Tierärztliche Hochschule Hannover
Vergleich in vitro produzierter Embryonen hinsichtlich ihrer Qualität nach dem Kryokonservieren durch Vitrifikation oder
konventionelle Kryokonservierung
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Hanna Stinshoff
Oldenburg
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Christine Wrenzycki
Klinik für Rinder, Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
1. Gutachterin: Prof. Dr. Christine Wrenzycki 2. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme
Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2009
Die vorliegende Arbeit wurde durch die H.W. Schaumann Stiftung gefördert.
Meinen Eltern und meiner Großmutter
Meinen Eltern und meiner Großmutter Meinen Eltern und meiner Großmutter
Meinen Eltern und meiner Großmutter
1. Einleitung ______________________________________________________ 1 2. Literatur ________________________________________________________ 3 2.1. In-vitro-Produktion von Embryonen __________________________________ 3 2.2. Grundlagen der Kryokonservierung __________________________________ 9 2.2.1. Physikalische Vorgänge beim Einfrieren von lebenden Zellen ____________ 9 2.2.2. Kryoprotektiva________________________________________________ 11 2.2.2.1. Nichtpenetrierende Kryoprotektiva_______________________________ 12 2.2.2.2. Penetrierende Kryoprotektiva __________________________________ 13 2.3. Konventionelle Gefrierverfahren ___________________________________ 16 2.3.1. Langsame Gefrierverfahren _____________________________________ 16 2.3.2. Schnelle Gefrierverfahren_______________________________________ 17 2.4. Vitrifikation ____________________________________________________ 19 2.4.1. Offene Systeme ______________________________________________ 21 2.4.2. Geschlossene Systeme ________________________________________ 23 2.4.3. Weitere Vitrifikationsmethoden ___________________________________ 24 2.5. Qualität in vitro produzierter Rinderembryonen nach dem Auftauen ________ 27 2.6. Entwicklungsrelevante Gentranskripte präimplantatorischer Rinderembryonen 32 2.6.1. DNA-Methyltransferase 3A (DNMT3A) _____________________________ 34 2.6.2. Glukosetransporter 1 (SLC2A1) und Glukosetransporter 3 (SLC2A3) _____ 36 2.6.3. Heat Shock Protein 70 (HSP70-1) ________________________________ 38 2.6.4. Interferon τ (IFNτ) _____________________________________________ 39 2.6.5. Zona occludens Protein 1 (TJP1) _________________________________ 40 2.6.6. E-cadherin (CDH1) ____________________________________________ 42 2.6.7. Desmocollin II (DSCII) _________________________________________ 43 3. Material und Methoden __________________________________________ 46 3.1. In-vitro-Produktion (IVP) _________________________________________ 46 3.1.1. Herkunft der Ovarien __________________________________________ 46 3.1.2 Vorbereitung und Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe____________ 46 3.1.3. In-vitro-Maturation_____________________________________________ 49
3.1.5. In-vitro-Kultur ________________________________________________ 51 3.2. Konventionelle Kryokonservierung _________________________________ 51 3.3. Vitrifikation ____________________________________________________ 53 3.4. Auftauen nach konventioneller Kryokonservierung _____________________ 55 3.5. Auftauen nach Vitrifikation ________________________________________ 56 3.6. Qualitätskontrolle der Embryonen nach dem Auftauen __________________ 58 3.6.1. Reexpansions- und Schlupfrate __________________________________ 58 3.6.2. Färbung ____________________________________________________ 58 3.6.3. Messenger RNA Analyse zur Darstellung entwicklungsrelevanter
Gentranskripte in bovinen präimplantatorischen Embryonen _________________ 60 3.6.3.1. Isolierung der mRNA _________________________________________ 61 3.6.3.2. Reverse Transkription (RT) ____________________________________ 62 3.6.3.3. Polymerase Kettenreaktion (PCR)_______________________________ 64 3.7. Statistische Analyse_____________________________________________ 67 3.8. Allgemeiner Versuchsaufbau ______________________________________ 69 3.8.1. Produktion der In-vitro-Embryonen und Etablierung der Vitrifikation und
konventionellen Kryokonservierung boviner Blastozysten ___________________ 69 3.8.2. Darstellung verschiedener entwicklungsrelevanter Gene aus vitrifizierten und konventionell kryokonservierten Rinderembryonen ________________________ 69 3.8.3. Versuchsanordnung ___________________________________________ 70 4. Ergebnisse ____________________________________________________ 71 4.1. Erstellung der in vitro produzierten Embryonen________________________ 71 4.2. Bestimmung der Reexpansions- und Schlupfraten _____________________ 71 4.3. Ergebnisse der Zellfärbung _______________________________________ 73 4.4.1. HSP70-1, SLC2A1 und TJP1 ____________________________________ 78 4.4.2. SLC2A3 und DNMT3A _________________________________________ 79 4.4.3. IFNτ _______________________________________________________ 80 4.4.4. CDH1 ______________________________________________________ 80 4.4.4. CDH1 ______________________________________________________ 81 4.4.5. DSC2 ______________________________________________________ 82 5. Diskussion ____________________________________________________ 83
5.1. Beurteilung der Reexpansionsraten, Schlupfraten und Zellzahlen _________ 86 5.2. Genexpression nach dem Auftauen ________________________________ 90 5.3. Schlussfolgerungen _____________________________________________ 96 6. Zusammenfassung ______________________________________________ 98 7. Summary _____________________________________________________ 101 8. Verzeichnisse _________________________________________________ 104 8.1.Verzeichnis der Tabellen ________________________________________ 104 8.2. Abkürzungsverzeichnis _________________________________________ 106 8.3. Abbildungsverzeichnis __________________________________________ 110 9. Anhang ______________________________________________________ 112 9.1. Einzeldaten der Zellzahlzählung nach Differentialfärbung _______________ 112 9.2. Einzeldaten der RT-qPCR _______________________________________ 113 9.3. Medien IVP __________________________________________________ 114 10. Literaturverzeichnis ___________________________________________ 119
1. Einleitung
Mit fortschreitender Weiterentwicklung und Anwendung der Biotechnologien in der Reproduktionsmedizin werden jährlich große Zahlen an Embryonen generiert, die frisch oder nach dem Tiefgefrieren auf Empfängertiere übertragen werden können.
Diese Embryonen werden zum einen in vivo erzeugt und durch Spülungen erhalten.
Zum anderen entstehen sie aus Oozyten, die durch Ovum Pick Up (OPU) erhalten wurden oder entstehen nach Ovarektomie aus den so gewonnenen Kumulus- Oozyten-Komplexen (KOK). Eine weitere Möglichkeit KOK zu gewinnen besteht darin, sie aus Ovarien, die vom Schlachthof stammen zu isolieren.
Im Jahr 2007 wurden weltweit über 400000 transfertaugliche Embryonen in vitro generiert. Von diesen konnten knapp 250000 Embryonen übertragen werden, von denen aber nur knapp 30000 zuvor kryokonserviert worden waren (THIBIER 2008).
Anhand dieser Zahlen lässt sich ermessen, dass sowohl die In-vitro-Produktion mit ihren anhängenden Biotechnologien als auch die Kryokonservierung in den letzten Jahren immens an Bedeutung gewonnen hat. Die Kryokonservierung scheint jedoch immer noch nicht optimal für in vitro gewonnene Embryonen einsetzbar zu sein.
Dass sich in vitro produzierte Embryonen im Vergleich zu ihren in vivo generierten Gegenstücken in vielen Punkten unterscheiden, ist vielfach untersucht worden. So z.B. sind Unterschiede hinsichtlich Morphologie, Farbe, Dichte, Zellzahl, Entwicklungsrate, Sensitivität Temperaturen gegenüber, Einfrierbarkeit, Trächtigkeitsraten nach dem Transfer (GREVE et al. 1994) und in der Expression spezifischer entwicklungsrelevanter Gentranskripte (WRENZYCKI et al. 1998;
WRENZYCKI et al. 2007) im Vergleich zu ihren in vivo erzeugten Gegenstücken erkennbar.
Anfang der 70er Jahre wurden die ersten Embryonen – in diesem Fall murinen Ursprungs – konventionell kryokonserviert (Whittingham 1971). Dies ermöglichte es, Embryonen zu lagern, ohne dass sie unbrauchbar wurden. Gleichzeitig entstanden durch das Einfrieren neue Schädigungsgefahren, wie z.B. durch intrazelluläre Eisbildung. Als RALL und FAHY 1985 die Methode der Vitrifikation das erste Mal
erfolgreich zur Kryokonservierung von Embryonen einsetzten, war die Möglichkeit eröffnet, Embryonen ohne die Gefahren der Eiskristallbildung zu konservieren.
Sowohl für die konventionelle Kryokonservierung als auch für die Vitrifikation wurden diverse Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, die Methoden zu optimieren. So wurden u.a. für das Verfahren der konventionellen Kryokonservierung immer neue Kryoprotektiva angewandt, um den Erfolg des Einfrierens zu verbessern (WHITTINGHAM 1971; BIELANSKI u. HARE 1988; SEIDEL et al. 1990; GUTIÉRREZ et al. 1993; SOMMERFELD u. NIEMANN 1999).
