DNA-Methyltransferase 3A (DNMT3A)

Die Familie der DNA-Methyltransferasen (DNMT) ist essentiell für die de-novo Methylierung von embryonalen Stammzellen während der frühen embryonalen Entwicklung (OKANO et al. 1999). Sie spielen eine essentielle Rolle bei der epigenetischen Reprogrammierung des Genoms während der embryonalen Entwicklung (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003). Hierbei katalysieren die Dnmts den Transfer einer Methylgruppe der Aminosäure S-Adenosyl-L-Methionin an zuvor nicht modifizierte DNA (OKANO et al. 1998). Neben der Gruppe der DNMT3 bestehend aus DNMT3A, -3B und -3L, gibt es zwei weitere Familiengruppen: die DNMT1 und die DNMT2. Die DNMT3A besteht aus einer großen N-terminalen Domäne und einer kleineren C-terminalen Domäne (MARGOT et al. 2001).

Bei Mensch und Maus sind zwei Isoformen der Dnmt3a bekannt: Dnmt3a und Dnmt3a2. Während die Dnmt3a ubiquitär vorzukommen scheint, ist die Dnmt3a2 bei diesen beiden Spezies hauptsächlich in embryonalen Stammzellen, Karzinomen, Hoden, Ovarien, Thymus und Milz nachweisbar (CHEN et al. 2002).

Die Bedeutung der Dnmt3a ist bislang vor allem in Mäuseversuchen untersucht worden. So konnten OKANO et al. (1999) nachweisen, dass bei mutanten Tieren Störungen in der Dnmt3a Expression einen Letalfaktor darstellen. Bei Knock-out-Versuchen auf dem maternalen oder paternalen Gen, stellten KANEDA et al. (2004) fest, dass es nicht möglich war, Trächtigkeiten zu etablieren, wenn mutierte männliche Mäuse mit weiblichen Wildtypmäusen gekreuzt wurden (KANEDA et al.

2004). Diese Störungen in der Reproduktion sind auf Störungen in der Spermatogenese zurückzuführen.

Beim Rind war es bislang möglich, die Expression von DNMT3A vom 2-Zell Stadium bis zum Blastozystenstadium nachzuweisen (GOLDING u. WESTHUSIN 2003). Die Art, auf die die Embryonen produziert wurden, spielt bei der relativen Menge der mRNA-Transkripte eine entscheidende Rolle. So konnten HÖFFMANN et al. im Jahr 2006 nachweisen, dass der mRNA-Gehalt bei in vivo produzierten Blastozysten signifikant niedriger ist als bei Blastozysten, die einem IVP-System entstammen (HÖFFMANN et al. 2006). Ein Anstieg von DNMT3A konnte auch bei Blastozysten

nachgewiesen werden, die durch somatischen Kerntransfer entstanden, wiederum verglichen mit Embryonen aus In-vivo- und In-vitro-Produktionen (WRENZYCKI u.

NIEMANN 2003; DECAMARGO et al. 2005).

2.6.2. Glukosetransporter 1 (SLC2A1) und Glukosetransporter 3 (SLC2A3)

Die Familie der Glukosetransporter ist eine Familie von eng miteinander verwandten Membranproteinen, die in ihrer Struktur deutliche Ähnlichkeiten miteinander aufweisen. Sie werden heute als Solute Carrier Familie (SLC) – SLC2A1 und SLC2A3 bezeichnet. Früher wurden sie auch als GLUT1 (SLC2A1) und GLUT3 (SLC2A3) bezeichnet.

Es handelt sich um Na⁺-unabhängige Membranproteine, die einen Transport der Glukose in zwei Richtungen entlang eines Konzentrationsgradienten ermöglichen.

Die Hauptaufgabe der Glukosetransporter ist es, den Glukosetransport zwischen inner- und extrazellulärer Matrix zu regulieren (OLSON u. PESSIN 1996). Die erste identifizierte Isoform war der Glukosetransporter1 (SLC2A1), der 1985 von MUECKLER in humanen Geweben entdeckt wurde (MUECKLER et al. 1985).

