Genexpression nach dem Auftauen

Die Untersuchung der Expression entwicklungsrelevanter Gentranskripte erlaubt eine weitergehende Qualitätsbeurteilung von Embryonen auf molekularer Ebene. So konnte in der Vergangenheit die Expression ebensolcher Gentranskripte in Abhängigkeit von der Art der Gewinnung – in vivo oder in vitro – (KNIJN et al. 2002;

RIZOS et al. 2002; MILLER et al. 2003), vom Stadium des Embryos (WRENZYCKI et al. 1999; WRENZYCKI et al. 2002) und vom verwandten Kultursystem (WRENZYCKI et al. 1998) dargestellt werden. Bislang wurde die Genexpression nur vereinzelt genutzt, um die Qualität von bovinen Embryonen nach der Kryokonservierung zu beurteilen. Wenn Untersuchungen solcher Art stattgefunden haben, so wurde jedoch nur eine Methode zur Kryokonservierung (PARK et al. 2006; YAO et al. 2009) untersucht und es fand kein Vergleich auf molekularer Ebene statt

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Kryokonservierung auf acht entwicklungsrelevante Gentranskripte untersucht.

Die Ergebnisse der RT-qPCR ergaben, dass die relativen Transkriptmengen für HSP70-1, SLC2A1 und TJP1 in der Gruppe der Embryonen, die nicht eingefroren waren, signifikant höher waren als bei denen der kryokonservierten Gruppen. Es ist bekannt, dass die Expression von HSP70-1 bei in vitro produzierten Embryonen heraufreguliert ist (WRENZYCKI et al. 2001a). PARK et al. (2006) konnten in ihren Untersuchungen feststellen, dass die Expression von HSP70-1 nach der Vitrifikation signifikant heraufreguliert war. Als zusätzliche Stressoren, die die Expression von HSP70-1 beeinflussen, konnten auch Zusätze zum Kultursystem identifiziert werden (WRENZYCKI et al. 1999). Durch solche Veränderungen war es möglich, die embryonale Qualität negativ zu beeinflussen. Allerdings sind auch diese Ergebnisse in Abhängigkeit zum verwandten Kultursystem zu betrachten (vgl. Kapitel 5.1.), da z.B. bei dem für diese Arbeit verwandten Kultursystem die Expression von HSP70-1 für die in vitro produzierten Embryonen ähnlich ist wie die der in vivo erzeugten (WRENZYCKI et al. 2001a).

Die zytoprotektiven Eigenschaften des HSP70-1 liegen in der Fähigkeit Proteine, die durch thermischen Stress geschädigt wurden, neu zu falten (DUNCAN u. HERSHEY

1989). Ist die Expression, so wie in den kryokonservierten Embryonen der vorliegenden Arbeit signifikant herabgesetzt, so kann dies bedeuteten, dass die Fähigkeit der Embryonen thermischen Stress zu bewältigen, ebenfalls herabgesetzt ist und diese herabgesetzte Expression mit einer herabgesetzten zytoprotektiven Eigenschaft einhergeht.

SLC2A1 hat als Hauptaufgabe den Transport von Glukose entlang von basolateralen Membranen. Er gewinnt bei Embryonen im Stadium der Morula an Bedeutung, da dies das Stadium ist, in dem der Embryo von Glukose als Ernährungsquelle abhängig wird (RIEGER et al. 1992). Er wird bei in vivo produzierten Embryonen im Stadium der Morula signifikant mehr exprimiert als bei in vitro produzierten Morulae (WRENZYCKI et al. 1999; WRENZYCKI et al. 2001a), gleichzeitig geht eine gute morphologische Qualität in vitro produzierter Embryonen mit einer höheren Expression von SLC2A1 einher (LOPES et al. 2007). Dies kann bedeuten, dass der Metabolismus in vitro produzierter Embryonen nicht ausreichend Glukose umsetzen kann (im Vergleich zu in vivo produzierten Embryonen). Für die kryokonservierten Embryonen der vorliegenden Arbeit kann dies bedeuten, dass die herabgesetzte Expression von SLC2A1 bei den Embryonen beider kryokonservierten Gruppen bedeutet, dass die Qualität der Embryonen nach dem Einfrieren schlechter ist als vorher und der Metabolismus nach dem Auftauen weniger Glukose zur Verfügung hat als vorher. Da zwischen beiden Gruppen kein signifikanter Unterschied in der Expression von SLC2A1 festzustellen ist, liegt die Vermutung nahe, dass nicht die Art der Kryokonservierung sondern die Kryokonservierung an sich entscheidend für die Qualitätsminderung ist.

