wurde die Steigerung der Aktivierungsrate durch Verlängerung der Reifungszeit nur in Gruppe 4, in der die Eizellen ohne Cumulus

oophorus im Ca²⁺/Mg²⁺-freien Ca-I-Medium behandelt wurden, deutlich (G424h: 16,5 % bzw. G430h: 47,1 %). Das Fehlen von Ca²⁺ und Mg²⁺ im

Aktivierungsmedium scheint bei der Aktivierung von Oozyten ohne Cumulus oophorus eine große Rolle zu spielen, denn bei Behandlung von Eizellen im Ca²⁺/Mg²⁺-haltigen Ca-I-Medium (G3) konnte nach 30 h IVM nur eine Aktivierungsrate von 13,7% erzieltwerden. Die BedeutungdesVorhandenseins von bivalenten Kationen im Aktivierungsmedium wird an anderer Stelle noch ausführlich diskutiert. Die Ergebnisse der eigenen Versuche nach Behandlung cumulusfreier Eizellen mit Ca-I liegen deutlich unter denen anderer Forschungsgruppen. Sie erzielten nach einer IVM von 24 h in der Regel Aktivierungsraten von 25-37 % (WARE et al. 1989, SHI et al. 1993, GOTO et al. 1994) und nach einer IVM von 26-30 h Aktivierungsraten von 72 bis 96 % (WARE et al. 1989, AOYAGI et al. 1992, SHI et al. 1993, CHIAN und SIRARD 1995). Rindereizellen mit einer Reifungszeit

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von 26-30 h besitzen die höchste Aktivierungskompetenz (WARE et al. 1989). Die höchste Aktivierungsrate, die im eigenen Versuch mit einer Ca-I-Behandlung 30 h gereifter Eizellenerzieltwerdenkonnte,betrug47,1 %,dieParthenogeneseratenach 8Tagen IVC57,1%.

Generell zeigte die Ca-I-Behandlung bei COKs eine geringere aktivierende Wirkung als bei cumulusfreien Eizellen. Einer maximalen Aktivierungsrate von 22,1 % und einer Parthenogeneserate von 12,1 % nach Behandlung von COKs steht eine maximale Aktivierungsrate von 47,1 % und eine Parthenogeneserate von 57,1 % nach Behandlung cumulusfreier Oozyten gegenüber. Da der Verlust der interzellulären Verbindungen zwischen Cumuluszellen und Oozyte bereits nach 9-12 h IVM abgeschlossen ist (HYTTEL et al. 1987; 1999), scheinen die Cumuluszellen zum Zeitpunkt der Aktivierung für die Oozyten eher eine abschirmende Funktion gegenüber dem äußeren Milieu auszuüben. Möglicherweise reichte auch die Behandlungsdauer von 5 Minuten nicht aus, um der Ca-I eine Wirkung an der Oozytenoberfläche durch die Cumuluszellschicht hindurch zu ermöglichen. Da Ca²⁺ und Mg²⁺ im Aktivierungsmedium bei Oozyten mit Cumulusbesatzkeinen entscheidenden Einfluss auf dieAktivierungsrate hatten, wird die Annahme auf die abschirmende Wirkung der Cumuluszellen gegenüber dem extrazellulären Milieu unterstützt. Auch LEIBFRIED und FIRST (1979b) konnten divalenten Kationen im extrazellulären Milieu keinen Effekt auf Rindereizellen mit Cumulusbesatz zuschreiben.

Leider wurde bei den zitierten Autoren nicht immer genau angegeben, ob Ca²⁺ und Mg²⁺ im Aktivierungsmedium enthalten waren. In den eigenen Experimenten wurde ein Einfluss der Zusammensetzung des Aktivierungsmediums auf die Aktivierungsrate erkennbar. Er wirkte sich allerdings nur bei Oozyten aus, die 30 h gereift und ohne Cumulus oophorus aktiviert wurden (G4: 47,1 % bzw.G3: 13,7 %).

Ein Erklärungsansatz dafür könnte darin bestehen, dass durch die Abnahme der Stabilität der Zytoplasmamembran von Eizellen mit zunehmender Reife äußere Einflüsse leichter auf die Eizelle einwirken können (WHITTINGHAM 1980). Da cumulusfreie Eizellen stärker extrazellulären Einflüssen ausgesetzt sind als von Cumuluszellen umgebene, und da durch das Entfernen von Ca²⁺ und Mg²⁺ im

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extrazellulären Milieu das Konzentrationsgefälle zum intrazellulären Raum verstärkt wird,kann dieintrazelluläreFreisetzung vonCa²⁺indieserEizellgruppeamstärksten induziert werden. Dies könnte letztendlich auch zu einer höheren Aktivierungsrate führen. Ähnliche Auffassungen vertreten TSAFRIRI und BAR-AMI (1978). Sie vermuteten, dass die Abnahme von extrazellulären Ca²⁺ möglicherweise die intrazelluläre Ca²⁺-Mobilisierung in Eizellen von Ratten erhöht und es dadurch zur Fortsetzung der Meiose kommt. MARUSKA et al. (1984) beschrieben dieses Phänomenauchbeim Rind.

