anschließendenBefruchtungundKultivierunginvitro
ZielderUntersuchung
Das Ziel der Untersuchung bestand in der Bestimmung des Einflusses einer Behandlung von COKs mit Ca-I vor einer In-vitro-Reifung auf die Entwicklung der in vitro befruchtetenund kultivierten Eizellen.In Ergänzungzu einerIVM über24 hund 30 h wurden die Eizellen im Experiment 4.1.4 auch über 18 h gereift, um zu bestimmen,obeineAktivierungvorderIVMeinen EinflussaufdaszeitlicheAuftreten derMetaphase IIhat.
Versuchsbeschreibung
Das Schema zum Ablauf des Versuches 4.1.4 zeigt die Abbildung 15.
Nach der Gewinnung wurden die COKs wie in Kapitel 3.1.4 beschrieben mit Ca-I behandelt. Das zur Aktivierung verwendete Medium enthielt (G1) bzw. war frei von Ca2+ und Mg2+ (G2). Anschließend wurden die COKs für 18, 24 bzw. 30 h in vitro gereift (s. Kapitel 3.1.2.4). Als Kontrolle (K) wurde immer ein Teil der COKs ohne Aktivierungsbehandlung gereift. Die IVF der COKs, die Kultivierung der Embryonen und Auswertung der Ergebnisse erfolgte entsprechendden Angaben in denKapiteln 3.1.3., 3.1.5.1und 3.3.
Ergebnisse 110
GewinnungderCOKs
Ca-IinDPBSmit/ohneCa2+/Mg2+
Kontrolle:
Ohne Behandlung
Gruppe 1:
DPBS mit Ca2+/Mg2+
Gruppe 2:
DPBS ohneCa2+/Mg2+
IVM der COKs
18h 24h 30h
IVFderCOKs
IVC über8Tage
Fixation/ Färbung/zytologischeAuswertung
Abbildung 15:SchemazumAblauf desVersuches4.1.4
Um zu untersuchen, welchen Einfluss eine Behandlung der COKs mit Ca-I vor der Reifung auf die Meiosekonfiguration der Eizellen bei Reifungsende hat, wurde eine Stichprobe aus jeder Gruppe sofort nach der Reifung fixiert und zytologisch ausgewertet.
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Untersuchung sind in den Tabellen 11 und 12 sowie in den Abbildungen 16und17dargestellt.
Ergebnisse 111
Tabelle 11: Reifungsstadien nach einer 18- bzw. 24-stündigen IVM im Anschluss an eine BehandlungderCOKs mit20µMCa-I inDPBS mitbzw.ohne Ca2+und Mg2+für 5Minuten beiRaumtemperatur
IVM18h IVM 24h
Reifungsstadien K G1 G2 K G1 G2
(n=149) (n=150) (n=146) (n=154) (n=140) (n=162)
MetaphaseI 9 7 9 1 0 1
aktivierteEizellen 1 (0,7%) G1: BehandlungvonCOKsmit Ca-IinDPBSmit Ca2+/Mg2+ vorder IVM18/24h; G2: BehandlungvonCOKsmit Ca-IinDPBSohne Ca2+/Mg2+ vorder IVM18/24h; Tabelle 11 zeigt den Einfluss einer Behandlung der COKs mit Ca-I vor der IVM auf die Meiosekonfiguration der Eizellen bei Reifungsende.Als gereift wurden die COKs angesehen, deren Zellkerne sich bis zur Metaphase II entwickelt hatten.
Wurden die COKs nur 18 h gereift, erreichte nur ein Anteil von 63,8 % der Oozyten das Metaphase II-Stadium. Die Behandlung mit Ca-I erhöhte den Anteil gereifter Oozyten nur umetwa 10 %(G118h: 73,3).Eine Verlängerung derIVMauf 24 hführte zu einer Erhöhung des Anteils an gereiften Oozyten (K18h: 63,8 % bzw. K24h: 93,5 %).
Die Behandlung von COKs mit Ca-I vor der IVM führte weder nach 18 h noch nach 24 h Reifung zu einer signifikanten Erhöhung des Anteils an Eizellen in der Metaphase II bei Reifungsende (K18h: 63,8 % bzw. G118h: 73,3 % und G218h: 69,2 %;
Ergebnisse 112
K24h: 93,5 % bzw. G124h: 91,4 % und G224h: 90,7 %). Eizellen, welche die Metaphase IInoch nichterreichthatten, befandensichüberwiegend inderTelophaseI.