Auch für die Vitrifikation wurden im Laufe der letzten Jahre die Protokolle so verändert, dass deutliche Verbesserungen in den Überlebensraten nach dem Auftauen erzielt werden konnten. Hierbei wurde hauptsächlich an einer Erhöhung der Kühlraten, wie z.B. durch eine Verringerung des Probenvolumens (ARAV et al.
1993b; ARAV et al. 2002; YAVIN et al. 2009), gearbeitet.
Vergleiche zwischen den Ergebnissen, also den Überlebens- und Trächtigkeitsraten nach Transfer, beider Methoden auf morphologischer Ebene ergaben bislang, dass die Vitrifikation potentiell besser zur Kryokonservierung in vitro produzierter Embryonen geeignet zu sein scheint (DOBRINSKY 2002; KULESHOVA u. LOPATA 2002).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen Vergleich zwischen beiden Methoden nicht nur auf morphologischer Ebene durchzuführen, sondern zusätzlich auf molekulargenetischer Ebene festzustellen, ob die Kryokonservierung an sich und die Art der Tiefgefrierung einen Einfluss auf die Qualität der Embryonen hat.
Es ist bekannt, dass die Herkunft der Embryonen (in vivo vs. in vitro) einen Einfluss auf die mRNA–Expression verschiedener Gene hat. So wird z.B. bei in vitro produzierten bovine Embryonen signifikant mehr Interferon τ (WRENZYCKI et al.
2001a) exprimiert als bei ihren in vivo generierten Gegenstücken, dafür jedoch signifikant weniger Zona Occludens 1 (MILLER et al. 2003). Die Frage, die im Rahmen der angefertigten Arbeit erörtert werden sollte, war, ob die Kryokonservierung und die Art nach der eingefroren wurde, einen Einfluss auf die Expression verschiedener entwicklungsrelevanter Gentranskripte in vitro produzierter Embryonen aufweist.
2. Literatur
2.1. In-vitro-Produktion von Embryonen
Die In-vitro-Produktion (IVP) beinhaltet methodisch drei Schritte. Zunächst die In- vitro-Maturation oder –Reifung (IVM), darauf folgend die In-vitro-Fertilisation oder -Befruchtung (IVF) und anschließend die In-vitro-Culture oder –Kultur (IVC; SIRARD u. COENEN 2006).
Die In-vitro-Produktion bildet nicht nur die Grundlage für weitere biotechnologische Methoden [erfolgreiche Nutzung von beim Ovum-Pick-Up (OPU) gewonnenen Eizellen, somatischer Kerntransfer u.a.], sondern hat in den letzten Jahren auch mehr und mehr Praxisrelevanz gewonnen. Im Jahr 2007 konnten weltweit fast 435000 transfertaugliche bovine Embryonen in vitro produziert werden. Über 245000 dieser Embryonen wurden transferiert (THIBIER 2008).
Über die ersten erfolgreichen In-vitro-Fertilisationen wurde in den späten 50ern (CHANG 1959) beim Kaninchen und den 60er Jahren bei der Maus (WHITTINGHAM 1968) berichtet. Die Fertilisation stellte lange Zeit den limitierenden Faktor bei der In- vitro-Produktion dar, da es schwer möglich war, die Kapazitation der Spermien, die in vivo im weiblichen Reproduktionstrakt stattfindet, in vitro nachzuempfinden (BRACKETT et al. 1982). Das erste in vitro produzierte Kalb wurde im Januar 1981 geboren (BRACKETT et al. 1982).
Heute werden hauptsächlich zwei Verfahren angewendet, um Kumulus-Oozyten- Komplexe (KOK) für die IVP zu gewinnen. Zum einen werden KOK durch OPU vom lebenden Tier gewonnen, zum anderen werden Ovarien post mortem von frisch geschlachteten Tieren gesammelt. Die Gewinnung der KOK erfolgt mittels Aspiration mit Kanüle und Spritze oder auch mittels der Slicing-Methode (ECKERT u.
NIEMANN 1995). Die so gewonnenen KOK werden dann anhand ihrer Morphologie in für die IVP-tauglich und –nicht-tauglich eingeteilt (KHURANA u. NIEMANN 2000;
KELLY et al. 2007). Hierbei ist vor allem die Anzahl der die Eizelle umgebenden Kumuluszellen von Bedeutung, um eine vollständige Reifung der Eizelle und spätere
und Kultivierung in der Gruppe die Anzahl der gewonnenen Morulae und Blastozysten positiv.
Die In-vitro-Maturation der KOK beginnt direkt im Anschluss an ihre Selektion.
Hierbei wird die zuvor im Ovar arretierte Prophase beendet und die weitere meiotische Teilung im Reifungsmedium fortgesetzt (NIEMANN u. MEINECKE 1993;
SIRARD u. COENEN 2006). In Abhängigkeit vom für die Reifung verwandten Medium und dem Zustand der verwandten Eizellen sind Maturationsraten von 66 – 95% möglich (ADONA et al. 2008).
Nach Abschluss der Reifung erfolgt die In-vitro-Fertilisation. Vorraussetzung hierfür ist, dass Kapazitation und Akrosomenreaktion bei dem zu verwendenden Sperma stattgefunden haben. Dies beides sind physiologische Vorgänge, die die Befruchtung erst ermöglichen (BRACKETT 1993). Ein Zusatz von Heparin bei der Aufbereitung des Spermas induziert die Akrosomenreaktion und resultiert letztlich in einer wesentlich höheren Anzahl von befruchtungsfähigen Spermien (NIEMANN u.
MEINECKE 1993). Die in vitro gereiften KOK werden mit aufgereinigtem Sperma koinkubiert. Entscheidend ist hier, dass die Spermien eine ausreichende Motilität besitzen und kapazitiert sind. Um solche Spermien zu erhalten, wird eine Dichtegradientenzentrifugation mit dem aufgetautem Bullensperma durchgeführt.
Früher wurde für diesen Vorgang häufig Isopercoll genutzt. Dieses ist jedoch aufgrund fehlender klinischer Prüfung weder für den human- noch den veterinärmedizinischen Bereich zugelassen. Stattdessen werden heute zugelassene, kommerziell erhältliche Silikate verwandt (Spermfilter®, Cryo Bio System; Pure Sperm® und Bovi Pure®, Nidacon). Bei der In-vitro-Fertilisation werden Befruchtungsraten von 70-90% erreicht (WRENZYCKI et al. 2007).
Nach der Befruchtung werden die vermeintlichen Zygoten in ein Kulturmedium überführt, in dem sie verbleiben, bis sie das gewünschte Entwicklungsstadium (Morulae oder Bastozysten) erreicht haben. Hierbei werden nach 6-8 Tagen Kultur Entwicklungsraten (Morulae und Blastozysten) von 25-40% erreicht (KESKINTEPE u. BRACKETT 1996; RIZOS et al. 2003). Diese Vorgänge sind zusammenfassend schematisch in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der In-vitro-Produktion (mod. nach NIEMANN u. MEINECKE 1993b)
Mit entscheidend für den Erfolg beziehungsweise Verlauf der In-vitro-Produktion sind die bei den einzelnen Schritten verwandten Medien. Anfänglich wurden häufig komplexe Medien wie das Tissue Culture Medium 199 (TCM 199) verwandt (EYESTONE u. FIRST 1989), bei denen dann der Zusatz von undefinierten (z.B.
Serum), semidefinierten (Serumersatzstoffe wie Bovines Serum Albumin - BSA) oder definierten Stoffen (z.B. Polyvinvlalkohol – PVA) erfolgte. Obwohl diese Medien erfolgreich bei der In-vitro-Produktion eingesetzt wurden, folgte eine Weiterentwicklung der Kultursysteme, um zum einen die Entwicklungsraten zu optimieren (FARIN et al. 2001). Zum anderen sollte die Qualität der in vitro produzierten Embryonen verbessert werden. Sie ist immer noch deutlich schlechter als die der in vivo gewonnenen (NIEMANN et al. 2002). Dies äußert sich unter anderem bei den Kälbern aus in vitro produzierten Embryonen, die das so genannte
Unbefruchtete Eizellen
Spermien
Initro-Befruchtung 6-24 Stunden
In-vitro-Kultivierung 6-8 Tage
Morulae/Blastozysten
In-vitro-Reifung 18-27 Stunden In-vitro-Kapazitation
verändertes Organwachstum, Defekte der Plazenta, des Skeletts und des Immunsystems, sowie durch eine erhöhte perinatale Sterblichkeit (WALKER et al.
1996; KRUIP u. DAAS 1997; YOUNG et al. 1998; RENARD et al. 1999; SINCLAIR et al. 2000).
Medien, die entwickelt wurden, um diesem Problem entgegenzuwirken, sind einfache Medien und basieren häufig auf Modifikationen des Synthetic Oviduct Fluid (SOF)- Mediums [Zusatz von Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder PVA; KESKINTEPE u.
BRACKETT 1996]. Zu den einfachen Medien zählt auch das Hamster Embryo Culture Medium (HECM). Durch Verwendung dieser Medien – TCM 199, SOF, HECM - konnten Entwicklungsraten von bis zu 40% erreicht werden (KESKINTEPE u. BRACKETT 1996). Es konnte jedoch auch gezeigt werden, dass die Entwicklungsraten in definierten Medien geringer sind als in semidefinierten Medien oder undefinierten Medien (ECKERT u. NIEMANN 1995; WRENZYCKI et al. 1999).
