3. Material und Methoden
3.1. In-vitro-Produktion (IVP)
Die Produktion (IVP) besteht methodisch aus drei Schritten: der In-vitro-Maturation (IVM) oder Reifung, der In-vitro-Fertilisation (IVF) und der In-vitro-Kultur (IVC). Diese drei Schritte erfolgen an drei aufeinander folgenden Tagen.
3.1.1. Herkunft der Ovarien
Die Ovarien wurden einmal wöchentlich aus einem nahe gelegen Schlachthof von frisch geschlachteten Tieren gesammelt. Hierbei wurde darauf geachtet, dass die Tiere, denen die Ovarien entnommen wurden, weder trächtig noch juvenil waren und die Ovarien keine zystischen Veränderungen aufwiesen. Die Ovarien wurden nach dem Abschneiden in 37°C warmem PBS Complete in eine m Thermobehälter schnellstmöglich ins Labor gebracht, um dort weiter bearbeitet zu werden. Das PBS Complete enthielt auf 1000 ml destilliertes Wasser 9,65 g Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, 10 ml PBS-Stocklösung, 11,2 mg Heparin (= 4 I.E.) sowie 1 g Bovines Serumalbumin (Fraktion V).
3.1.2 Vorbereitung und Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe
Die Vorbereitung der Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) begann mit dem dreimaligen Waschen der frischen Ovarien mit je 350 ml 0,9%iger Natrium-Chlorid- Lösung, die zuvor im Wasserbad auf 37°C erwärmt wur de. Der Lösung waren 0,06 g Penicillin und 0,1 g Streptomycin pro Liter zugesetzt.
Anschließend wurden mittels der Slicing-Methode (ECKERT u. NIEMANN 1995) die Oozyten aus den Ovarien isoliert. Die Ovarien wurden hierzu mit einer Arterienklemme fixiert und in eine Petrischale, die 100 ml PBS Complete enthielt, getaucht. Das Schneiden fand mit einem Block bestehend aus zehn parallel zueinander befestigten Rasierklingen (im Abstand von ca. 2-3 mm zueinander) statt.
Dabei wurden oberflächliche und tiefe Follikel eröffnet und die KOK zusammen mit der Follikelflüssigkeit herausgespült. Anschließend wurde die so gewonnene Flüssigkeit gemeinsam mit dem bereits in der Petrischale enthaltenen PBS Complete durch ein herkömmliches Sieb in ein Becherglas gegossen, um überschüssige Gewebestücke zu entfernen. Die Petrischale und das Sieb wurden anschließend zweimal mit je 50 ml PBS Complete gespült, um noch eventuell in der Petrischale vorhandene KOK zu erhalten.
Die nun im Becherglas vorhandene Flüssigkeit stand für zehn Minuten zur Sedimentation auf einem Styroporstück, um ein Auskühlen der Flüssigkeit zu verhindern bzw. zu verlangsamen. Anschließend wurde der Flüssigkeitsüberstand bis auf 100 ml mit einer herkömmlichen Vakuumpumpe abgesaugt. Die Verteilung des Sediments erfolgte gleichmäßig auf Plastikreagenzbehälter mit je 15 ml Fassungsvermögen und es ruhte erneut für zehn Minuten zur Sedimentation. Dies geschah auf einer Wärmeplatte mit einer Temperatur von 37°C.
Das Sediment in jedem Reagenzgefäß wurde nun mittels einer Pasteurpipette abgesaugt, in eine Plastikpetrischale überführt und auf ca. 80 ml mit PBS Complete aufgefüllt. Das Heraussuchen der KOK erfolgte unter einem Stereomikroskop (Fa.
Olympus, Hamburg, Deutschland) mit Wärmeplatte aus dem verdünnten Sediment.
Gefundene KOK wurden mit einer 0,25 µl Glaspipette (Fa. Hirschmann, Eberstadt, Deutschland) und eines Pipettierhelfers (Fa. Brand, Wertheim, Deutschland) in 2 ml TCM air überführt. Die bereits gefundenen KOK verblieben im TCM air bis die Sedimente aller Reagenzgefäße nach KOK abgesucht worden waren. Anschließend erfolgte die Selektion der KOK bezüglich ihrer Qualität. Die Einteilung erfolgte in fünf Kategorien, die der Tabelle 6 entnommen werden können. Für die In-vitro-Produktion taugliche KOK (Abbildung 7) waren solche der Kategorien 1, 2 und 3.
Die Kategorie 1 zeichnet sich durch einen mindestens dreilagigen Cumulus oophorus aus, wobei die Oozyte ein dunkles gleichmäßig granuliertes Zytoplasma aufweist.
KOK der Kategorie 2 haben ebenfalls ein homogenes dunkles Zytoplasma, jedoch weist der Cumulus oophorus stellenweise weniger als drei Lagen auf. KOK der Kategorie 3 weisen ein homogenes oder heterogenes Zytoplasma auf und besitzen einzelne anhaftende Kumuluszellen.