a
b
c
d e
f
50 60 70 80 90 100
MetaphaseII(%)
K 63,8 93,5
G1 73,3 91,4
G2 69,2 90,7
18hIVM 24hIVM
Abbildung 16: Der Einfluss einer Behandlung von COKs des Rindes mit Ca-I in DPBS mit bzw. ohne Ca2+und Mg2+vor der IVM über 18 h bzw. 24 h auf den Anteil an OozyteninderMetaphaseIIbei Reifungsende;
Chi2-Testnach Wald(1943): p<0,05:(ad),(be),(cf)
K: keine BehandlungvonCOKsvorIVM; K18h: n=149 K24h: n=154 G1: Behandlung von COKs mit Ca-I in DPBS
mit Ca2+/Mg2+vor IVM; G118h: n=150 G124h: n=140 G2: BehandlungvonCOKsmitCa-IinDPBS
ohne Ca2+/Mg2+vorIVM; G218h:n=146 G224h:n=162 In Abbildung 16 wird der prozentuale Anteil gereifter Eizellen (Metaphase II) in den einzelnen Behandlungsgruppen nach 18 und 24 h IVM noch einmal graphisch dargestellt. Unabhängig von einer Ca-I-Behandlung vor der IVM ist bei einer
Ergebnisse 113
a b
c d
e
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Blastozystenrate/ eingesetzteOozyten(%)
K 19,9 22,2 20,0
G1 23,3 21,9 36,8
G2 22,8 28,6 21,9
18hIVM 24hIVM 30hIVM
Verlängerung der IVM auf 24 h ein signifikanter Anstieg des Anteils an gereiften Oozytenzubeobachten(K24h:93,5%bzw.K18h:63,8 %).
Abbildung 17: Der Einfluss einer Behandlung von COKs des Rindes mit Ca-I in DPBS mit bzw. ohne Ca2+ und Mg2+ vor der IVM auf die Blastozystenrate (bezogen auf die Anzahl eingesetzter COKs) nach IVC der befruchteten COKs über 8 Tage;
Chi2-Testnach Wald(1943): p<0,05:(ad),(bd),(cd),(ed) K: keineBehandlungvonCOKsvorIVM,IVFundIVC;
K18h: n=206 K24h: n=158 K30h: n=190 G1: BehandlungvonCOKsmit Ca-IinDPBSmitCa2+/Mg2+vorIVM,IVF undIVC;
G118h:n=159 G124h:n=146 G130h:n=193 G2: BehandlungvonCOKsmit Ca-IinDPBSohneCa2+/Mg2+ vor IVM, IVF und IVC;
G218h:n=184 G224h:n=161 G230h:n=178 In Abbildung 17 sind die Blastozystenraten nach IVF und IVC der aktivierten und gereiften COKsdargestellt.
Ergebnisse 114
Blastozystenraten, die nach Befruchtung und 8-tägiger Kultivierung von aktivierten, 18, 24 bzw. 30 h gereiften COKs erreicht werden konnten, lagen zwischen 21,9 % und 36,8%.
Gegenüber den Kontrollgruppen konnte durch die Behandlung nur bei einer Gruppe eine signifikante Erhöhung der Blastozystenrate erzielt werden. Die Behandlung der COKs mit Ca-I im Ca2+/Mg2+-haltigen DPBS und die anschließende IVM über 30 h führte nach IVF und Kultivierung der Embryonen zu einer signifikanten Erhöhung der Blastozystenrate (K30h: 20,0 % bzw. G130h: 36,8 %).
Signifikant erhöht ist dieser Wert auch im Vergleich zu den Gruppen, bei denen das gleiche Aktivierungsmedium verwendet, aber über einen kürzeren Zeitraum gereift wurde (G130h: 36,8 % bzw. G118h: 23,3 % und G124h: 21,9 %), sowie zuder Gruppe, deren COKs vor einer 30-stündigen Reifung im Ca2+/Mg2+-freien Aktivierungsmedium behandeltwurden(G130h:36,8% bzw.G230h:21,9 %).
Tabelle 12 beinhaltet dieZuordnung der erzeugtenEmbryonen zuEmbryonalstadien entsprechenddermorphologischen Beurteilung amEnde derIVCunddie Anzahlder nach Fixation,FärbungundzytologischerAuswertungbestimmtenZellkerne.
Bezüglich der Anzahl der Zellkerne waren keine Unterschiede unter den Gruppen festzustellen. DieerzeugtenBlastozystenenthielten zwischen64 und200Zellkerne.
Ergebnisse 115 Tabelle12:ErgebnissederEntwicklungvonCOKsnachBehandlungmit20µMCa-IinDPBSmitbzw.ohneCa2+ undMg2+ für5 MinutenbeiRaumtemperatur,18-,24-bzw.30-stündigerIVM,IVFundIVCderEmbryonenüber8Tage
K: keineBehandlungvonCOKsvorIVM,IVFvonCOKs,IVC;18/24/30h8d 2+2+ G1: BehandlungvonCOKsmitCa-IinDPBSmitCa/MgvorIVM,IVFvonCOKs,IVC; 18/24/30h8d 2+2+ G2: BehandlungvonCOKsmitCa-IinDPBSohneCa/MgvorIVM,IVFvonCOKs,IVC;18/24/30h8d
(n)(%)(n)(%)(n)(%)(n)(%)(n)(%)(n)(%)(n)(%)(n)(%) K18h20615374,373,452,410,53115,094,400,04119,9 G118h15911371,121,374,4116,9116,9106,353,13723,3 G218h18413171,284,331,621,12413,0116,052,74222,8 K24h15810667,1148,931,900,01610,1138,263,83522,2 G124h14610370,532,185,510,71711,685,564,13221,9 G224h16110665,853,142,521,22113,01811,253,14628,6 K130h19013973,263,273,773,7157,9168,400,03820,0 G130h19310353,4126,273,642,13015,53116,163,17136,8 G230h17812871,963,452,852,82011,2126,721,13921,9
gesamt
Ergebnisse 116
4.2 Untersuchungen zur In-vitro-Embryonenproduktion von züchterisch