Die Auswahl des Kultursystems hat nicht nur einen Einfluss auf die Entwicklungsraten, sondern auch auf die Kryotoleranz der Embryonen. In vitro produzierte Embryonen lassen sich nach wie vor schlechter kryokonservieren als ihre in vivo generierten Gegenstücke.
Dieses konnten LONERGAN et al. und RIZOS et al. im Jahr 2001 darlegen. So war es zum einen möglich zu zeigen, dass der Zusatz von Granulosazellen die Kryotoleranz der in vitro produzierten Embryonen deutlich erhöht (RIZOS et al.
2001). Zum anderen kultivierten LONERGAN et al. Embryonen in vivo im isolierten Schafeileiter und erzielten höhere Schlupfraten nach Vitrifikation als bei Kultur im SOF-System (LONERGAN et al. 2001).
Um die Kryotoleranz zu verbessern, sind ebenfalls unterschiedliche Zusätze zu den Kulturmedien getestet worden. Der Zusatz von 1%igem BSA zu KCL-angereichertem Simplex Optimisation Medium (KSOM) statt eines SOF-Zusatzes erbrachte keine signifikanten Unterschiede in der Gesamtüberlebensrate der Embryonen nach Vitrifikation (NEDAMBALE et al. 2004). Auch das Charles-Rosenkrans-Medium mit Zusatz von Aminosäuren wurde eingesetzt (PARK et al. 2006). Der Zusatz von Serum, wie z.B. Estrus Cow Serum (ECS), in das Kulturmedium ist mit einer abnormen Anreicherung von Lipidtropfen im Embryo assoziiert (ABE et al. 1999), die
dafür verantwortlich sein soll, dass IVP-Embryonen die Kryokonservierung schlechter überleben (MURAKAMI et al. 1998; RIZOS et al. 2003) als ihre in vivo gewonnenen Gegenstücke. Der Zusatz der trans10, cis12 konjugierten Linolsäuren (CLA) zum Kulturmedium erwies sich als positiv in Bezug auf die Kryokonservierbarkeit der in vitro produzierten Embryonen, da die CLAs den zytoplasmatischen Lipidgehalt der Embryonen signifikant reduzierten (PEREIRA et al. 2008).
Im direkten Vergleich zwischen konventioneller Kryokonservierung und Vitrifikation ließ sich so feststellen, dass die vitrifizierten Embryonen eine wesentlich höhere Reexpansions- und Schlupfrate aufwiesen, wenn das Kulturmedium vor der Kryokonservierung nicht mit ECS supplementiert worden war (MUCCI et al. 2006).
Einen positiven Effekt auf die Kryokonservierbarkeit wies auch der Zusatz von Phenazinethosulfat (PES) auf. PES reduziert den cytoplasmatischen Lipidgehalt deutlich. Dies erhöhte die Kryotoleranz der so vitrifizierten und konventionell kryokonservierten Embryonen signifikant (BARCELO-FIMBRES u. SEIDEL 2007). Im Gegensatz dazu hatten andere Arbeitsgruppen, die z.B. am porcinen Modell arbeiten, Ergebnisse, die zeigen, dass der Zusatz von fetalem Rinderserum (FBS) sich positiv auf die Überlebensraten nach dem Vitrifizieren auswirkt (MEN et al.
2005).
Ebenfalls positiv wirkte sich der Zusatz von Lipiden zum Kulturmedium vor der konventionellen Kryokonservierung in Bezug auf die Überlebensfähigkeit boviner Embryonen nach dem Einfrieren aus (LIM et al. 2008). Einen Überblick hierzu gibt Tabelle 1. Es werden auch Stoffe zum Kulturmedium hinzugesetzt, um die Kryokonservierbarkeit der IVP-Embryonen zu verbessern. So konnte durch den Zusatz von Beta-Mercaptoethanol die Überlebensrate von Embryonen nach dem Vitrifizieren signifikant verbessert werden. Ebenso hatten so generierte Embryonen eine höhere Gesamtzellzahl nach Vitrifikation als solche, denen kein Beta- Mercaptoethanol im Medium zugefügt worden war (NEDAMBALE et al. 2006).
Ebenfalls eine signifikante Verbesserung der Kryokonservierbarkeit konnte der Zusatz von Cytochalasin B, welches zur Stabilisierung des embryonalen Zytoskeletts beiträgt, bewirken. Hier wurde eine gesteigerte Überlebensrate nach konventioneller
Palmsäure hingegen führte zu einer signifikanten Verschlechterung der Überlebensraten nach Vitrifikation (SHEHAB-EL-DEEN et al. 2009).
Tabelle 1: Übersicht über Medienzusätze zur Verbesserung der Kryotoleranz in vitro produzierter Embryonen
Autor Spezies Genutzte Medien
Art der
Kryokonservierung
Einfluss auf Kryotoleranz
Nedambale et
al. (2004) Rind
KSOM + BSA (1%)
KSOM + SOF
Vitrifikation
Kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Medien Mucci et al.
(2006) Rind
Zusatz von ECS zum Kulturmedium
Vitrifikation und konventionelle Kryokonservierung
Schlechtere Überlebensraten als ohne ECS Men et al.
(2005) Schwein
Zusatz von FBS zum Kulturmedium
Vitrifikation
Bessere
Überlebensraten als ohne
Serumzusatz Lim et al.
(2007) Rind
Zusatz von Lipiden zum Kulturmedium
Konventionelle Kryokonservierung
Bessere
Überlebensraten als ohne
Lipidzusatz Barceló-
Fimbres et al.
(2007)
Rind Zusatz von FCS oder PES
Vitrifikation und Konventionelle Kryokonservierung
Zusatz von PES verbesserte Kryotoleranz für beide Verfahren
2.2. Grundlagen der Kryokonservierung
2.2.1. Physikalische Vorgänge beim Einfrieren von lebenden Zellen
Gefrieren ist das Überführen von Wasser aus dem Lösungszustand in die kristalline Form (MERYMAN 1956). Beim Einfrieren von Zellen können je nach Einfriergeschwindigkeit verschiedene physikalische Prozesse stattfinden, die letztendlich sogar den Tod der Zellen zur Folge haben können. So kommt es zur Dehydrierung der Zellen, dem intrazellulären Anstieg der Konzentration gelöster Stoffe und zur Bildung von Eiskristallen (MAZUR 1965).
Bis zu einer Temperatur von -5°C bleiben sowohl die flüssigen Stoffe in der Zelle als auch die, die sich in der direkten Umgebung der Zelle befinden, flüssig. Dieses geschieht sowohl durch anwesende Stoffe mit potentiellen kryoprotektiven Eigenschaften als auch durch den Effekt des Supercoolings. Als Supercooling wird das Herabsetzen der Temperatur einer Flüssigkeit unter den eigentlichen Gefrierpunkt, ohne dass sich eine kristalline Form bildet, verstanden.
Bei Temperaturen zwischen -5°C und -15°C gefriert d ie die Zelle umgebende Flüssigkeit entweder spontan oder die Kristallisation wird durch Eiskristalle ausgelöst (ein Prozess, der „Seeding“ genannt wird). Nun verlässt bei ausreichend langsamer Kühlgeschwindigkeit das intrazelluläre Wasser durch Exosmose die Zelle, da der intrazelluläre Raum ein höheres chemisches Potential besitzt als die gefrorene Umgebung. So ist es möglich ein chemisches Äquilibrium zu erreichen. Ist die Geschwindigkeit, mit der eingefroren wird, zu hoch, so hat die Zelle keine Möglichkeit durch Exosmose ihr Äquilibrium zu erreichen und es entstehen intrazelluläre Eiskristalle. Die intrazelluläre Eisbildung kann zu Schäden an der Zelle führen (siehe Kapitel 2.2.2.). Diese Prozesse sind in Abbildung 2 schematisch dargestellt.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der physikalischen Prozesse beim Einfrieren von lebenden Zellen (mod. nach Mazur 1977)
Diese Schäden haben hauptsächlich zwei Ursachen. Zum einen kann es durch das verlängerte Ausgesetztsein in konzentrierten Lösungen zu schädigenden
-2° C
-5°C
< - 10°C
Langsames Einfrieren
Schnelles Einfrieren
Sehr schnelles Einfrieren
= Zellkern
=Zellorganelle
= Eiskristalle
Lösungseffekten kommen, zum anderen verursacht intrazelluläre Eisbildung schwere Zellschäden. Die Größe intrazellulärer Eiskristalle ist ebenfalls abhängig von der Einfriergeschwindigkeit. Bei sehr hohen Einfriergeschwindigkeiten entstehen kleine unvollständige Kristalle, die aufgrund ihres hohen Oberflächen-Volumen Verhältnisses relativ instabil sind. Wird die Zelle anschließend langsam genug aufgetaut, kommt es während des Auftauens zum Verschmelzen der kleinen Kristalle zu größeren Kristallen, die dann vollständige Kristallform annehmen und die Zelle schädigen können.
Die Art der Schäden ist abhängig von der Einfriergeschwindigkeit (MAZUR 1966).
Sind die Gefrierraten zu hoch, so kommt es zu intrazellulärem Gefrieren, sind sie zu niedrig, so werden Schäden durch Lösungseffekte verursacht. Die optimale Einfriergeschwindigkeit wird als solche definiert als die, bei der die Schäden durch beide Schädigungsformen minimal sind (MAZUR 1970; MAZUR et al. 1972).