Anschließend wurden die so selektierten KOK zufällig in Gruppen zu zwanzig Oozyten zusammengefasst und zur Ausverdünnung des TCM air Mediums nacheinander durch drei unter Silikonöl befindliche 100 µl Tropfen TCM+BSA pipettiert (Waschen).
Tabelle 6: Klassifizierung gefundener Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK)
Kategorie IVP-Tauglichkeit
Abbildung 7: IVP-taugliche Kumulus-Oozyten-Komplexe
3.1.3. In-vitro-Maturation
Das Reifungsmedium bestand aus TCM + BSA + Suigonan (Fa. Intervet, Unterschleißheim) und wurde in einer Petrischale (∅ 35 mm) in vier Tropfen à 100 µl und mit Silikonöl (Fa. Serva, Deutschland) überschichtet. Die Tropfen wurden mindestens eine Stunde vor Gebrauch im Brutschrank (HeraCell, Fa. Heraeus, Thermo Fisher Scientific, USA) bei 39,0°C und 5% CO2 äquilibriert. Die KOK wurden nach dem oben beschriebenen Waschen in die äquilibrierten Reifungsdrops überführt und für 24 Stunden bei 39,0°C und 5% CO2 und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre im Inkubator kultiviert.
3.1.4. Fertilisation
Die gereiften KOK wurden dreimal in FertTALP-Gebrauchslösung gewaschen und anschließend in die Fertilisationstropfen bestehend aus 120 µl HHE (Hypotaurin-Heparin-Epinephrin) + 2 ml FertTALP überführt. Auch diese waren zu viert mit einer Tropfengröße von 100 µl in einer Petrischale mit dem Durchmesser von 35mm angeordnet. Die Fertilisationstropfen wurden zur Äquilibrierung mindestens eine Stunde vor dem Umsetzten der KOK bei 39,0°C und 5% CO2 in den Brutschrank verbracht.
Das Tiergefriersperma für die Fertilisation wurde für 10 Sekunden in 30°C warmen Wasser aufgetaut. Es wurde direkt nach dem Auftauen auf ausreichende Motilität der Spermien hin überprüft und anschließend für 16 Minuten bei 380 x
g
(2380 Umdrehungen/Minute) in einer Zentrifuge (Mini Spin plus, Fa. Eppendorf, Deutschland) mit einem 90%igen Gradienten aus Sperm Filter® und FertTALP Lösung in einem Eppendorfgefäß zentrifugiert. Der Überstand wurde nach dem Ende der Zentrifugation bis auf 50 µl abgenommen und verworfen. Das im Eppendorfgefäß verbliebene Pellet wurde in 750 µl FertTALP-Gebrauchslösung resuspendiert und erneut für 3 Minuten bei 380 xg
zentrifugiert. Daraufhin wurde der Überstand wieder bis auf 50 µl abgesogen und verworfen. Eine erneute Resuspendierung des verbliebenen Restes erfolgte mit 750 µl HHE-Lösung. Abschießend wurde die Spermalösung nochmals bei 380 xg
zentrifugiert. Der Überstand wurde nun bis auf 100 µl abgenommen und die Spermatozoen im offenen Eppendorfgefäß im Brutschrank bei 39,0°C und 5% CO2 aufbewahrt. Es erfolgte anschließend eine Dichtebestimmung der Spermien mittels einer Thomakammer, um die erforderliche Spermiendichte von 100 000 Spermien/100 µl FertTALP/HHE Lösung zu erlangen.Der Zusatz der Spermien erfolgte 23-24 Stunden nach Maturationsbeginn direkt in die zuvor mit KOK bestückten Fertilisationstropfen.
Für die Befruchtung wurden die Petrischalen mit den KOK und den Spermien für 19 Stunden in einen Brutschrank mit 39,0°C und 5% CO2 und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre verbracht.
3.1.5. In-vitro-Kultur
Nach 19stündiger Kokultur der gereiften KOK und Spermien, wurden die vermeintlichen Zygoten in eine 35 mm im Durchmesser große Petrischale mit 2 ml auf 37°C erwärmten TCM air verbracht und die Kumulu szellen mittels einer ausgezogenen Glaskapillare unter stereomikroskopischer Sichtkontrolle entfernt. Zur Temperaturerhaltung des Mediums wurde auf einer Wärmebank gearbeitet. Die von den Kumuluszellen vollständig befreiten Zygoten wurden nach drei Medienausdünnungsschritten in Gruppen à sechs Stück in 30 µl Tropfen (Synthetic Oviduct Medium (SOF) aa) unter Öl (Fa. Serva, Deutschland) bei 39,0°C, 5% CO2
und 5% N2 für acht Tage kultiviert. Kontrollen bezüglich der Teilungs- und Entwicklungsraten erfolgten an Tag 7 und an Tag 8.
Abbildung 9: Expandierte Blastozyste nach siebentägiger In-vitro-Kultur
Hierbei wurden an Tag sieben vorhandene expandierte Blastozysten aus der Kultur entnommen und randomisiert für die konventionelle Kryokonservierung und die Vitrifikation eingesetzt.