Auch die Transkripte von TJP1 wurden in den Embryonen der vorliegenden Arbeit nach der Kryokonservierung in beiden Einfriergruppen signifikant weniger exprimiert als in der Kontrollgruppe. Bei Embryonen des gleichen Entwicklungsstadiums und der gleichen Entwicklungsgeschwindigkeit, ist es bekannt, dass sich die Expression von TJP1 in vivo und in vitro produzierten Blastozysten nicht signifikant

von TJP1 bei in vitro produzierten Embryonen, deren Kompaktierungsphase kurz ist und solchen deren Kompaktierungsphase lang ist. So ist bei Blastozysten, bei denen im Morulastadium eine verkürzte Kompaktierungszeit festzustellen war, eine signifikant niedrigere Expression von TJP1 festzustellen (MILLER et al. 2003). Für die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bedeutet dies, dass durch beide Formen der Kryokonservierung Veränderungen in der Expression von TJP1 hervorgerufen werden, die letztlich bedeuten, dass es zu Veränderungen/Störungen in der Ausdifferenzierung von Zellen kommen könnte. Inwiefern dieses tatsächlich auch Auswirkungen auf die Menge der umgesetzten Proteine hat, müsste in weitergehenden Untersuchungen geklärt werden.

Die Gentranskripte von SLC2A3 und DNMT3A wurden bei der Gruppe der konventionell kryokonservierten Embryonen signifikant niedriger exprimiert als bei der Kontrollgruppe. Zwischen der Gruppe der vitrifizierten Embryonen und denen der konventionell kryokonservierten sowie der Kontrollgruppe war kein statistisch signifikanter Unterschied in der Expression festzustellen.

SLC2A3, dessen Hauptaufgabe der Transport von Glukose an neuronalem Gewebe ist, hat sich in der Vergangenheit als sehr sensitiver Marker für suboptimale Kulturbedingungen bei der IVP herausgestellt (LAZZARI et al. 2002). Dadurch dass die Expression nur bei in vitro produzierten Embryonen signifikant erhöht war, kann davon ausgegangen werden, dass diese qualitativ nicht denen, die in vivo generiert wurden, entsprechen. (LAZZARI et al. 2002). In Anlehnung an diese Arbeit bedeutet dies für die vorliegende Arbeit, dass die Embryonen, die nach der konventionellen Kryokonservierung untersucht wurden, in ihrem mRNA-Gehalt eher denen in vivo erstellter Embryonen ähneln. Fraglich ist allerdings, ob die Herunterregulierung der Expression von SLC2A3 nach In-vitro-Kultur und konventioneller Kryokonservierung im Vergleich zur Expression nach Vitrifikation nicht auch einen negativen Einfluss der konventionellen Kryokonservierung widerspiegeln könnte.

WRENZYCKI und NIEMANN (2003) konnten keinen Unterschied in der relativen Transkriptmenge von DNMT3A in Abhängigkeit zur Produktionsart (in vivo oder in

vitro) der Embryonen nachweisen. Allerdings konnte in späteren Arbeiten festgestellt werden, dass sich je nach Stadium (10-16 Zeller, Morula, Blastozyste) doch Signifikanzen in Bezug auf die Expression von DNMT3A-Transkripten (HÖFFMANN et al. 2006) sowie auch auf Proteinebene nachweisen ließen (HÖFFMANN et al.

2006; DRALLMEYER 2008; DRALLMEYER et al. 2009). Dieses könnte durch die Tatsache bedingt sein, dass in den späteren Arbeiten andere Kultursysteme zur IVP der Embryonen benutzt wurden. Zusätzlich konnte festgestellt werden, dass signifikante Unterschiede im Proteingehalt und der Proteinlokalisierung der DNMT3A in den Blastomeren auf einen Einfluss der In-vitro-Kultur auf die De novo-Methylierung vor, während und nach der Aktivierung des embryonalen Genoms hindeuten (DRALLMEYER 2008). Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen einen Einfluss der konventionellen Kryokonservierung im Vergleich zur Kontrollgruppe nach. Der Ablauf der De novo-Methylierung könnte hier zeitlich verzögert oder aber generell weniger stattfinden. Um das eine oder das andere gegebenenfalls auszuschließen, wäre hier eine Proteinanalyse nötig, da die Proteine der DNMT3A lediglich zu solchen Zeitpunkten in der Zelle nachgewiesen werden können, zu denen tatsächlich eine Methylierung stattfindet (LEES-MURDOCK et al. 2005).