2.2.2. Kryoprotektiva
Als Kryoprotektiva werden Stoffe verstanden, die in der Lage sind, durch ihre chemischen Eigenschaften Schäden, die durch Gefrieren entstehen können, zu verringern bzw. zu verhindern. Kryoprotektiva werden in zwei Gruppen in Abhängigkeit von ihrem Verhalten gegenüber Zellmembranen eingeteilt:
penetrierende und nichtpenetrierende Kryoprotektiva (MERYMAN 1971).
Mit der Nutzung von Kryoprotektiva unabhängig welcher Gruppe sie angehören, entstehen für das zu konservierende Material weitere Gefahren. Es kann zu Schäden durch Lösungseffekte, die durch das Ausgesetztsein in hochkonzentrierten Lösungen entstehen, kommen. Ebenso haben die meisten Kryoprotektiva in den Konzentrationen, in denen sie eingesetzt werden, zelltoxische Eigenschaften.
Diesem Problem wird versucht entgegenzuwirken, indem zum einen die Konzentration des jeweiligen Kryoprotektivums geändert wird und zum anderen, indem der Zeitraum, in dem die Zelle im Kryoprotektivum verbleibt, variiert wird.
2.2.2.1. Nichtpenetrierende Kryoprotektiva
Bei nichtpenetrierenden Kryoprotektiva handelt es sich in der Regel um Makromoleküle und Zucker, die nicht in die Zellen eindringen, sondern ihre Schutzwirkung von außen erwirken. Ihre Hauptfunktion liegt in der Unterstützung des osmotischen Abtransportes von Wasser aus der Zelle heraus in die Umgebung.
Dieses Phänomen rechtfertigt ihren Einsatz besonders bei hohen Einfrierraten, da hier ein schneller Abtransport des intrazellulären Wassers wichtig für den Schutz der Zelle ist (MERYMAN et al. 1977).
Stoffe, die als nichtpenetrierend bezeichnet werden, sind Makromoleküle wie Ficoll, Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Polyvinylalkohl (PVA) ebenso wie die Zucker Saccharose und Trehalose. Das Wirkungsspektrum von Saccharose und Trehalose ist ähnlich. Sie finden hauptsächlich Anwendung als Puffersubstanz beim Ausverdünnen von wieder aufgetauten Embryonen. Hier verhindern sie das Anschwellen des Embryos, indem sie der Zelle Wasser entziehen (SUZUKI et al.
1990). Der Einsatz von Saccharose bietet sich ebenfalls beim Auftauen von konventionell kryokonservierten Embryonen an. Die Flüssigkeitssäulen an beiden Enden des Straws (Abbildung 3), die aus Kryoprotektivum (z.B. Ethylenglycol) bestehen, werden hierbei durch je eine Säule mit Saccharose ersetzt. Die Saccharose dient als so genanntes Holding-Medium, mittels dessen die Ausverdünnung des Ethylenglykols (EG) dann direkt beim Auftauen erfolgt, indem die Flüssigkeit der Säule mit dem Embryo sich mit der in den anderen Säulen vermischt.
Saccharose Luft EG Luft EG+Embryo Luft EG Luft Saccharose Abbildung 3: Aufziehen des Embryos in einer Paillette mit Saccharose als Holding-Medium, das zum direkten Ausverdünnen nach dem Auftauen verwandt werden kann ( EG =Ethylenglykol)
Dies ermöglicht ein so genanntes One-step-Verfahren, bei dem ein Direkttransfer ohne vorheriges Ausverdünnen des EGs von konventionell kryokonservierten Embryonen erfolgt.
Vielen Kryoprotektiva wurden bis in die 90er Jahre hinein BSA oder fetales Kälberserum (FCS) als Proteinquelle zugesetzt. Problematisch daran war jedoch die Möglichkeit der Kontamination durch Viren wie das bovine Virus Diarrhoe Virus (BVDV; GUTIERREZ et al. 1993). Um dieser Problematik entgegenzutreten, wurden anorganische oder synthetische Makromoleküle wie Ficoll, PVP und PVA als Ersatz für die Proteine gewählt.
Ficoll verhindert beim Auftauen von eingefrorenen Embryonen die Rekristallisation von Wasser und so damit verbundene Schäden an der Zelle. Weiterhin hilft sein Einsatz die Konzentration von penetrierenden Kryoprotektiva zu senken, und damit auch ihre Toxizität zu verringern (PALASZ et al. 1997).
PVP war schon in den 70er Jahren von WHITTINGHAM zur Kryokonservierung von Mäuseembryonen verwandt worden (WHITTINGHAM 1971). Er erreichte Weiterentwicklungsraten von 69,1 % nach dem Auftauen. Schon kurz darauf wurde jedoch über die hohe Toxizität des PVPs berichtet (WILMUT u. ROWSON 1973).
Spätere Untersuchungen konnten beweisen, dass die Problematik nicht allein in der Toxizität des PVPs liegt. So wurde von einer erschwerten Handhabung der Embryonen berichtet, die auf ein Festkleben der Embryonen am Inneren der Straws und einem Aufschwimmen zurückzuführen war. Dieses führte zu hohen Verlusten an Embryonen (SEIDEL et al. 1990).
Die Trächtigkeitsraten sind nach dem Einsatz von 4%igem PVP und PVA als Ersatz für Serum mit 31% bzw. 25% deutlich niedriger (SEIDEL et al. 1990). Ebenso konnte eine verringerte Überlebensfähigkeit in vitro produzierter Embryonen beim Einsatz von PVA als Substitut für Serum festgestellt werden (SOMMERFELD u.
NIEMANN 1999).
2.2.2.2. Penetrierende Kryoprotektiva
Penetrierende Kryoprotektiva entwickeln ihre Schutzwirkung im Vergleich zu nichtpenetrierenden Kryoprotektiva im intrazellulären Raum. Charakterisierend ist die
schädlichen Dehydrierung der Zelle kommen kann. Weiterhin charakteristisch für penetrierende Kryoprotektiva ist das geringe molare Gewicht. Penetrierende Kryoprotektiva ohne Beimengung anderer Kryoprotektiva werden hauptsächlich bei konventionellen Gefrierverfahren eingesetzt, bei denen niedrige Einfrierraten zum Einsatz kommen (MERYMAN 1971). In Kombination mit nichtpenetrierenden Stoffen werden sie auch zur Vitrifikation verwandt.
Es handelt sich hierbei um Stoffe wie Glycerin, Dimethylsulfoxid (DMSO), Propandiol oder Ethylenglykol (EG).
Glycerin wurde 1949 zum ersten Mal erfolgreich beim Kryokonservieren von Geflügelsperma eingesetzt (POLGE et al. 1949). Heute wird es häufig in Verbindung mit anderen Kryoprotektiva bei der Vitrifikation eingesetzt. So verwandten BIELANSKI und HARE z.B. eine Mischung aus 10%igem Glycerin und 20%igem Propandiol (BIELANSKI u. HARE 1988). Andere Mischungen aus penetrierenden und nichtpenetrierenden Kryoprotektiva wurden ebenfalls zur Vitrifikation eingesetzt.
Zum einen verwandten GUITÉRREZ et al. eine Zusammensetzung aus 3,0 molarem Glycerin und 0,25 molarer Saccharose, zum anderen verwandten sie die Makromoleküle PVA, PVP und Ficoll jeweils in Kombination mit Glycerin (GUTIERREZ et al. 1993).
Im Vergleich zu Glycerin dringt Dimethylsulfoxid zwar schneller in Zellen ein, das Glycerin wurde jedoch schon früh aufgrund seiner niedrigeren Toxizität präferiert (MERYMAN 1971). Bei der Vitrifikation wird DMSO jedoch gern verwandt, da es eine hohe Fähigkeit zur Glasbildung aufweist (FRIEDLER et al. 1988). Auch hierbei ist eine vollständige Penetration der Zelle unbedingt erforderlich, da das DMSO ansonsten seine Schutzwirkung nicht vollständig entwickeln kann.
Weiterhin zur Verfügung stehende penetrierende Kryoprotektiva sind EG und Propandiol. Propandiol ist noch eher in der Lage einen glasartigen Zustand auszubilden als Glycerin und DMSO (RENARD u. BABINET 1984), allerdings sind die Überlebensraten von Embryonen, die alleinig mit Propandiol kryokonserviert werden sehr gering, so dass eine alleinige Verwendung als Kryoprotektivum ausscheidet (SUZUKI et al. 1990; SEIDEL 1992).
EG wurde das erste Mal Ende der 70er Jahre als Kryoprotektivum beschrieben (MIYAMOTO u. ISHIBASHI 1977). Hier schon zeigte sich, dass eine Konzentration zwischen 0,9 M und 1,2 M die wohl geeigneteste Konzentration für die Kryokonservierung von Embryonen war. Bei VOEKEL und HU schien eine 1,5 M Konzentration die optimale Schutzwirkung beim Gefrieren von Embryonen zu erzielen (VOELKEL u. HU 1992). SOMMERFELD und NIEMANN konnten 1999 darstellen, dass EG auch in hohen Konzentrationen bis zu 7,2 M, so wie sie für die Vitrifikation nötig sind, nicht toxisch wirkt. Dies ist abhängig von der Umgebungstemperatur, der Penetrationsgeschwindigkeit des EGs und einer schrittweisen Konzentrationserhöhung des EGs.
