Beurteilung der Reexpansionsraten, Schlupfraten und Zellzahlen

Reexpansions- und Schlupfraten sind die ersten Parameter anhand derer der Erfolg einer Kryokonservierungsmethode nach dem Wiederauftauen bemessen werden kann.

Unabhängig mittels welcher Methode die Embryonen kryokonserviert wurden (Vitrifiziert oder konventionell kryokonserviert) sind die Ergebnisse der Reexpansions- und Schlupfraten nach dem Auftauen ähnlich.

Die Reexpansionsraten betrugen 81,1% (n = 86) bei den vitrifizierten Blastozysten und 79,4% (n = 104) bei den konventionell kryokonservierten Embryonen. Die Schlupfraten lagen bei 63,2% (vitrifiziert) und 61,1% (konventionell kryokonserviert).

Die Reexpansionsraten der vitrifizierten Embryonen der vorliegenden Arbeit liegen im mittleren Bereich der Ergebnisse anderer Arbeiten, bei denen die Reexpansionsraten zwischen 64% (NEDAMBALE et al. 2004) und 100% (LUCAS-HAHN et al. 2006) liegen. Die Schlupfraten liegen für dieselben Arbeiten bei 54% bzw. 83,3%.

Diese relativ breite Spanne lässt sich durch die verschiedenen Einflussfaktoren auf die Kryotoleranz der Embryonen erklären. So hat z.B. schon der Zeitpunkt der ersten Teilung einen entscheidenden Einfluss auf die Kryokonservierbarkeit von in vitro produzierten Embryonen (DINNYES et al. 1999). Ebenso kann auch das Öl, mit dem die Maturations-, Fertilisations- und Kulturtropfen überschichtet wurden, Einfluss auf die Einfrierbarkeit der Embryonen nehmen (VAN SOOM et al. 2001). In den oben erwähnten Arbeiten wurden unterschiedliche Medien zur Erstellung der in vitro produzierten Embryonen verwandt. Zusätzlich gibt es Unterschiede in der Ausführung der Methode der Vitrifikation. So verwandten LUCAS-HAHN et al. (2006) das Kryoloopsystem, während andere Autoren andere Systeme nutzten. Auch das Alter und das Entwicklungsstadium der Embryonen spielen bei der Interpretation der Reexpansions- und Schlupfraten eine Rolle und erschweren die Vergleichbarkeit der verschiedenen Arbeiten untereinander. So schwanken die Werte für die Reexpansionsraten/Schlupfraten zwischen Tag sieben Blastozysten (91,3% / 38,1%), Tag sieben expandierten Blastozysten (100% / 83,3%), Tag acht

Blastozysten (86,4% / 21,0%) und Tag acht expandierten Blastozysten (98% / 50,0%) in derselben Arbeit (LUCAS-HAHN et al. 2006).

Auch die Vitrifikation an sich scheint einen gravierenden Einfluss auf die Zellzahl zu haben. So konnte nach Vitrifikation eine signifikante Reduktion der Zellzahlen der ICM festgestellt werden, wohingegen die Zellzahlen des Trophektoderms im Vergleich zu nicht kryokonservierten Embryonen nicht beeinflusst wurden (GOMEZ et al. 2009).

Die Reexpansions- und Schlupfraten der zuvor konventionell kryokonservierten Blastozysten lassen sich ebenfalls nur sehr bedingt mit denen anderer Arbeiten vergleichen. Die Gründe hierfür sind die oben angegebenen. Die Reexpansionsraten anderen Arbeiten liegen zwischen 40% (NEDAMBALE et al. 2004) und 71%

(TAKAGI et al. 1994). Schlupfraten liegen hier zwischen 22% (NEDAMBALE et al.

2004) und 80% (SOMMERFELD u. NIEMANN 1999).

Um in der vorliegenden Arbeit eine Vergleichbarkeit zwischen den Embryonen, die nach beiden Einfrierprotokollen kryokonserviert worden waren zu erreichen, wurden ausschließlich an Tag sieben expandierte Blastozysten für die Kryokonservierung verwandt, die einem SOF-Kultursystem entstammten.

Letztlich miteinander vergleichen lässt sich jedoch nur ob es zwischen konventionell kryokonservierten und vitrifizierten Embryonen eines Stadiums, eines Kultursystems und einer Arbeit signifikante Unterschiede gibt. In der vorliegenden Arbeit ist dieses in Bezug auf die Reexpansions- und Schlupfraten nicht der Fall.