Bei der Analyse der Expression des Trächtigkeit erhaltenden IFNτs ergab sich eine statistisch signifikante Erhöhung der relativen Transkriptmenge für die Gruppe der konventionell kryokonservierten Embryonen. IFNτ wird in der vorliegenden Arbeit als Qualitätsmerkmal genutzt, da eine Korrelation zwischen früher und hoher Expression und schlechter Qualität ausgemacht werden konnte (LEPPENS-LUISIER et al. 2001;

WRENZYCKI et al. 2001a). Generell liegt der Expressionsspiegel von IFNτ bei in vitro produzierten Embryonen höher als bei ihren in vivo erzeugten Gegenstücken, was für die in vitro produzierten Embryonen die Wahrscheinlichkeit der Trächtigkeitsetablierung vermindert (KUBISCH et al. 2004). Da die relative Transkriptmenge der konventionell kryokonservierten Embryonen signifikant über dem der Kontrollgruppe liegt, ist es wahrscheinlich, dass sich konventionelle Kryokonservierung in Bezug auf die relative Transkriptmenge von IFNτ negativ auf

deren Autoren in Bezug auf die Expression von IFNτ nach dem Auftauen nach konventioneller Kryokonservierung keinen Unterschied zwischen in vivo und in vitro produzierten Embryonen feststellen konnten (YAO et al. 2009). Dieses ist wahrscheinlich auf die Verwendung anderer Maturations-, Fertilisations- und Kulturmedien als in der vorliegenden Arbeit zurückzuführen.

Die hohe Expression von IFNτ bei der Gruppe der konventionell kryokonservierten Embryonen in dieser Arbeit spricht für eine niedrigere Wahrscheinlichkeit der Etablierung einer Trächtigkeit im Falle eines Transfers.

Bei der Expression von CDH1 waren keinerlei Signifikanzen zwischen den Embryonen der beiden Einfrier- und denen der Kontrollgruppe feststellbar. Die relative Transkriptmenge der Embryonen beider Einfriergruppen lag jedoch unter der der Embryonen der Kontrollgruppe. Es scheint als habe die Kryokonservierung an sich wenig Einfluss auf die Expression von CDH1 und damit auf die E-cadherin vermittelten Zell-Zell-Verbindungen des Trophektoderms. Dieses bedeutet, dass die Kryokonservierung keinen signifikanten Einfluss die E-cadherin vermittelten Zell-Zell-Verbindungen hat. Untersuchungen, bei denen gezeigt werden konnte, dass CDH1 bei Tag 8 Blastozysten signifikant mehr exprimiert wird als bei Tag 7-Blastozysten (WRENZYCKI et al. 2003) könnten jedoch einen Hinweis darauf geben, dass sich das Expressionsmuster verändern könnte, würden Tag 8-expandierte Blastozysten kryokonserviert. Dies könnte ebenso wie die Frage, inwieweit sich die Kryokonservierung auf das Verteilungsmuster von CDH1 am Trophektoderm des Embryos auswirkt, durch gesonderte Untersuchungen (Immunfloureszenz und Genexpressionsanalyse an Tag 8 kryokonservierter Embryonen) geklärt werden.

In der vorliegenden Arbeit ist die relative Transkriptmenge von DSC2 der vitrifizierten Blastozysten nach dem Auftauen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant herabgesetzt.

DSC2 wird von in vitro produzierten Embryonen signifikant weniger exprimiert als von in vivo gewonnenen (WRENZYCKI et al. 2001a; KNIJN et al. 2002). Dies könnte eine Erklärung für die z.T. verzögerte Entwicklung in vitro produzierter Blastozysten darstellen, da DSC2 eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung des Blastocoels spielt.

Ist die relative Transkriptmenge nach der Vitrifikation noch weiter reduziert, stellt sich die Frage, ob sich die Entwicklung der vitrifizierten Blastozysten ebenfalls verschlechtert. Dieses wäre gegebenenfalls durch weitere Untersuchungen, wie Immunfloureszenzuntersuchungen zur Darstellung von interzellulären Verbindungen zu klären.

