Schnelle Gefrierverfahren

1980 wurde zum ersten Mal ein schnelleres Gefrierverfahren beschrieben (WOOD u.

FARRANT 1980) als die bisher genutzten Verfahren, die die Embryonen langsam bis zu sehr niedrigen Temperaturen herunterkühlten, bei denen sie dann verblieben.

WOOD und FARRANT beschreiben eine „two-step“-Methode, bei der die Embryonen im ersten Schritt mit langsamen Kühlraten auf eine Temperatur von -20°C bzw. -25°C heruntergekühlt wurden, für eine Weile bei dieser Temperatur verblieben, um dann direkt in flüssigen Stickstoff überführt zu werden. Während dieses zweiten Schrittes des Einfrierprozesses kommt es zu entsprechend hohen Kühlraten. Sie beschrieben ebenfalls, dass die Zeitspanne, bei der die Embryonen bei der Temperatur gehalten wurden, scheinbar keinen Einfluss auf deren Überlebensfähigkeit hatte. Während des Auftauens war nach ihrem Protokoll eine hohe Auftaurate erforderlich, um eine möglichst hohe Überlebensfähigkeit zu gewährleisten (WOOD u. FARRANT 1980).

In der Weitentwicklung dieses Verfahrens bildete sich bald ein bis heute genutztes Grundprotokoll heraus (RALL 1992): Zunächst wird dem Embryo ein ein- bis zweimolares Kryoprotektivum zugeführt, in dem er zur Äquilibrierung einen gewissen Zeitraum verbleibt. Während dieser Phase des Äquilibrierens wird der Embryo in den Behälter, in dem er eingefroren werden soll, überführt. Anschließend wird der

eine schädliche Unterkühlung des Embryos (LEIBO 1984). Anschließend wird der Embryo mit kontrollierten Raten bis zu einer Temperatur von -20°C - -40°C heruntergekühlt, um dann direkt in flüssigen Stickstoff, der eine Temperatur von -196°C hat, überführt zu werden.

Die Ausverdünnung des Kryoprotektivums nach dem Auftauen der eingefrorenen Embryonen stellte zunächst den limitierenden Faktor bei der Menge der zeitgleich auftaubaren Embryonen dar. Das Kryoprotektivum wurde ursprünglich schrittweise ausverdünnt, was eines zeitlichen Aufwandes von 20 – 60 Minuten bzw. bis zu 90 Minuten bedurfte (LEIBO 1984; VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1995).

LEIBO war es 1984 möglich, das erste Mal ein so genanntes „One-step“-Auftauverfahren zu etablieren, das es ermöglichte, eingefrorene Embryonen direkt nach dem Auftauen ohne weitere Ausverdünnung zu übertragen. Dieses wurde durch den Zusatz von nichtpenetrierenden Kryoprotektiva - wie in diesem Falle Saccharose - ermöglicht.

Bis zu Beginn der 90er Jahre waren Glycerin, DMSO sowie Propylenglycol die Kryoprotektiva, die am häufigsten benutzt wurden (MASSIP 2001). EG wurde zwar versuchsweise schon Ende der 70er Jahre eingesetzt (MIYAMOTO u. ISHIBASHI 1977), aber erst in den 90er Jahren kam es zum routinemäßigen Gebrauch. Durch sein geringeres Molekulargewicht ist EG wesentlich permeabler als zum Beispiel DMSO und es ist möglich, EG als Kryoprotektivum einzusetzen, ohne es beim Auftauen der Embryonen ausverdünnen zu müssen. Dies vereinfachte die Handhabung und Übertragung von TG-Embryonen für Embryotransfer-Techniker (MASSIP 2001).

2.4. Vitrifikation

Die Vitrifikation ist ein ultraschnelles Gefrierverfahren, bei dem im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren keine Kristallisation – also keine Eisbildung - der extrazellulären Flüssigkeit hervorgerufen wird, sondern bei dem zelluläres und extrazelluläres Wasser in einen amorphen glasartigen Zustand überführt werden.

Es entfallen die Schritte des Seedings und des langsamen Herabkühlens auf eine Temperatur zwischen -20°C und -25°C. Somit werden f ür dieses Verfahren keine programmierbaren Einfrierautomaten benötigt. Nach einer schrittweisen Äquilibrierung in hochkonzentrierten Lösungen sind die Zellen dehydriert und werden direkt in flüssigen Stickstoff überführt.