2.3. Konventionelle Gefrierverfahren
Bei den konventionellen Gefrierverfahren wird zwischen langsamen und schnellen Gefrierverfahren unterschieden. Beiden Verfahren ist gleich, dass das zu gefrierende Material mit gleich bleibenden langsamen Raten auf eine bestimmte Temperatur deutlich unter dem Gefrierpunkt heruntergekühlt wird. Dies geschieht u.a. durch den Einsatz von programmierbaren Einfrierautomaten. Bei den schnellen Verfahren erfolgt anschließend eine Überführung des zu konservierenden Materials in flüssigen Stickstoff. Die Einfrierraten während dieses Prozesses sind relativ hoch und der Einfrierprozess erfolgt entsprechend schnell.
Es wird versucht, die Überlebensfähigkeit der Embryonen weder durch Gefrierschäden noch durch toxische Effekte des Kryoprotektivums negativ zu beeinflussen.
2.3.1. Langsame Gefrierverfahren
Die langsamen Gefrierverfahren zeichnen sich durch niedrige Kühlraten aus, mit denen das zu gefrierende biologische Material langsam auf -60°C - -120°C heruntergekühlt wird. Die ersten Säugetierembryonen, die durch dieses Verfahren erfolgreich eingefroren wurden, waren Mäuseembryonen (WHITTINGHAM et al.
1972). Hierbei wurden Gefrierraten von ungefähr 1°C /Sekunde bis zu einer Temperatur von -79°C verwandt. Das Herunterkühlen e rfolgte mäßig kontrolliert mit einer Mischung aus Eis und Azeton. Die Embryonen verblieben für ungefähr 30 Minuten bei dieser Temperatur, bevor sie wieder aufgetaut wurden (WHITTINGHAM 1971). Das nachfolgende Auftauen erfolgte mit Raten um die 1,4°C/Sekunde bis zu einer Temperatur von 20°C.
Die gewählten Einfrierraten sollten gewährleisten, dass die Zelle das osmotische Äquilibrium mit dem Extrazellulärraum durch Dehydration aufrecht erhalten konnte (MAZUR 1966). Die Auftauraten waren bei diesen ersten Versuchen etwas höher als die Einfrierraten, da generell davon ausgegangen wurde, dass ein schnelleres Auftauen für die Überlebensfähigkeit der Zellen von Vorteil sei (MAZUR 1966).
Die zuerst genutzten Kryoprotektiva enthielten neben PBS (Phosphate Buffered Saline) als Lösungs- und Verdünnungsmittel alle PVP (MAZUR et al. 1969;
WHITTINGHAM 1971)
Bei den ersten Versuchen zum Einfrieren nutzten die Autoren Plastik- und Glasröhrchen mit einem Volumen von bis zu 5 ml, in die bis zu zwanzig Embryonen platziert wurden (WHITTINGHAM 1971). Seit 1977 werden Straws, welche bislang nur zum Einfrieren von Sperma genutzt worden waren, zum Einfrieren von Mäuseoozyten und später auch zum Einfrieren von Embryonen verwandt (TSUNODA u. SUGIE 1977; MASSIP et al. 1979).
2.3.2. Schnelle Gefrierverfahren
1980 wurde zum ersten Mal ein schnelleres Gefrierverfahren beschrieben (WOOD u.
FARRANT 1980) als die bisher genutzten Verfahren, die die Embryonen langsam bis zu sehr niedrigen Temperaturen herunterkühlten, bei denen sie dann verblieben.
WOOD und FARRANT beschreiben eine „two-step“-Methode, bei der die Embryonen im ersten Schritt mit langsamen Kühlraten auf eine Temperatur von -20°C bzw. -25°C heruntergekühlt wurden, für eine Weile bei dieser Temperatur verblieben, um dann direkt in flüssigen Stickstoff überführt zu werden. Während dieses zweiten Schrittes des Einfrierprozesses kommt es zu entsprechend hohen Kühlraten. Sie beschrieben ebenfalls, dass die Zeitspanne, bei der die Embryonen bei der Temperatur gehalten wurden, scheinbar keinen Einfluss auf deren Überlebensfähigkeit hatte. Während des Auftauens war nach ihrem Protokoll eine hohe Auftaurate erforderlich, um eine möglichst hohe Überlebensfähigkeit zu gewährleisten (WOOD u. FARRANT 1980).
In der Weitentwicklung dieses Verfahrens bildete sich bald ein bis heute genutztes Grundprotokoll heraus (RALL 1992): Zunächst wird dem Embryo ein ein- bis zweimolares Kryoprotektivum zugeführt, in dem er zur Äquilibrierung einen gewissen Zeitraum verbleibt. Während dieser Phase des Äquilibrierens wird der Embryo in den Behälter, in dem er eingefroren werden soll, überführt. Anschließend wird der
eine schädliche Unterkühlung des Embryos (LEIBO 1984). Anschließend wird der Embryo mit kontrollierten Raten bis zu einer Temperatur von -20°C - -40°C heruntergekühlt, um dann direkt in flüssigen Stickstoff, der eine Temperatur von -196°C hat, überführt zu werden.
Die Ausverdünnung des Kryoprotektivums nach dem Auftauen der eingefrorenen Embryonen stellte zunächst den limitierenden Faktor bei der Menge der zeitgleich auftaubaren Embryonen dar. Das Kryoprotektivum wurde ursprünglich schrittweise ausverdünnt, was eines zeitlichen Aufwandes von 20 – 60 Minuten bzw. bis zu 90 Minuten bedurfte (LEIBO 1984; VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1995).
LEIBO war es 1984 möglich, das erste Mal ein so genanntes „One-step“- Auftauverfahren zu etablieren, das es ermöglichte, eingefrorene Embryonen direkt nach dem Auftauen ohne weitere Ausverdünnung zu übertragen. Dieses wurde durch den Zusatz von nichtpenetrierenden Kryoprotektiva - wie in diesem Falle Saccharose - ermöglicht.
Bis zu Beginn der 90er Jahre waren Glycerin, DMSO sowie Propylenglycol die Kryoprotektiva, die am häufigsten benutzt wurden (MASSIP 2001). EG wurde zwar versuchsweise schon Ende der 70er Jahre eingesetzt (MIYAMOTO u. ISHIBASHI 1977), aber erst in den 90er Jahren kam es zum routinemäßigen Gebrauch. Durch sein geringeres Molekulargewicht ist EG wesentlich permeabler als zum Beispiel DMSO und es ist möglich, EG als Kryoprotektivum einzusetzen, ohne es beim Auftauen der Embryonen ausverdünnen zu müssen. Dies vereinfachte die Handhabung und Übertragung von TG-Embryonen für Embryotransfer-Techniker (MASSIP 2001).
2.4. Vitrifikation
Die Vitrifikation ist ein ultraschnelles Gefrierverfahren, bei dem im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren keine Kristallisation – also keine Eisbildung - der extrazellulären Flüssigkeit hervorgerufen wird, sondern bei dem zelluläres und extrazelluläres Wasser in einen amorphen glasartigen Zustand überführt werden.
Es entfallen die Schritte des Seedings und des langsamen Herabkühlens auf eine Temperatur zwischen -20°C und -25°C. Somit werden f ür dieses Verfahren keine programmierbaren Einfrierautomaten benötigt. Nach einer schrittweisen Äquilibrierung in hochkonzentrierten Lösungen sind die Zellen dehydriert und werden direkt in flüssigen Stickstoff überführt.
Das erste Mal wurde diese Methode 1985 für Embryonen beschrieben und eingesetzt (RALL u. FAHY 1985; RALL 1985). Die Embryonen waren einer umgekehrten Verdünnungsreihe dem Kryoprotektivum ausgesetzt, das sowohl penetrierende als auch nicht penetrierende Komponenten enthielt (RALL u. FAHY 1985).
Durch die direkte Überführung in flüssigen Stickstoff liegen bei diesem Verfahren extrem hohe Kühlraten vor (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1995), die bis zu 20000°C/min betragen (VAJTA et al. 1998). Ebenso ho ch sind die Raten, mit denen die Embryonen wieder aufgetaut werden. Direkt nach dem Auftauen findet eine schrittweise Ausverdünnung des Kryoprotektivums statt.
Bei dieser Methode des Einfrierens entfällt die Gefahr der Zellschädigung durch Eiskristallbildung, da die hohe Konzentration des Kryoprotektivums und die hohen Kühl- und Auftauraten die Eiskristallbildung verhindern (KULESHOVA u. LOPATA 2002).
Neue Schädigungsgefahren entstehen durch die erhöhte Toxizität der Kryoprotektiva. Dieser Toxizitätsanstieg geht mit der höheren Konzentration der Medien einher. Es wird versucht, die toxischen Effekte, die die einzelnen Kryoprotektiva in hohen Konzentrationen besitzen, abzuschwächen, indem
nutzten eine Mischung aus penetrierenden und nichtpenetrierenden Kryoprotektiva.
Auch andere Autoren nutzen verschiedene Kryoprotektiva in Mischung, um Embryonen (erfolgreich) einzufrieren. VAJTA et al. und HOLM et al. nutzen 1998 eine Mischung aus EG und DMSO als Kryoprotektivum.
Weiterhin können sich die hohen Einfrier- und Kühlraten negativ auf die Überlebensfähigkeit der Embryonen auswirken (VAJTA et al. 1998).
