Die Ernährung von Embryonen bis zum Blastozystenstadium

Aus dem Institut für Tierernährung der Tierärztlichen Hochschule Hannover

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Die Ernährung von Embryonen bis zum Blastozystenstadium - eine Literaturstudie mit einem Vergleich der

In-vivo- / In-vitro- Bedingungen -

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Uta Seiwald

aus Leer

Hannover 2001

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. J. Kamphues

1. Gutachter: Prof. Dr. J. Kamphues

2. Gutachter: Prof. Dr. B. Meinecke

Tag der mündlichen Prüfung: 31.05.2001

Meiner Tochter Jana für ihre unendliche Geduld in Liebe

gewidmet

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG 9

2 ERLÄUTERUNG VON FACHBEGRIFFEN 10

3 ERNÄHRUNG DER EIZELLE BIS ZUR BLASTOZYSTE IN VIVO DURCH

DIE OVIDUKT- UND UTERUSFLÜSSIGKEIT 15

3.1 ZUSAMMENSETZUNG DER OVIDUKT- UND UTERUSFLÜSSIGKEIT 16

3.1.1 MILIEUBEDINGUNGEN 16

3.1.1.1 pH-Wert 16 3.1.1.2 Gaszusammensetzung 16 3.1.1.3 Osmolarität 16

3.1.2 ENERGIEQUELLEN/-SUBSTRATE 17

3.1.2.1 Kohlenhydrate 17 3.1.2.2 Eiweiß 17 3.1.2.3 Fette 18

3.1.3 MENGEN- UND SPURENELEMENTGEHALTE 18

3.2 VERGLEICH DER ZUSAMMENSETZUNG DER OVIDUKTFLÜSSIGKEIT MIT DER DES

SERUMS 24

4 ENTWICKLUNGS- UND ERNÄHRUNGSBEDINGUNGEN IN VITRO (VOM 1-ZELLER BIS ZUM BLASTOZYSTENSTADIUM) 25

4.1 IN-VITRO-KULTUR BEIM MENSCHEN 25

4.2 IN-VITRO-KULTUR BEIM TIER 26

4.2.1 ANZAHL VON EMBRYONEN IM KULTURMEDIUM 26 4.2.2 ZELLKULTUREN UND KONDITIONIERUNG DES KULTURMEDIUMS 28 4.2.3 MILIEUBEDINGUNGEN BEI DER IN VITRO KULTUR 30 4.2.3.1 Temperatur 30 4.2.3.2 Gaszusammensetzung, pH-Wert, Puffer 30 4.2.3.3 Osmolarität 33

4.2.4 ENERGIEQUELLEN/-SUBSTRATE 33

4.2.4.1 Kohlenhydrate 33 4.2.4.2 Glykosaminoglykane 38 4.2.4.3 Eiweiß 40

4.2.5 MENGENELEMENTE, SPURENELEMENTE SOWIE CHELATBILDNER 50

4.2.6 REGULATIV WIRKSAME INHALTSSTOFFE 51

4.2.6.1 Vitamine 51 4.2.6.2 Hormone / Wachstumsfaktoren / Interleukine 52 4.2.7 NEGATIVE EINFLÜSSE VERSCHIEDENER ZUSÄTZE AUF DEN

KULTURERFOLG 54

4.3 VERGLEICH VERSCHIEDENER MEDIEN BEI DER KULTIVIERUNG EINZELNER

SPEZIES 56

4.3.1 LABORTIERSPEZIES 56

4.3.2 NUTZTIERSPEZIES 57

5 AKTUELL VERWENDETE KULTURMEDIEN IN ART UND

ZUSAMMENSETZUNG FÜR VERSCHIEDENE SPEZIES 60

5.1 LABORTIERSPEZIES 60

5.2 NUTZTIERSPEZIES 66

6 DISKUSSION 74

6.1 ART DER GEWINNUNG VON INFORMATIONEN ZUM NÄHRSTOFFBEDARF VON

EMBRYONEN 74

6.2 ANSPRÜCHE JUNGER EMBRYONEN (ZYGOTE BIS 4-ZELLER) AN DAS MEDIUM 76 6.3 ANSPRÜCHE AB DEM 4-ZELLSTADIUM AN DAS MEDIUM 78