Die Bedeutung von Ca²⁺ und Mg²⁺ im extrazellulären Milieu konnte auch bei Verwendung vonOozyten andererTierarten festgestellt werden.STEINHARDT et al.

(1974; 1977)berichteten nachAktivierungvonSeeigel-undHamsteroozyten mitCa-I im Ca²⁺/Mg²⁺-freien Medium ebenfalls von höheren Aktivierungsraten als im Ca²⁺/Mg²⁺-haltigenMediumsowievoneinerschnelleren Aktivierung.DieEffizienzzur Aktivierung von Mäuseoozyten, wird bei einer Behandlung der Oozyten im Ca²⁺/Mg²⁺-freien Medium gleichermaßen erreicht (WHITTINGHAM und SIRACUSA 1978), wie nach einer direkten Injektion von Ca²⁺ ins Ooplasma (FULTON und WHITTINGHAM 1978). Wenn extrazellulär keine Ca²⁺ zur Verfügung stehen, muss der beobachtete intrazelluläre Ca²⁺-Anstieg durch Freisetzung aus intrazellulären Speichern erfolgen (CUTHBERTSON et al. 1981). Ob die Ca²⁺-Freisetzung aus intrazellulären Speichern sowohl fürdie Exozytoseder kortikalen Granula (LEEet al.

1988) als auch für die vollständige Kernaktivierung ausreicht (SURANI und KAUFMAN 1977), wird widersprüchlich diskutiert, denn für die vollständige Aktivierung von Mäuseeizellen sind z.B. auch extrazelluläre Ca²⁺ notwendig (DUCIBELLA et al. 1990). Bei Schweineoozyten konnte hingegen durch Behandlung mit Ca-I keine intrazelluläre Ca²⁺-Freisetzung sondern lediglich ein Influx aus dem extrazellulären Raum beobachtet werden (WANG et al. 1998), der weder eine Kernaktivierung noch eine vollständige kortikale Reaktion auslösen konnte (CRAN und CHENG 1986). Eskann davon ausgegangenwerden, dasdie Mechanismen zur Erhöhung derCa²⁺-KonzentrationimZytoplasmavonEizellentierartspezifisch sind.

Bei der zytologischen Auswertung der Kernstadien konnten keine Unterschiede zwischen den Kontrollgruppen, die bereits beschrieben wurden, und den mit Ca-I

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behandelten Gruppen festgestellt werden. Auffallend war, dass nach einer 8-tägigen IVC die Eizellen der am stärksten aktivierten Gruppe (G430h) auch die höchsten Entwicklungsstadien aufwiesen. In dieser Gruppe befand sich der größte Teil der aktivierten Eizellen in Teilungsstadien mit 2-16 Zellen, während die Eizellen der anderen Gruppen vorwiegend im Pronukleusstadium mit 1, 2 oder mehreren Vorkernen arretiert waren. In keiner der Gruppen, deren Eizellen mit Ca-I behandelt wurden, konnte bis zum8. Tagder IVCeine Blastozysteerzeugt werden.CHENund SEIDEL (1997) sowieLIUetal. (1998a)gelanges ebenfallsnicht, durchBehandlung vonEizellenmit Ca-IBlastozystenzuproduzieren.

Die Aktivierung in den ersten 24 h nach Ca-I-Behandlung lief überwiegend normal ab, d.h. bei 85 % der aktivierten Eizellen konnte die Ausbildung eines Vorkerns und die Ausschleusung des 2. Polkörpers beobachtet werden (WARE et al. 1989). Nur 1 % arretierteim TelophaseII-Stadium und14 %entwickelten 2und mehrVorkerne.

LIUet al.(1998a)konntenerstVorkernstadien beobachten,wenndieEizellenvorder Ca-I-Behandlung 30 h gereift wurden. Wurden hier Eizellen nur 24 h gereift, so arretierten 73 % der aktivierten Eizellen in einem Metaphase Stadium, in dem sich 2 Polkörper ausbildeten (LIUet al.1998a). DiesesStadium wirdauch alsMetaphase III bezeichnet. Im eigenen Versuch entwickelten sich 24 h gereifte und mit Ca-I aktivierte Eizellen vor allem zu den Stadien Anaphase II und Telophase II sowie zu einem Vorkernstadium mit einem Vorkern. Nach 30 h IVM erhöhte sich der Anteil Oozyten mit einem oder zwei Vorkernen vor allem nach Ca-I-Behandlung cumulusfreier Oozyten deutlich.

Die Ergebnisse der eigenen experimentellen Arbeiten zeigen, dass eine Aktivierung der Eizellen bzw. COKs mit Ca-I unter den angewendeten Versuchsbedingungen möglich ist. Im Rahmen der eigenen Arbeit sollte die Behandlung von Eizellen mit Ca-I nicht dazu dienen, durch Parthenogenese Blastozysten zu produzieren. Im Gegenteil, es wurde versucht, durch die Behandlung von Eizellen bzw. COKs mit Ca-I lediglich einen Aktivierungsimpuls zu setzen, der eigenständig keine Entwicklung der Eizellen zu Blastozysten induziert, in Verbindung mit der IVF aber die FertilisierungsrateundEntwicklungskompetenzderbefruchtetenEizellenfördert.

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5.1.2 Bestimmung der Entwicklungsfähigkeit in vitro gereifter, aktivierter