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2.6. Entwicklungsrelevante Gentranskripte präimplantatorischer Rinderembryonen

2.6.5. Zona occludens Protein 1 (TJP1)

Analog zu ihren Aufgaben gibt es unterschiedliche Verbindungen zwischen Zellen.

Sie werden in drei Hauptgruppen eingeteilt: die verschließenden Verbindungen, wie z.B. Zona occludens Verbindungen, die Adhäsionsverbindungen, die über

Desmosomen vermittelt werden und die kommunizierenden Verbindungen, wie z.B.

die Gap junctions.

Zur ersten Gruppe der Zell-Zell-Verbindungen zählen die Tight junctions (TJ). Sie bestehen aus einer Reihe von integralen Membranproteinen und aus Plaqueproteinen. Zu den Letztgenannten gehören die Zona Occludens-Proteine TJP1 und TJP2 (STEVENSON u. KEON 1998).

Das Zona occludens-Protein 1 existiert in zwei Isoformen, die durch alternatives Splicen an der 80 Aminosäuren großen C-Terminale entstehen. Diese Isoformen werden als ZO-1α+ und ZO-1α- bezeichnet (BALDA u. ANDERSON 1993).

Bei der Kompaktierung eines Embryos wird aus einem Embryo, der aus zuvor acht deutlich voneinander abgrenzbaren Blastomeren bestand, ein Zellhaufen mit nicht voneinander abzugrenzenden Zellen (VESTWEBER et al. 1987). Während dieses Prozesses entstehen die ersten ausdifferenzierten Zellen des Embryos: das Trophektoderm (TE) und die Inner Cell Mass (ICM). Ein kritischer Schritt bei der Ausdifferenzierung des TEs ist die Ausbildung der Tight junctions an der apicolateralen Grenze der Zellen zueinander (MILLER et al. 2003). Dieser Vorgang wird durch ein Calcium-abhängiges Glykoprotein vermittelt. Sobald die Kompaktierung stattgefunden hat, verbindet sich TJP1 mit der rab-GTPase rab13 und wird somit aktiviert (FLEMING et al. 1989; SHETH et al. 1997).

Die Analyse von murinen Tight junction-Proteinen und -Genen während der einzelnen Teilungsschritte hat ergeben, dass das Programm, nach dem die Proteine zusammengesetzt werden, ein dynamischer Prozess ist, bei dem die Transkription zwischen dem 4- und 8-Zellstadium heraufreguliert wird (HAMATANI et al. 2004; CUI et al. 2007).

Mittels Immunocytochemie ließ sich feststellen, dass die TJ Formierung bei Mäusen und Rindern ähnlich verläuft (BARCROFT et al. 1998) und sich TJP1 bei beiden Spezies als fortlaufender Ring um die apikalen Punkte des Zell-Zell-Kontaktes darstellen lässt.

Bei Embryonen im Stadium der Morula und der Blastozyste wird ein drastischer Anstieg der Expression der Tight junction-Transkripte verzeichnet. Dieses geschieht

al. 2003). Bei in vitro produzierten Blastozysten ist weiterhin ein Unterschied zwischen Tag 7- und Tag 8-Blastozysten festzustellen. So wird an Tag 8 sowohl im Trophektoderm als auch in der ICM signifikant mehr TJP1 exprimiert als an Tag 7 (WRENZYCKI et al. 2003).

Weiterhin ist zu beobachten, dass in vitro produzierte Morulae und Blastozysten, die eine kurze Kompaktierungsphase aufweisen, deutlich weniger TJP1 exprimieren als solche mit einer längeren Kompaktierungsphase. Da die TJP1α+ -Isoform nicht in ihrer Expression verändert ist, liegt die Vermutung nahe, das die zeitliche Dauer der Kompaktierung und die In-vitro-Kultur einen stärkeren Einfluss auf die TJP1α- -Isoform haben (MILLER et al. 2003).

2.6.6. E-cadherin (CDH1)

E-cadherin (CDH1), auch Uvomorulin genannt, ist ein Calcium-abhängiges Glykoprotein, welches Zell-Zell-Kontakt vermittelt (BARCROFT et al. 1998). Die Kompaktierung eines Embryos vom 8-Zell Stadium mit klar abgegrenzten Blastomeren hin zu einem Zellball mit nicht deutlich abzugrenzenden Zelllgrenzen wird hauptsächlich über die Aktivierung von E-cadherin vermittelten Zell Verbindungen aktiviert (VESTWEBER et al. 1987). Gentranskripte für CDH1 können vom frühsten Zygotenstadium die gesamte Präimplantationsperiode über im bovinen Embryo detektiert werden. Die Expression von CDH1 im Embryo ist eng an seine Entwicklung und die Differenzierung von Zellen gekoppelt. Mit der Ausdifferenzierung des Trophektoderms, welches neben der ICM der erste differenzierte Zelltyp während der Embryogenese ist (ECKERT u. FLEMING 2008), steigt auch die Expression von CDH1. Das Trophektoderm ist das erste funktionsfähige Epithel.

Während CDH1 bei Zygoten und Embryonen in den frühen Teilungsstadien noch gleichmäßig um den Rand der einzelnen Blastomeren verteilt ist, ist das Verteilungsmuster ab dem Stadium der Morula verändert. Ab diesem Stadium ist die Expression von CDH1 auf die basolaterale Membran trophektodermaler Zellen beschränkt (BARCROFT et al. 1998). Zellen, die wie die basolateralen Membran des

Trophektoderms mit CDH1 transfiziert sind, entwickeln sich später zu Zellen, die einen epithlialen Phänotyp haben (MARRS et al. 1993).