SLC2A1 wird am stärksten an basolateralen Membranen, wie denen von Blutgefäßen oder der Blut-Hirn-Schranke exprimiert (OLSON u. PESSIN 1996;

AUGUSTIN et al. 2001). Der Glukosetransporter3 (SLC2A3) wird hingegen hauptsächlich an neuronalen Geweben gefunden (AUGUSTIN et al. 2001).

Sowohl der SLC2A1 Transporter als auch der SLC2A3 Transporter werden von der bovinen Oozyte und allen frühembryonalen bovinen Stadien exprimiert. Hierbei stellen SLC2A1 und SLC2A3 die Hauptisoformen der Glukosetransporter in der frühen embryonalen Entwicklung dar (AUGUSTIN et al. 2001).

Die Aufnahme von Glukose nimmt bei in vitro produzierten Embryonen mit zunehmendem Alter stetig zu (RIEGER et al. 1992). Ein erster starker Anstieg des Glukoseverbrauches findet im 8-16 Zell Stadium des Embryos statt. Zu diesem Zeitpunkt findet auch die Aktivierung des embryonalen Genoms statt (LEQUARRE et al. 1997). Ein weiterer extremer Anstieg der mRNA–Expression im Morulastadium legt nahe, dass sich dieses als das Stadium erweist, in dem der Embryo von Glukose als Ernährungsquelle abhängig wird. Dieses wurde auch schon 1992 von RIEGER et al. postuliert, die aussagten, dass der Glukosemetabolismus eines Embryos hauptsächlich in zwei Schritten anstiege: zum Zeitpunkt der Aktivierung des embryonalen Genoms und zum Zeitpunkt der Kompaktierung.

Bei Rinderembryonen ist der SLC2A1 in trophektodermalen Zellen lokalisiert (WRENZYCKI et al. 2003) und wird ab dem 2- bis 4-Zellstadium exprimiert.

Untersuchungen am murinen Slc2a1 zeigten weiterhin, dass dessen Transporteffizienz deutlich erhöht wird, wenn sich die Zelle in einem Zustand des Glukosemangels befindet (GARDNER u. KAYE 1995). Die Expression von SLC2A1 mRNA ist jedoch nicht nur vom Glukosespiegel der Zellen abhängig, sondern im Falle von Embryonen auch von ihrer Qualität. An bovinen Embryonen lies sich zeigen, dass Blastozysten mit der besten morphologischen Qualität die höchste Expression von SLC2A1-mRNA aufwiesen (LOPES et al. 2007)

Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass auch die Entstehungsform des Embryos – in vivo oder in vitro – einen Einfluss auf die relative Menge der mRNA Expression hat. So wird bei in vivo gewonnenen Morulae signifikant mehr SLC2A1-Transkript exprimiert als bei in vitro generierten (WRENZYCKI et al. 1999;

WRENZYCKI et al. 2001a). In mit Serum angereicherten Kulturmedium zeigten 8-16 - Zeller, Blastozysten und geschlüpfte Blastozysten eine deutlich höhere Expression der SLC2A1-mRNA als die Embryonen, die in Medium, das mit PVA supplementiert war, gewachsen waren (WRENZYCKI et al. 1999).

Der SLC2A3 Transporter ist zwar in allen Geweben nachweisbar, seine Hauptlokalisation ist jedoch in neuronalem Gewebe (OLSON u. PESSIN 1996;

AUGUSTIN et al. 2001). In Mäuseembryonen wurde der Slc2a3 im 4-Zellstadium nachgewiesen. Hier ist er an der apikalen Membran des Trophektoderms lokalisiert, um die Zellen mit maternaler Glukose zu versorgen (PANTALEON et al. 1997). Bei Rindern ist SLC2A3 maternaler Herkunft und konnte dementsprechend von der Eizelle bis zur Tag 12-Blastozyste dargestellt werden (AUGUSTIN et al. 2001).

Die Expression von SLC2A3 scheint ein sehr sensitiver Marker für eine suboptimale embryonale Umgebung zu sein. Die relative Transkriptmenge ist bei der In-vitro-Kultur im Brutschrank und bei der in vivo In-vitro-Kultur im Schafeileiter, die ansonsten besser geeignet zu sein scheint, im Gegensatz zu in vivo gewonnenen Embryonen signifikant erhöht (LAZZARI et al. 2002).