6.4 PERSPEKTIVEN 79

7 ZUSAMMENFASSUNG / SUMMARY 82

8 LITERATUR 86

9 ANHANG 96

9.1 STANDARDMEDIEN FÜR DIE IN-VITRO-KULTUR VON EMBRYONEN 96 9.2 STANDARD-AMINOSÄURENKONZENTRATIONEN FÜR DIE ZUGABE ZU IN VITRO-

KULTURMEDIEN 111

9.3 ZUSAMMENSETZUNG VON SEREN, WELCHE IN DER IN-VITRO-KULTUR VON

EMBRYONEN VERWENDET WERDEN 112

Verwendete Abkürzungen

BCM = Blastozyst-Conditioned Medium BECM = Beltsville Embryo Culture Medium bFGF = basic Fibroblast Growth Factor BO Medium = Brackett u. Oliphant Medium BOEC = Bovine Oviductal Epithel Cell

BMOC = Brinster’s Medium for Ovum Culture BRL = Buffalo Rat Liver

BSA = Bovine Serum Albumin CPP = Casein Phosphopeptide

CR 1 Medium = Charles Rosenkrans 1 Medium CZB Medium = Chatot Ziomek Bavister Medium DBS = Donor Bovine Serum

EBSS = Earle’s Balanced Salt Solution EGF = Epidermal Growth Factor FBS = Fetal Bovine Serum FCS = Fetal Calf Serum

FSH = Follicle Stimulating Hormone G1 = Gardner`s Medium

HA = Hyaluronsäure

HECM = Hamster Essential Culture Medium HTF = Human Tubal Fluid

ICM = Inner Cell Mass

IGF = Insulin Like Growth Factor LIF = Leukaemia Inhibitory Factor MCP = Menezo`s Culture Medium MEM = Minimal Essential Medium

Modifiz. M16 = Modifiziertes Whittingham`s Medium 16 Modifiz. WM = Modifiziertes Whitten`s Medium

MPM = Modifiziertes Parker-Medium mSOF = Modified Synthetic Oviductal Fluid NCSU 23 = North Carolina State University 23 OCS = Oestrous Cow Serum

PABA = Para-Aminobenzoic Acid PAF = Platelet Activating Factor PDGF = Platelet Derived Growth Factor PEF = Pig Fetal Endometrial Fibroblasts PFK = Phosphofruktokinase

POEC = Pig Oviductal Epithelial Cells

PMSG = Pregnant Mare Serum Gonadotropin PVA = Polyvinylalkohol

SOD = Superoxid Dismutase SOF = Synthetic Oviductal Fluid SOM = Simplex Optimized Medium

TALP = modifiziertes Tyrode’s Medium (Tyrode, Albumin, Lactate, Pyruvate)

TCM 199 = Tissue Culture Medium 199 ß-ME = ß-Mercaptoethanol

TGF-ß = Transforming Growth Factor ß

1 Einleitung

Unter natürlichen Bedingungen beginnt das Leben des Embryos im Eileiter, wo die ovulierte Eizelle von einem Spermium befruchtet wird. Unmittelbar danach finden die ersten Teilungen (Furchungen) statt, die über die verschiedenen Zellstadien zur Morula führen. Diese ballt sich zur kompaktierten Morula zusammen und entwickelt sich zur Blastozyste. Nach dem Schlupf dieser Blastozyste kommt es zur Einnistung (Implantation) in den Uterus. Bis zum Zeitpunkt der Implantation wird der Embryo über die Histiotrophe, also über die Ovidukt- und Uterusflüssigkeit, ernährt. Nach der Implantation kommt es zum Anschluss an den maternalen Blutkreislauf und hierüber zur weiteren Ernährung.

Die Versorgung des Embryos wird somit durch die des Muttertieres bestimmt. Bisher konnte man nur indirekt über eine optimale Fütterung des Muttertieres eingreifen.

Was der Embryo selbst für seine Entwicklung benötigt, wird nicht unmittelbar berücksichtigt. Dies liegt weitgehend außerhalb der Beeinflussung des Tierhalters.

Durch entsprechende Fortschritte in der Reproduktionsmedizin ist es mittlerweile möglich, Embryonen in vitro zu erzeugen und am Leben zu erhalten. Die Grundlagen diesbezüglicher Forschungen wurden schon sehr früh entwickelt. So berichtet NEW (1966) von Versuchen aus dem Jahr 1910, bei denen Eizellen kurzfristig in einer speziellen Salzlösung (Tyrodes saline) aufbewahrt und deren Lebensfähigkeit erhalten wurde. 1949 gelang es erstmalig, eine Eizelle der Maus bis zum Zweizellstadium zu kultivieren (NEW 1966).