5.3. Schlussfolgerungen

Die Kryokonservierung hat einen maßgeblichen Einfluss auf die Qualität der Embryonen. Dieses wird in den Ergebnissen der morphologischen Untersuchungen in Bezug auf die Gesamtzellzahl im Rahmen der vorliegenden Arbeit widergespiegelt. Die Zellzahlen beider Gruppen, die zuvor kryokonserviert worden waren, waren ähnlich denen der Kontrollgruppe. Unterschiede in den Gesamtzellzahlen können dadurch bedingt sein, dass bisweilen beobachtet werden kann, dass einzelne Zellen beim Schlupf der Blastozyste der Innenseite der Zona Pellucida anhaften und vom Embryo abgehen. Zwischen den beiden Einfriergruppen konnten keine Unterschiede bezüglich der Zellzahlen und der Reexpansions- und Schlupfraten festgestellt werden, was dafür spricht, dass die Art der Kryokonservierung keinen wesentlichen Einfluss auf die Qualität der Embryonen hat.

Werden nicht nur die morphologischen, sondern auch die molekulargenetischen Untersuchungen in Betracht gezogen, so ist jedoch in Abhängigkeit vom untersuchten Gentranskript ein Unterschied zwischen den beiden Arten der Kryokonservierung festzustellen.

Die Untersuchung des Transkriptes für das HSP70-1 konnte zunächst einen generellen Einfluss der Kryokonservierung auf in vitro produzierte Embryonen aufzeigen.

Bei Betrachtung der Gentranskripte, die an Zell-Zell-Verbindungen beteiligt sind (TJP1, DSC2 und CDH1), lässt sich bei der relativen Transkriptmenge von DSC2 ein nachteiliger Effekt der Vitrifikation auf die Embryonen feststellen.

Die Ergebnisse für die ausgewählten Gentranskripte, die bei der Etablierung der Trächtigkeit und bei der De-novo-Methylierung von Bedeutung sind, legen die Vermutung nahe, dass sich das Verfahren der konventionellen Kryokonservierung nachteilig auf die Expression dieser Transkripte und somit auch auf die Qualität des Embryos auswirkt.

Gentranskripte, deren Produkte am embryonalen Metabolismus beteiligt sind (SLC2A1 und SLC2A3), sind ebenfalls durch die Kryokonservierung beeinflusst. Das Transkript von SLC2A3 ist bei der Gruppe der konventionell kryokonservierten

Embryonen signifikant herabgesetzt, was eine unzureichende Versorgung des embryonalen Organismus zur Folge haben könnte.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Vitrifikation das zu präferierende Verfahren zur Kryokonservierung in vitro produzierter Embryonen, die aus einem SOF-Kultursystem stammen, darstellt. Um dieses abschließend zu bestätigen wären weitere Untersuchungen nötig, wie z.B.

Immunfloureszenzuntersuchungungen, die Untersuchung von Gentranskripten, die im Zusammenhang mit der Apoptose stehen, Transfers von kryokonservierten Embryonen auf Empfängertiere und Untersuchung der Trächtigkeitsraten und/oder die Untersuchung von Nachkommen aus zuvor kryokonservierten Embryonen.

Immunfloureszenzuntersuchungen könnten einen Aufschluss über das Verteilungsmuster von CDH1-Protein bei Embryonen beider Kryogruppen und deren Abweichungen von nicht kryokonservierten Embryonen geben. Dass ein Einfluss auf Transkripte von Zell-Zell-Verbindungsgenen vorhanden sein muss, ist in der vorliegenden Untersuchung der Expression von TJP1 und DSC2 zu sehen.

Auch Transfers wieder aufgetauter Embryonen sind sinnvoll, um zum einen Trächtigkeitsraten für die jeweilige Gruppe zu erheben und zum anderen, um zu überprüfen, ob die Kryokonservierung an sich Auswirkungen auf die Nachkommen hat. Hier wäre es denkbar, kryokonservierte in vivo gewonnene Embryonen zu untersuchen, um so einen „goldenen Standard“ auch für die Kryokonservierung zu etablieren.

Bei der Interpretation der Ergebnisse ist jedoch zu beachten, dass äußere Einflüsse wie z. B. das Medium, in dem in vitro produzierte Embryonen kultiviert werden, entscheidende Faktoren für die Qualität der Embryonen nach dem Auftauen darstellen. Die Medien, mit denen hohe Blastozystenraten in vitro erzeugt werden, sind nicht unbedingt dieselben, aus denen Embryonen mit einer erhöhten Kryotoleranz hervorgehen.