ARAV et al. postulierten, dass es drei Hauptfaktoren gäbe, die die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Vitrifikation beeinflussen würden. Der erste Faktor sei die Viskosität des Kryoprotektivums, der zweite Faktor die Erzielung einer möglichst hohen und gleich bleibenden Kühlrate und der dritte Faktor die Verringerung des Probenvolumens (ARAV et al. 2002).
Problematisch stellt sich die Erzielung möglichst hoher und gleich bleibender Kühlraten dar, wenn der Embryonencontainer direkt in den flüssigen Stickstoff überführt wird. Durch die ursprünglich höhere Temperatur des Containers verdampft der Stickstoff um den Container herum, und bildet dabei eine isolierende Schicht aus Gas (YAVIN et al. 2009). YAVIN et al. verwandten aufgrund dessen statt flüssigem Stickstoff, Stickstoff der sich am Übergang von der festen zur flüssigen Phase befand und eine Temperatur von -210°C hatte. Mittels diese s Verfahrens war es ihm möglich, die Kühlrate auf fast 53000°C/min herauf z u setzen.
Bei der Vitrifikation werden unterschiedliche Trägersysteme verwandt, die unterschiedlichen Problemen der Vitrifikation gerecht werden sollen.
So hat sich gezeigt, dass eine Verringerung des Probenvolumens, also der Menge des Kryoprotektivums, in dem der Embryo vitrifiziert wird, die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Vitrifikation erhöht. Dies geschieht durch eine Erhöhung der Kühlrate, die mit der Verringerung des Probenvolumens einhergeht (ARAV et al.
2002). Es gibt bereits etliche Möglichkeiten diese angestrebte Verringerung des Probenvolumens zu erreichen. So wird bereits 1990 die Methode des Vitrifizierens mittels eines Elektronenmikroskoprasters beschrieben (STEPONKUS et al. 1990).
Zusätzlich zur Probenvolumenverringerung erlaubt es diese Methode mehr als eine Probe auf ein Mal einzufrieren, in diesem Falle bis zu zwanzig Oozyten gleichzeitig.
2.4.1. Offene Systeme
Offene Systeme lassen einen direkten Kontakt zwischen dem flüssigen Stickstoff und dem einzufrierenden Material zu. Verschiedene Methoden ermöglichen so eine hohe Einfrierrate, eine geringere Toxizität der Kryoprotektiva und verringern die Wahrscheinlichkeit von Schäden wie z. B. dem Aufbrechen der Zona pellucida.
ARAV et al. beschrieben 1993 eine Methode des Vitrifizierens mit sehr kleinen Volumina, die es ermöglicht die Konzentration des Kryoprotektivums um bis zu 50%
zu reduzieren (ARAV et al. 1993a; ARAV et al. 1993b). Diese Methode wird
„Minimum Drop Size Method (MSD)“ genannt.
1990 wurde ein Verfahren vorgestellt, mittels dessen es möglich war eine definierte kleine Menge des einen Embryo enthaltenden Mediums in flüssigem Stickstoff einzufrieren. Der Tropfen des Kryoprotektivums wurde auf das Kupferraster eines Elektronenmikroskops (EMG) pipettiert und dann in flüssigen Stickstoff überführt.
Hierbei war es auch möglich mehr als einen Embryo – in diesem Falle Drosophila melanogaster-Embryonen - auf dem EMG zu platzieren und die Embryonen gleichzeitig einzufrieren (STEPONKUS et al. 1990). Sechs Jahre später nutzten MARTINO et al. eben dieses EMG-System, um bovine Eizellen ohne das Auftreten von Kälteschäden tief zu gefrieren und wieder aufzutauen. Die Eizellen befanden sich hier in Volumina von <1µl Kryoprotektivum. Dies und der direkte Kontakt des Kryoprotektivums mit dem flüssigen Stickstoff ermöglichte das Erreichen sehr hoher Einfrierraten (MARTINO et al. 1996). Nach dem Auftauen war es möglich, die so vitrifizierten Oozyten zu befruchten und den Erfolg des Einfrierens und Auftauens über die Teilungs- und Blastozystenraten zu beurteilen (MARTINO et al. 1996).
Eine weitere Methode die Einfrierraten zu erhöhen bot sich durch die Open-Pulled Straws (OPS). Ebenso wie bei den von STEPONKUS et al. und MARTINO et al.
vitrifizierten Zellen, kommt es bei dieser Methode zum direkten Kontakt des Kryoprotektivums mit dem flüssigen Stickstoff. Für diese Methode wurden herkömmliche 250 µl Straws so modifiziert, dass deren Wanddicke um die Hälfte
Volumen von 4 µl eingefroren. Diese Straws wurden vor dem Kontakt mit dem flüssigen Stickstoff durch Erhitzen versiegelt. Die Ergebnisse zeigten, dass es möglich war, durch den Wegfall des isolierenden Einflusses der hitzeversiegelten Straws die Einfrierraten fast zu verzehnfachen. Weiterhin verringerten sich laut der Autoren beim Auftauen toxische und osmotische Effekte durch eine zeitgleiche Ausverdünnung des Kryoprotektivums (VAJTA et al. 1998); Abbildung 4).
.
(a) Oozyten oder Embryonen werden mittels von Kapillarkräften in den modifizierten Straw gesogen.
(b) Das Einfrieren erfolgt über das direkte Eintauchen in den flüssigen Stickstoff (c) Beim Auftauen werden die Straws direkt in das neue Medium eingetaucht. Das Kryoprotektivum verdünnt sich so aus und die Oozyten oder Embryonen werden aus dem Straw gespült.
Abbildung 4: Durchführung der OPS-Methode nach Vajita (1999)
Weitere Verfahren, die auf eine Erhöhung der Einfrierraten und eine Verringerung der Kälteschäden abzielen, sind beispielsweise das Cryoloop- (LANE et al. 1999) und das Cryotopverfahren (KUWAYAMA et al. 2005). Diese Verfahren beruhen ebenfalls auf Minimalvolumina und einem direkten Kontakt zwischen zu vitrifizierendem Medium und flüssigem Stickstoff. KUWAYAMA et al. (2005) waren sogar in der Lage Einfrierraten von bis zu 40000°C / min zu erlangen.
Problematisch bei allen offenen Systemen ist das Risiko der Kontamination. Mit besonderem Augenmerk auf die bovine Spezies war es BIELANSKI et al. im Jahre 2000 möglich, nachzuweisen, dass Viren der bovinen Virusdiarrhoe (BVD) und der infektiösen bovinen Rhinotracheitis (IBR) in flüssigem Stickstoff überleben und in der
Lage sind, dort aufbewahrte Zellen zu infizieren (BIELANSKI et al. 2000). Als Alternative wurde vorgeschlagen, dass zu vitrifizierende Material im Dampf des flüssigen Stickstoffes zu lagern, aber zum einen werden dort keine konstanten Temperaturen gehalten und die Lagerungstemperatur ist deutlich höher als im flüssigen Stickstoff selbst (KULESHOVA u. SHAW 2000). Zum anderen war es 2003 möglich nachzuweisen, dass auch die Dämpfe des flüssigen Stickstoffes in der Lage sind, eine Kontamination der Embryonen hervorrufen zu können (BIELANSKI et al.
2003).
2.4.2. Geschlossene Systeme
Die oben besprochenen Systeme zur Vitrifikation weisen den Nachteil einer potentiellen Kontamination der Embryonen durch im flüssigen Stickstoff enthaltene Erreger auf. Embryonen, die direkt übertragen werden sollen, die für den Im- bzw.
Export bestimmt sind müssen nach der Richtlinie 89/556/EWG des Rates vom 25.September 1989 und der nationalen Umsetzung durch Binnenmarkt- Tierseuchenschutzverordnung gelagert, identifiziert und transportiert werden. Die
„International Society for Embryo Transfer“ (IETS) bietet hierfür Durchführungsmöglichkeiten. So sieht die IETS vor, dass alle Embryonen zum Zeitpunkt des Einfrierens in versiegelten Behältnissen gelagert sind.
Dafür kommen verschiedene Behältnisse in Frage:
Eine Möglichkeit stellt das Straw-in-Straw-System dar, bei dem 0,25 ml-Straws in 0,5 ml-Straws gelagert werden. Der den Embryo enthaltenden 0,25 ml-Straws wird zu Beginn an beiden Enden gekürzt, so dass er in den größeren Straw hinein passte.
Der 0,5 ml-Straw wird anfangs an einem Ende versiegelt, um den späteren Ablauf zu beschleunigen. Nachdem der 0,25 ml-Straw mit dem Embryo beladen wurde, wird er in den 0,5 ml Straw gesteckt und dann direkt in den flüssigen Stickstoff überführt (KULESHOVA u. SHAW 2000). Eine weitere Möglichkeit den Bestimmungen der IETS zu entsprechen, bietet sich durch die Nutzung eines modifizierten Open-Pulled Straw (mOPS) Systems, bei dem ebenfalls ein weiterer, größerer (0,5 ml) Straw, der
zu verhindern (ISACHENKO et al. 2005). Eine schematische Abbildung dieses Models ist Abbildung 5 zu entnehmen.