Das oben beschriebene Verteilungsmuster lässt sich durch die Darstellung mittels Immunfloureszenz bildhaft zeigen. Zusätzlich ist in der Immunfloureszenz erkennbar, dass CDH1 ebenfalls die Peripherie der Inner Cell Mass (ICM) einkreist.

Bei der Expression von murinem Cdh1 ist ein enger Zusammenhang zur Kompaktierung des Embryos ersichtlich (PRATT et al. 1982). So wird diese hauptsächlich durch die Aktivierung von CDH1 vermittelt (BARCROFT et al. 1998).

Bei bovinen Embryonen wird CDH1 vornehmlich ab dem Stadium der Morula exprimiert (WRENZYCKI et al. 1999; WRENZYCKI et al. 2001a), wobei in vivo erzeugte Morulae signifikant mehr CDH1 exprimieren als in vitro generierte aus SOF- oder TCM-Kultur (WRENZYCKI et al. 2001a).

E-cadherin wird auch bei expandierten Blastozysten im Trophektoderm und der ICM exprimiert (SHEHU et al. 1996; BARCROFT et al. 1998), wobei das Trophektoderm bei Tag 8 Blastozysten signifikant mehr CDH1 exprimiert als bei Tag 7-Blastozysten (WRENZYCKI et al. 2003).

Beim Vergleich von Embryonen, die durch somatischen Kerntransfer generiert wurden, mit solchen, die aus einem Standard-IVP-System stammten, konnte 2007 gezeigt werden, dass die Embryonen, die im somatischen Kerntransfer mit weiblichen Kumulszellen erzeugt wurden, signifikant mehr CDH1 exprimierten als ihre Gegenstücke, die durch Kerntransfer von männlichen Fibroblasten erzeugt wurden und solchen, die aus einem Standard-IVP System stammten (AMARNATH et al. 2007).

2.6.7. Desmocollin II (DSCII)

Desmosomale Verbindungen sind Teil des Zell-Zell-Verbindungsapparates und gehören zur Superfamilie der Cadherine. Sie bestehen aus Transmembran-Glycoproteinen und zytoplasmatischen Proteinen (SCHWARZ et al. 1990). Zu den Transmembran – Glykoproteinen gehören die Desmogleine und Desmocolline. Bei den Desmocollinen handelt es sich um Calcium-abhängige Moleküle (LEGAN et al.

1994 konnten LEGAN et al. das Desmocollin III nachweisen, womit schließlich drei Desmocolline (DSCI, DSCII und DSCIII) beim Rind nachgewiesen waren (LEGAN et al. 1994). Jedes Desmocollin ist das Produkt eines eigenen Gentranskripts (LEGAN et al. 1994). Im Mäusemodell konnte gezeigt werden, dass desmosomale Verbindungen bei der Entwicklung des Blastocoels von Bedeutung sind und ihre Entwicklung mit der des Blastocoels einhergehen. Ferner spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung des Trophektoderms, während die Blastozyste expandiert (FLEMING et al. 1991; COLLINS et al. 1995). Hier konnte Desmocollin II von der Oozyte bis zum frühen 8-Zell Stadium nachgewiesen werden.

Im kompaktierten 8-Zell Stadium konnte kein DscII nachgewiesen werden. Eine Darstellung war erst wieder ab dem 16-Zell Stadium möglich (COLLINS et al. 1995).

Beim Rind kann DSC2 ab dem 2-4 Zell-Stadium aufwärts nachgewiesen werden.

Dieses legt den embryonalen Ursprung der Desmocollin II-Transkripte nahe (WRENZYCKI et al. 1998).

Weitere Untersuchungen am bovinen Beispiel konnten zeigen, dass Desmocollin II signifikant mehr vom Trophektoderm exprimiert wird als von der ICM und hierbei wiederum signifikant mehr bei Tag acht-Blastozysten als bei Tag sieben-Blastozysten (WRENZYCKI et al. 2003). Schon zuvor konnte heraus gefunden werden, dass in vivo erzeugte Morulae (WRENZYCKI et al. 2001a) und Blastozysten (WRENZYCKI et al. 2001a; KNIJN et al. 2002) wesentlich mehr DSC2 exprimieren als ihre in vitro generierten Gegenstücke. Hierbei spielt auch die Art des Kultursystems nur eine untergeordnete Rolle, da sowohl Blastozysten die im SOF-Medium generiert wurden als auch Blastozysten, die im TCM-Kultursystem kultiviert wurden, signifikant weniger DSC2 exprimieren als in vivo erzeugte Embryonen. Dies könnte erklären, weshalb die Entwicklung bei in vitro produzierten Embryonen bisweilen beeinträchtigt zu sein scheint (PRATHER u. FIRST 1993).

Beim Vergleich einzelner Kultursysteme miteinander zeigte sich 1999, dass Embryonen, die in einem Kultursystem, das mit PVA supplementiert wurde, im Stadium der Blastozyste und der geschlüpften Blastozyste signifikant mehr Desmocollin II exprimierten als Embryonen des gleichen Stadiums, die einem Kultursystem entstammten, das mit Serum supplementiert worden war (WRENZYCKI

et al. 1999). Bei Untersuchungen, bei denen IVP-Embryonen in einem Insulin-Like Growth-Faktor-1 (IGF)-Kultursystem erzeugt wurden, konnte nachgewiesen werden, dass diese Blastozysten im Vergleich zu Blastozysten, die kein IGF erhielten, signifikant mehr DSC2 exprimierten. Der Autor schreibt diese Auffälligkeit jedoch eher einer beschleunigten Entwicklung der Blastozysten zu, die mit IGF kultiviert wurden (BLOCK et al. 2008).