6. Zusammenfassung

Hanna Stinshoff

Vergleich in vitro produzierter Embryonen hinsichtlich ihrer Qualität nach dem Kryokonservieren durch Vitrifikation oder konventionelle Kryokonservierung Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss zweier Kryokonservierungsverfahren auf die Qualität in vitro produzierter Embryonen darzulegen. Hierzu wurden zunächst in 28 IVP-Sitzungen 3981 Eizellen gewonnen, aus denen an Tag sieben insgesamt 738 Blastozysten (18,5 %) generiert werden konnten. Die expandierten Blastozysten wurden entweder konventionell kryokonserviert (mit 1,5M Ethylenglycol als Kryoprotektivum) oder vitrifiziert (durch ein kommerziell erhältliches Vitrifikationskit der Fa. Gynemed, Lensahn). Nach dem Auftauen und anschließender Kultur für 48 Stunden wurden die Reexpansions- und Schlupfraten beurteilt. An einem Teil der geschlüpften Blastozysten wurde eine Differentialfärbung mit Ethidium homodimer und Hoechst 33342 zur Ermittlung der Gesamtzellzahl und der Lebend-Tot-Ratio durchgeführt. Der andere Teil der geschlüpften Embryonen wurde mittels einer RT-qPCR bezüglich der mRNA-Expression acht entwicklungsrelevanter Gene (SLC2A1, SLC2A3, DNMT3A, HSP70-1, CDH1, TJP1, DSC2 und IFNτ) untersucht.

Es konnten folgende Ergebnisse erzielt werden:

1. Die durchschnittliche Teilungsrate nach In-vitro-Produktion im SOF-Kultursystem betrug 52,8 % (n = 2056 / 3981). Die durchschnittliche Entwicklungsrate bis zur Blastozyste lag bei 18,5 % (n = 738 / 3981).

2. Die Reexpansionsrate der vitrifizierten Blastozysten (n = 106) betrug nach dem Auftauen 81,1 % (n = 86); die Schlupfrate der vitrifizierten Blastozysten lag bei 63,2

% (n = 67). Für die konventionell kryokonservierten Blastozysten (n=131) lagen diese Werte bei 79,4 % (Reexpansionsrate; n = 104) bzw. 63,2 % (Schlupfrate; n = 80).

3. Nach Zellfärbung durch Ethidium homodimer und Hoechst 33342 konnte eine Durchschnittszellzahl von 121,3 ± 21,2 für die zuvor vitrifizierten Blastozysten (n=22) ermittelt werden. Die Durchschnittszellzahl der konventionell kryokonservierten (n=23) Blastozysten lag bei 117,6 ± 20,4. Die Färbung und Auszählung der Zellen geschlüpfter Blastozysten (n = 25), die zuvor nicht kryokonserviert wurden, ergab eine Durchschnittszellzahl von 130,2 ± 25,6. Zwischen den beiden Einfriergruppen und der Kontrollgruppe gab es keine statistisch signifikanten Unterschiede bezüglich der Zellzahl. Bei der Auswertung der Lebend-Tod Ratio konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden.

4. Die Analyse der relativen Häufigkeit der Gentranskripte für SLC2A1, HSP70-1 Und TJP1 ergab, dass in Embryonen beider Kryokonservierungsgruppen signifikant weniger an relativer Transkriptmenge vorhanden war als in Embryonen der Kontrollgruppe mit geschlüpften Blastozysten, die zuvor nicht kryokonserviert worden waren. Zwischen den Embryonen beider Einfriergruppen gab es keine Signifikanzen bezüglich der Expression dieser drei Gentranskripte.

5. Die relative Transkriptmenge des SLC2A3- und des DNMT3A-Gens war bei den konventionell kryokonservierten Blastozysten im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant herabgesetzt. Die Gruppe der vitrifizierten Blastozysten unterschied sich weder signifikant von der Gruppe der konventionell kryokonservierten Blastozysten noch von der Kontrollgruppe.

6. IFNτ wurde von den Embryonen der Gruppe der konventionell kryokonservierten Blastozysten signifikant mehr exprimiert als von beiden anderen Gruppen.

7. Für das CDH1-Gen konnten weder zwischen den Embryonen der Einfriergruppen untereinander noch zur Kontrollgruppe signifikant Unterschiede in der Expression festgestellt werden.

8. Die Gruppe der zuvor vitrifizierten Blastozysten exprimierte signifikant weniger DSC2 als die Kontrollgruppe. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen der Gruppe der konventionell kryokonservierten Blastozysten und der Gruppe der vitrifizierten Blastozysten. Ebenso unterschied sich die Gruppe der konventionell kryokonservierten Blastozysten nicht signifikant von der Expression der Kontrollgruppe.