Schema des Straw -in –Straw Models:
(1) 0,5ml Straw;
(2) Metallverschluss;
(3) Open-pulled Straw;
(4) Vitrifikationsmedium mit Embryo/Oozyte (5) Meniskus des Vitrifikationsmediums
Abbildung 5: Straw-in-Straw Model mit OPS (Isachenko 2005)
CAMUS et al. beschreiben eine weitere Möglichkeit eines geschlossen Systems, das zugleich aseptisch ist. Hierbei handelt sich um eine Methode, bei der der Embryo ebenfalls auf eine kleine Rinne hinüberpipettiert und dann vor dem Kontakt mit dem flüssigen Stickstoff in einen Straw verbracht und versiegelt wird (CAMUS et al. 2006).
2.4.3. Weitere Vitrifikationsmethoden
Bei der High Hydrostatic Pressure-Methode (HHP) wurden die Embryonen vor der Kryokonservierung einem Druck von bis zu 150 MPa ausgesetzt, um sie vor Schäden durch die Kryokonservierung zu schützen. Nachdem die Embryonen schrittweise wieder zum atmosphärischen Druck zurückgeführt wurden, erfolgte die
Vitrifikation. So war es möglich gesteigerte Überlebensraten nach der Vitrifikation im Vergleich zu solchen Embryonen, die zuvor nicht dem HHP ausgesetzt waren, zu erlangen (PRIBENSZKY et al. 2004).
Eine weitere Möglichkeit biologische Materialien und somit auch Embryonen zu Vitrifizieren bietet die Solid Surface Vitrification (SSV). Hierbei werden die Embryonen in Mikrotropfen auf einen Aluminiumblock pipettiert, der zuvor in flüssigen Stickstoff verbracht wurde. Dadurch, dass Aluminium eine hohe Wärmeleitfähigkeit aufweist, hat die Oberfläche des Blocks die Temperatur des flüssigen Stickstoffs und die Mikrotropfen mit den enthaltenen Embryonen vitrifizieren sofort (DINNYES et al. 2000). Zur besseren Übersicht ist diese Methode in Abbildung 6 dargestellt. Eine Weiterentwicklung der SSV ermöglicht es einzelne Embryonen ohne Kontakt zum Stickstoff oder zu anderen Embryonen so zu vitrifizieren. Bei dieser Methode werden zwei Aluminiumzylinder, die solche Aussparungen aufweisen, dass einzelne 0,5 ml Straws hineinpassen, ineinander gesetzt und in flüssigen Stickstoff verbracht. 0,5 ml Straws werden an einem Ende verschlossen und in die Aussparungen zum Vorkühlen verbracht. Nun werden 0,25 ml Straws so modifiziert, dass das eine Ende mit einem Embryo beladen werden kann.
Anschließend werden die 0,25 ml Straws in die 0,5 ml Straws geschoben und die Embryonen vitrifizieren aufgrund der Temperaturleitfähigkeit des Aluminiums ebenfalls direkt (VUTYAVANICH et al. 2009).
Abbildung 6: Solid Surface Vitrification, modifiziert nach DINNYÉS (2000) Styroporbehälter
den Embryo enthaltende
Flüssigkeitstropfen Flüssiger Stickstoff
Aluminiumblock
2.5. Qualität in vitro produzierter Rinderembryonen nach dem Auftauen
Die Einflüsse des Kryokonservierens lassen sich anhand verschiedener qualitativer Merkmale nach dem Auftauen untersuchen. Hierbei kommen sowohl invasive Verfahren, die den Tod des Embryos zur Folge haben, als auch nicht-invasive Verfahren zum Einsatz. Vitalfärbungen und Transfers sowie die Beurteilung von Reexpansions- und Schlupfraten stellen einen Teil der nicht-invasiven Verfahren dar.
Die Etablierung von Trächtigkeiten nach dem Transfer von Embryonen auf geeignete Empfängertiere und die Untersuchung von so entstandenen Kälbern ist die wohl beste Möglichkeit qualitativ hochwertige Embryonen zu detektieren. Dies ist jedoch aus zeitlichen Gründen sowie aus wirtschaftlichen Gründen nicht immer möglich.
Bei den invasiven Verfahren stehen Zellfärbungen durch Farbstoffe wie Ethidium homodimer und Hoechst und die Analyse der relativen Menge bestimmter Gentranskripte im Vordergrund.
Eine sichtbare Kontrolle ist das mikroskopische Überprüfen der Reexpansion und gegebenenfalls des Schlupfes der Blastozysten. Innerhalb der letzten 20 Jahre haben sich hierbei für die Vitrifikation die Überlebensraten verzweieinhalbfacht. Hatte BIELANSKI et al. 1988 noch Überlebensraten von 20% 24 Stunden nach dem Auftauen, so waren es bei MUCCI et al. (2006) rund 52% und bei NEDAMBALE et al.
(2004) sogar über 80% (jeweils 24 Stunden nach dem Auftauen). Tabelle 2 gibt einen Überblick über die Entwicklung der Überlebensraten nach konventioneller Kryokonservierung und Vitrifikation in den letzten Jahren. Es ist jedoch nicht möglich Reexpansions- und Schlupfraten miteinander zu vergleichen, ohne die Art des Kultursystems, das Stadium und Alter des Embryos vor dem Einfrieren und das jeweilige Protokoll, nach dem kryokonserviert wurde, mit einzubeziehen. Es konnte gezeigt werden, dass in vitro produzierte Embryonen, die ein fortgeschritteneres Entwicklungsstadium (Stadium der expandierten Blastozyste) besaßen, unempfindlicher thermischen Reizen gegenüber waren als solche, die sich erst im Stadium der Blastozyste befanden. Mit expandierten Blastozysten konnten nach dem
wiederum erbrachte Reexpansionsraten von bis zu 100% für Tag sieben expandierte Blastozysten (LUCAS-HAHN et al. 2006).
Tabelle 2: Übersicht über Überlebensraten in vitro produzierter Embryonen nach Vitrifikation oder konventioneller Kryokonservierung
Autor Art der Kryokonservierung Überlebensraten
BIELANSKI et al. (1988) Vitrifiziert
Konventionell kryokonserviert
nach 24 Std: 20%
nach 24 Std: 29- 33%
PALASZ et al. (1996) Vitrifiziert nach 24 Std: 51 % Schlupfrate: 17,5%
LUCAS-HAHN et al. (2003) Konventionell kryokonserviert Reex.rate: 68,7%
Schlupfrate: 38,9%
NEDAMBALE et al. (2004) Vitrifiziert
nach 24 Std: 50 - 83%
nach 48 Std: 34 - 72%
MOREIRA DA SILVA et al.
(2005)
Vitrifiziert
Konventionell kryokonserviert
nach 24 Std: 27%
nach 48 Std: 14%
nach 24 Std: 39%
nach 48 Std: 35%
LUCAS-HAHN et al. (2006) Vitrifiziert Reex.rate: 100%
Schlupfrate: 83,3%
MUCCI et al. (2006)
Vitrifiziert
Konventionell kryokonserviert
nach 24 Std: 52%
nach 48 Std: 51%
nach 24 Std: 17%
nach 48 Std: 20%
PARK et al. (2006)
Vitrifiziert (regulärer Straw)
Vitrifiziert (minimum volume container)
Reex.rate: 67%
Schlupfrate:46%
Reex.rate: 75%
Schlupfrate:58%
GÓMEZ et al. (2008) Vitrifiziert nach 24 Std: 52%
nach 48 Std: 58%
Eine weitere Möglichkeit die Qualität der Embryonen nach dem Auftauen zu beurteilen, ist die Zellzahl der wieder aufgetauten Embryonen. Hierbei lassen sich
u.a. Zell- und/oder Differentialfärbungen einsetzten, die jedoch z.T. den Tod des Embryos zur Folge haben. So hatten bei MUCCI et al. (2006) die wieder aufgetauten zuvor vitrifizierten Embryonen durchschnittlich 99,0 ± 2,2 Zellen und die konventionell kryokonservierten Embryonen hatten nach dem Auftauen durchschnittlich 96,6 ± 2,4 Zellen. Andere Autoren beschreiben andere Zellzahlen.
Geschlüpfte Blastozysten, die zuvor nicht kryokonserviert worden waren, hatten im Mittel 187,0 ± 9,7 Zellen (NEDAMBALE et al. 2004). Embryonen im Stadium der expandierten Blastozyste an Tag 7, die in NBCS (New Born Calf Serum) kultiviert worden waren und danach entweder konventionell kryokonserviert oder vitrifiziert wurden, hatten durschnittlich 130,5 ± 2,9 Zellen (vitrifiziert) und 131,9 ± 4,1 Zellen (konventionell kryokonserviert; SOMMERFELD u. NIEMANN 1999).
Eine Untersuchung zeigte, dass Embryonen, die zuvor vitrifiziert worden waren nach dem Auftauen eine signifikant niedrigere Zellzahl (131,0 ± 15,1) hatten als solche die nicht kryokonserviert (161,2 ± 9,2) wurden (GOMEZ et al. 2009). Zusammenfassend sind diese Daten in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3: Durchschnittliche Zellzahlen nach Kryokonservierung durch Vitrifikation oder konventionelle Kryokonservierung oder ohne Kryokonservierung
Autor Zellzahl nach Vitrifikation
Zellzahl nach konventioneller Kryokonservierung
Zellzahl ohne
Kryokonservierung
MUCCI et al. 2006 99,0 ± 2,2 96,6 ± 2,4 -
NEDAMBALE et
al. 2004 - - 187,0 ± 9,7
SOMMERFELD u.