In der Arbeit von NEDAMBALE et al. (2004) zeigte sich, dass konventionell kryokonservierte Blastozysten aus einem KSOM-SOF Kultursystem signifikant niedrigere Reexpansions- und Schlupfraten aufwiesen als vitrifizierte Blastozysten aus demselben System. Diese Arbeit belegte eine vorangegangene Arbeit, bei der ebenfalls signifikant niedrigere Reexpansions- und Schlupfraten bei konventionell kryokonservierten Embryonen festgestellt werden konnten (MAHMOUDZADEH et al.

1994). Allerdings postuliert NEDAMBALE et al. (2004( für seine Arbeit, dass eine Ursache für die niedrigen Reexpansions- und Schlupfraten ein nicht optimales Protokoll für die konventionelle Kryokonservierung für in KSOM-SOF generierte

Aufgrund der ähnlichen Reexpansions- und Schlupfraten der vorliegenden Arbeit lassen sich keinerlei Rückschlüsse darauf schließen, ob eine der Kryokonservierungsarten sich besser für Embryonen eignet, die dem in dieser Arbeit verwandten Kultursystem entstammen als das andere.

Die Gesamtzellzahl und die Lebend-Tot-Ratio der Blastozysten nach Auftauen und der Weiterkultivierung bis zum Schlupf ist ein weiterer Parameter anhand dessen externe Einflüsse auf in vitro produzierte Embryonen bemessen werden können.

Dass allein die Tatsache, ob Embryonen in vivo oder in vitro kultiviert werden, einen Einfluss auf die Zellzahl hat, zeigt sich darin, dass In-vivo-Embryonen an Tag 9 eine fast 3,5 mal so hohe Zellzahl aufweisen, wie ihre in vitro erstellten Gegenstücke (USHIJIMA et al. 2008). Zusätzlich spielt die Art des Kultursystems auch hier eine wesentliche Rolle. Die Zellzahlen schwanken in Abhängigkeit des verwandten Kultursystems für an Tag 7,5 bzw. Tag 8 geschlüpfte Embryonen zwischen 122,1 (MUCCI et al. 2006) und 268 (NEDAMBALE et al. 2004). Die Zellzahlen der Embryonen der Kontrollgruppe dieser Arbeit, die nicht kryokonserviert wurde, sondern im SOF-System bis zum Schlupf kultivierten wurden, liegen bei 130,2 ± 25,6 Zellen. Auch hier liegen die Werte – wie die Werte der Reexpansions- und Schlupfraten im Bereich derer anderer Arbeiten.

SOMMERFELD und NIEMANN (1999) stellten beim Vergleich der Gesamtzellzahlen der Embryonen ihrer Kontrollgruppe (137,2 Zellen) mit den Zellzahlen der kryokonservierten Gruppen fest, dass bei Berücksichtigung der durchschnittlichen Anzahl an degenerierten Blastozysten in einem normalen IVP-System, ihre Methoden der Kryokonservierung eine relativ hohe Kryoprotektion gewährleisten.

Die durchschnittlichen Zellzahlen in der vorliegenden Arbeit nach Kryoprotektion liegen bei 121,3 ± 21,2 für die vitrifizierten und 117,6 ± 20,4 für die konventionell kryokonservierten Embryonen. Diese Werte sind zwar höher als die anderer Autoren (MUCCI et al. 2006; 96,6 ± 2,4 nach Vitrifikation und 99,8 ± 2,2 Zellen nach konventioneller Kryokonservierung), diese Diskrepanz ist aber wiederum durch das differierende Kultursystem zu erklären. Zwischen beiden kryokonservierten Gruppen bei MUCCI ist keine statistische Signifikanz zu ersehen, was darauf hindeutet, dass

die Art des Einfrierens keinen signifikanten Einfluss auf die Zellzahl nach dem Auftauen hat. Dieses konnte auch in der vorliegenden Arbeit so festgestellt werden.

Das Einfrieren an sich zeigte in dieser Arbeit und für das SOF-Kultursystem keinen Einfluss auf die Gesamtellzahl. Die Kryokonservierung zeigte keinen signifikanten Einfluss auf die Lebend-Tot-Ratio. Dies kann bedeuten, dass das Einfrieren an sich keinen Einfluss auf die Überlebensfähigkeit der einzelnen Zelle hat und auch nicht dazu führt, dass bei kryokonservierten Embryonen verhältnismäßig mehr Zellen frühzeitig zugrunde gehen.