Das erste Mal wurde diese Methode 1985 für Embryonen beschrieben und eingesetzt (RALL u. FAHY 1985; RALL 1985). Die Embryonen waren einer umgekehrten Verdünnungsreihe dem Kryoprotektivum ausgesetzt, das sowohl penetrierende als auch nicht penetrierende Komponenten enthielt (RALL u. FAHY 1985).

Durch die direkte Überführung in flüssigen Stickstoff liegen bei diesem Verfahren extrem hohe Kühlraten vor (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1995), die bis zu 20000°C/min betragen (VAJTA et al. 1998). Ebenso ho ch sind die Raten, mit denen die Embryonen wieder aufgetaut werden. Direkt nach dem Auftauen findet eine schrittweise Ausverdünnung des Kryoprotektivums statt.

Bei dieser Methode des Einfrierens entfällt die Gefahr der Zellschädigung durch Eiskristallbildung, da die hohe Konzentration des Kryoprotektivums und die hohen Kühl- und Auftauraten die Eiskristallbildung verhindern (KULESHOVA u. LOPATA 2002).

Neue Schädigungsgefahren entstehen durch die erhöhte Toxizität der Kryoprotektiva. Dieser Toxizitätsanstieg geht mit der höheren Konzentration der Medien einher. Es wird versucht, die toxischen Effekte, die die einzelnen Kryoprotektiva in hohen Konzentrationen besitzen, abzuschwächen, indem

nutzten eine Mischung aus penetrierenden und nichtpenetrierenden Kryoprotektiva.

Auch andere Autoren nutzen verschiedene Kryoprotektiva in Mischung, um Embryonen (erfolgreich) einzufrieren. VAJTA et al. und HOLM et al. nutzen 1998 eine Mischung aus EG und DMSO als Kryoprotektivum.

Weiterhin können sich die hohen Einfrier- und Kühlraten negativ auf die Überlebensfähigkeit der Embryonen auswirken (VAJTA et al. 1998).

ARAV et al. postulierten, dass es drei Hauptfaktoren gäbe, die die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Vitrifikation beeinflussen würden. Der erste Faktor sei die Viskosität des Kryoprotektivums, der zweite Faktor die Erzielung einer möglichst hohen und gleich bleibenden Kühlrate und der dritte Faktor die Verringerung des Probenvolumens (ARAV et al. 2002).

Problematisch stellt sich die Erzielung möglichst hoher und gleich bleibender Kühlraten dar, wenn der Embryonencontainer direkt in den flüssigen Stickstoff überführt wird. Durch die ursprünglich höhere Temperatur des Containers verdampft der Stickstoff um den Container herum, und bildet dabei eine isolierende Schicht aus Gas (YAVIN et al. 2009). YAVIN et al. verwandten aufgrund dessen statt flüssigem Stickstoff, Stickstoff der sich am Übergang von der festen zur flüssigen Phase befand und eine Temperatur von -210°C hatte. Mittels diese s Verfahrens war es ihm möglich, die Kühlrate auf fast 53000°C/min herauf z u setzen.

Bei der Vitrifikation werden unterschiedliche Trägersysteme verwandt, die unterschiedlichen Problemen der Vitrifikation gerecht werden sollen.

So hat sich gezeigt, dass eine Verringerung des Probenvolumens, also der Menge des Kryoprotektivums, in dem der Embryo vitrifiziert wird, die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Vitrifikation erhöht. Dies geschieht durch eine Erhöhung der Kühlrate, die mit der Verringerung des Probenvolumens einhergeht (ARAV et al.

2002). Es gibt bereits etliche Möglichkeiten diese angestrebte Verringerung des Probenvolumens zu erreichen. So wird bereits 1990 die Methode des Vitrifizierens mittels eines Elektronenmikroskoprasters beschrieben (STEPONKUS et al. 1990).

Zusätzlich zur Probenvolumenverringerung erlaubt es diese Methode mehr als eine Probe auf ein Mal einzufrieren, in diesem Falle bis zu zwanzig Oozyten gleichzeitig.