NIEMANN 1999 130,5 ± 2,9 131,9 ± 4,1 -
GOMEZ et al.
2009 131,0 ± 15,1 - 161,2 ± 9,2
Zusätzlich ist es möglich Embryonen hinsichtlich ihrer morphologischen Eigenschaften zu charakterisieren. So werden Scores angewandt, die z.B. die Helligkeit des Embryos oder das Aussehen der ICM beurteilen. Letztendlich lässt sich auch die Qualität des Embryos insgesamt morphologisch begutachten (BARCELO-FIMBRES u. SEIDEL 2007). Der Embryo an sich wird durch diese Maßnahme nicht geschädigt.
Eine weitere Möglichkeit den Erfolg einer Kryokonservierungsmethode zu beurteilen, liegt in der Übertragung so behandelter Embryonen nach dem Auftauen. Hierbei wird zum einen die Etablierung der Trächtigkeit beurteilt, zum anderen ist die Geburt lebender, gesunder Kälber Erfolgsmaßstab.
Tabelle 4: Trächtigkeitsraten in vivo und in vitro generierter Embryonen nach Kryokonservierung durch Vitrifikation oder konventionelle Kryokonservierung
Autor Art des Embryos Trächtigkeitsraten
VAN WAGTENDONK-DE
LEEUW et al. (1995) In vitro/vitrifiziert 8/17 (47%)
GALLI et al. (2001)
In vitro/konventionell kryokonserviert In vivo/konventionell kryokonserviert
36/76 (47,4%)
62/108 (57,4%)
LAZZARI et al. (2002)
In vivo/konventionell kryokonserviert In vitro/ SOF+BSA/
konventionell kryokonserviert In vitro/ SOF-Serum/
konventionell kryokonserviert
69/125 (57,8%)
24/65 (36,9%)
4/24 (16,7%)
VOEKEL u. HU (1992)
In vitro/konventionell kryokonserviert/1,5M EG In vitro/konventionell
kryokonserviert/1,4M Glycerin
10/26 (38,5%)
28/50 (56,0%)
So konnten VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. (1995) nach der Kryokonservierung durch Vitrifikation bei sieben von 17 (44%) Tieren die Trächtigkeit feststellen und an Tag 90 8 Föten (47%) auffinden. Weitere Untersuchungen, die sich mit der Anzahl der etablierten Trächtigkeiten nach dem Transfer in vitro produzierter Embryonen beschäftigten, ergaben dass deren Anzahl im Gegensatz zu Trächtigkeiten, die sich nach dem Transfer in vivo produzierter Embryonen ergaben reduziert waren (GALLI et al. 2001; LAZZARI et al. 2002). Daten zu unterschiedlichen Trächtigkeitsraten sind vergleichend in Tabelle 4 dargestellt.
Eine Arbeit, die sich mit den Trächtigkeitsraten in vitro produzierter konventionell kryokonservierter Embryonen nach dem Auftauen beschäftigte, ergab, dass solche Embryonen, die schon an Tag sechs oder sieben das Stadium der Blastozyste erreicht hatten, verglichen mit solchen, die erst an Tag acht dieses Stadium erreichten (MASSIP et al. 1995), eine signifikant höhere Überlebensrate nach dem Auftauen vorweisen konnten.
2.6. Entwicklungsrelevante Gentranskripte präimplantatorischer Rinderembryonen
Die Entwicklung des präimplantatorischen Rinderembryos ist abhängig von der korrekten Umsetzung des genetischen Programms der Zygote und dem Umfeld, in dem sich der Embryo befindet. Ein suboptimales Umfeld kann die Expression wichtiger Gentranskripte hierbei nachteilig beeinflussen. Transkripte entwicklungsrelevanter Gene in vivo und in vitro generierter Embryonen unterscheiden sich deutlich hinsichtlich ihrer Expression (WRENZYCKI et al. 1998).
Zusätzlich gibt es auch Unterschiede zwischen in vitro produzierten Embryonen z.B.
in Abhängigkeit vom verwandten Kulturmedium. Aufgrund dessen ist es möglich Aussagen über ihre Qualität zu treffen (WRENZYCKI et al. 2007). Tabelle 5 gibt einen Überblick über verschiedene Gentranskripte und die Menge des exprimierten Transkriptes in vitro produzierter Blastozysten im Vergleich zu ihren in vivo generierten Gegenstücken.
Tabelle 5: Entwicklungsrelevante Gentranskripte in vitro produzierter Blastozysten im Vergleich zu in vivo Blastozysten
Gen
Expressionsverhalten im Vergleich zu in vivo
produzierten Blastozysten
Referenz
Kompaktierung/Teilung
Cx43 ↓
WRENZYCKI et al.
(1996);
RIZOS et al. (2002)
DSC2 ↑ KNIJN et al. (2002)
Plako ↓ KNIJN et al. (2002)
TJP1 ↓ MILLER et al. (2003)
Stress
Cu/Zn SOD ↓ RIZOS et al. (2002)
Tabelle 5: Entwicklungsrelevante Gentranskripte in vitro produzierter Blastozysten im Vergleich zu in vivo Blastozysten (Fortsetzung)
Gen
Expressionsverhalten im Vergleich zu in vivo
produzierten Blastozysten
Referenz
Stress
HSP ↑ LAZZARI et al. (2002);
WRENZYCKI et al. (2002) WRENZYCKI et al. (2002) Metabolismus
SLC2A1 (GLUT1) ↓ RIZOS et al. (2002)
SLC2A3 (GLUT3) ↑ LAZZARI et al. (2002)
SLC2A4 (GLUT4) ↓ BERTOLINI et al. (2002)
↑ LAZZARI et al. (2002)
G6PD ↑ WRENZYCKI et al. (2002)
PGK ↑ WRENZYCKI et al. (2002)
Trophoblastenfunktion
IFNτ ↑
WRENZYCKI et al.
(2001a);
WRENZYCKI et al.
(2001b)
Masch2 ↓
WRENZYCKI et al.
(2001a);
WRENZYCKI et al.
(2001b) DNA-Methylierung
DNMT1 ↑
WRENZYCKI et al.
(2001b);
WRENZYCKI u.
NIEMANN (2003)
∅ DNMT3A
↑
WRENZYCKI u.
NIEMANN (2003)
HÖFFMANN et al. (2006)
2.6.1. DNA-Methyltransferase 3A (DNMT3A)
Die Familie der DNA-Methyltransferasen (DNMT) ist essentiell für die de-novo Methylierung von embryonalen Stammzellen während der frühen embryonalen Entwicklung (OKANO et al. 1999). Sie spielen eine essentielle Rolle bei der epigenetischen Reprogrammierung des Genoms während der embryonalen Entwicklung (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003). Hierbei katalysieren die Dnmts den Transfer einer Methylgruppe der Aminosäure S-Adenosyl-L-Methionin an zuvor nicht modifizierte DNA (OKANO et al. 1998). Neben der Gruppe der DNMT3 bestehend aus DNMT3A, -3B und -3L, gibt es zwei weitere Familiengruppen: die DNMT1 und die DNMT2. Die DNMT3A besteht aus einer großen N-terminalen Domäne und einer kleineren C-terminalen Domäne (MARGOT et al. 2001).
Bei Mensch und Maus sind zwei Isoformen der Dnmt3a bekannt: Dnmt3a und Dnmt3a2. Während die Dnmt3a ubiquitär vorzukommen scheint, ist die Dnmt3a2 bei diesen beiden Spezies hauptsächlich in embryonalen Stammzellen, Karzinomen, Hoden, Ovarien, Thymus und Milz nachweisbar (CHEN et al. 2002).
Die Bedeutung der Dnmt3a ist bislang vor allem in Mäuseversuchen untersucht worden. So konnten OKANO et al. (1999) nachweisen, dass bei mutanten Tieren Störungen in der Dnmt3a Expression einen Letalfaktor darstellen. Bei Knock-out- Versuchen auf dem maternalen oder paternalen Gen, stellten KANEDA et al. (2004) fest, dass es nicht möglich war, Trächtigkeiten zu etablieren, wenn mutierte männliche Mäuse mit weiblichen Wildtypmäusen gekreuzt wurden (KANEDA et al.
2004). Diese Störungen in der Reproduktion sind auf Störungen in der Spermatogenese zurückzuführen.
Beim Rind war es bislang möglich, die Expression von DNMT3A vom 2-Zell Stadium bis zum Blastozystenstadium nachzuweisen (GOLDING u. WESTHUSIN 2003). Die Art, auf die die Embryonen produziert wurden, spielt bei der relativen Menge der mRNA-Transkripte eine entscheidende Rolle. So konnten HÖFFMANN et al. im Jahr 2006 nachweisen, dass der mRNA-Gehalt bei in vivo produzierten Blastozysten signifikant niedriger ist als bei Blastozysten, die einem IVP-System entstammen (HÖFFMANN et al. 2006). Ein Anstieg von DNMT3A konnte auch bei Blastozysten
nachgewiesen werden, die durch somatischen Kerntransfer entstanden, wiederum verglichen mit Embryonen aus In-vivo- und In-vitro-Produktionen (WRENZYCKI u.
NIEMANN 2003; DECAMARGO et al. 2005).