Erstmals wurde in dieser Arbeit ein direkter Vergleich auf molekularer Ebene zwischen Embryonen, die durch zwei Unterschiedliche Verfahren kryokonserviert wurden, gezogen.

Schlussfolgernd lässt sich festhalten, dass sich – obwohl auf morphologischer Ebene nicht erkennbar – die Vitrifikation besser für die Kryokonservierung von Tag sieben expandierten Blastozysten aus dem SOF-Kultursystem geeignet erscheint als die konventionelle Kryokonservierung. Die signifikanten Unterschiede in der Expression der einzelnen Gentranskripte weisen jedoch darauf hin, dass sich die quantitativen Unterschiede in Abhängigkeit zum untersuchten Gen darstellen. Um feststellen zu können, inwiefern diese auf molekulargenetischer Ebene gefundenen Unterschiede auch einen Einfluss auf die fetale und neonatale Entwicklung haben, wäre eine Untersuchung von Trächtigkeiten, die sich nach dem Transfer von kryokonservierter Embryonen etablieren und auch die Untersuchung so entstandener Kälber nötig.

7. Summary

Hanna Stinshoff

Effects of different cryopreservation techniques on the quality of in vitro produced bovine embryos

The objective of the present study was to analyse the influence of two different cryopreservation methods on the quality of in vitro produced bovine embryos. In 28 IVP-sessions 3981 oocytes could be obtained. These were cultured with the result that 738 blastocysts could be gained on day 7. Blastocysts that had reached the stage of an expanded blastocyst on day 7 were either cryopreserved conventionally (using 1.5 M ethylene glycol and a programmable freezer) or vitrified (using a commercially available kit, Gynemed, Lensahn, Germany). Reexpansion rates and hatching rates were assessed following thawing and culture for 48 hours. Cell staining was performed on one part of the hatched blastocysts using ethidium homodimer and Hoechst 33342 stain. The total cell number was assessed as well as the ratio of live and dead cells.

Other blastocysts that had hatched post thawing were analysed using a RT-qPCR regarding eight gene transcripts (SLC2A1, SLC2A3, DNMT3A, HSP70-1, CDH1, TJP1, DSC2 und IFNτ) that are known to be of developmental significance.

The following results could be obtained:

1. The average cleavage rate following in vitro maturation and fertilisation was 52.8 % (n = 2057 / 3981). The developmental rates up to blastocyst stage averaged at 18.5 % (n = 738).

2. 81.1 % (n = 86) of the previously vitrified blastocysts (n = 106) reexpanded after thawing, their hatching rate being at 63.2 % (n = 67). The blastocysts that were cryopreserved conventionally (n = 131) had a reexpansion rate of 79.4 % (n = 104)

3. The average cell number that could be obtained following cell staining was 121.3

± 21.2 for the blastocysts (n=22) previously vitrified. The blastocysts that were cryoconserved conventionally (n=23) prior to staining had an average cell number of 117.6 ± 20.4. Cell staining of the embryos belonging to the control group (n =25) averaged in 130.2 ± 25.6 cells per blastocyst. The assessment of live and dead cells resulted in no significant difference between all three groups.

4. The analysis of the gene transcripts for SLC2A1, HSP70-1 and TJP1 resulted in a significantly reduced amount of transcripts in both groups of cryopreserved embryos in comparison to the embryos that were not cryopreserved prior to culture until hatching. There was significant difference in the relative amount of transcript in between embryos of both cryopreservation groups.

5. The relative amount of transcripts for the genes of SLC2A3 and DNMT3A were significantly reduced – in comparison to the embryos belonging to the control group - in the group of blastocysts that were cryopreserved conventionally prior to analysis.

The relative amount of gene transcripts for these two genes did not differ significantly in vitrified blastocysts in comparison to embryos of both other groups.

6. IFNτ was expressed at a significantly higher level in the embryos that were cryopreserved conventionally than embryos of both other groups.

7. No significant differences in the expression of CDH1 could be detected between embryos of all three groups.

8. A significantly higher level of DSC2 transcripts could be detected in the vitrified blastocysts in comparison to the control blastocysts. There were no significant differences between the conventionally cryoconserved blastocysts and the embryos belonging to the control group as well as between the vitrified blastocysts and the blastocysts that were cryoconserved conventionally.

For the first time a comparison between embryos that were cryopreserved using two

For the first time a comparison between embryos that were cryopreserved using two