Zu Beginn wurden hierfür Medien verwendet, die sich für die Kultur von somatischen Zellen bewährt hatten. Die Zusammensetzung der Medien wurde dann im Laufe der Zeit verändert. Es war nicht das Ziel, die Nährstoffansprüche zu bestimmen und die in vivo-Bedingungen zu simulieren, sondern die Kulturergebnisse zu verbessern. Erst in den letzten Jahren werden bei der Gestaltung der Nährmedien verstärkt die in-vivo- Bedingungen berücksichtigt, wie auch von LEESE (1998) empfohlen.

Heute ist man in der Lage, Embryonen durch die in vitro-Fertilisation (künstliche Befruchtung) zu gewinnen. Die noch unbefruchteten Eizellen werden mittels Follikelpunktion aus den Ovarien entnommen und in eine Petrischale gegeben. Damit die Eizellen befruchtungsfähig werden, müssen sie einen Prozess durchlaufen, der als Maturation (Reifung) bezeichnet wird. Erst danach wird der vorbereitete Samen hinzugegeben und es kommt zur Bildung der Zygote. Diese Zygote wird nun bis zum erwünschten Entwicklungsstadium bei festgelegter Temperatur und Gaszusammen- setzung kultiviert.

Bei einer solchen Entwicklung außerhalb des Muttertieres greift man nun erstmals direkt und gezielt in die Ernährung der Embryonen ein. Experimentelle und analytische Untersuchungen an und mit der Ovidukt- und Uterusflüssigkeit in vivo sowie dem Kulturmedium können so möglicherweise Aufschluss über die Ernährungsbedingungen und die Ansprüche des Embryos in der ersten Phase der Individualentwicklung geben. Die in-vitro-Kultur erlaubt jedoch nur bedingt Rückschlüsse auf die in-vivo Bedingungen, da es sich hierbei um ein geschlossenes System handelt und z.B. kein Abtransport der Stoffwechselprodukte oder eine Neuzufuhr von Stoffen durch Sekretion stattfindet. In vivo laufen zusätzlich Prozesse wie Absorption, Flüssigkeitsströme und Peristaltik ab.

Ziel dieser Arbeit ist es, anhand einer retrospektiven Literaturstudie Aussagen zur Bedeutung, eventuell sogar Essentialität verschiedener Nährstoffe im Sinne der Tierernährung für die sich entwickelnden Embryonen zu treffen, und zwar fokussiert auf die Entwicklungsstufen von der befruchteten Eizelle bis hin zur Blastozyste.

2 Erläuterung von Fachbegriffen

In der Reproduktionsmedizin ist ein großer Fortschritt festzustellen. Erst kürzlich berichteten die Medien über die vollständige Kartographierung des menschlichen Genoms. Ebenso entwickelte sich der Embryotransfer bereits zum Standardverfahren in der modernen Tierzucht, mit dem viele Besitzer züchterisch wertvoller Tiere täglich konfrontiert sind.

Beim Embryotransfer werden jedoch meist erst Blastozystenstadien gewonnen, die mittels eines Spülmediums aus der Gebärmutter ausgeschwemmt werden. Dieses Spülmedium dient aber nur der kurzfristigen Aufbewahrung der Embryonen, es findet keine Weiterentwicklung statt. Meist wird Dulbecco`s Phosphate Bufferd Salines verwendet (Tab.1). Das Spülmedium ist allerdings nicht in der Lage, einen Embryo längerfristig am Leben zu erhalten. Die Embryonen werden entweder direkt auf das Empfängertier übertragen oder durch Tiefgefrierung konserviert.

Tabelle 1: Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline (Angaben in mg/l;

BIOWHITTAKER 1999)

ohne Ca und Mg mit Ca und Mg

NaCl 8000 8000

KCl 200 200

CaCl2 - 100

KH2PO4 200 200

MgCl2 x 6 H2O - 100

Na2HPO4 x 7 H2O 2160 2160

Um jüngere Entwicklungsstadien zu gewinnen, wird die in-vitro-Fertilisation angewandt:

Die Eizellen werden mittels Follikelpunktion aus den Ovarien gewonnen und in Petrischalen gegeben. Nicht intakte Eizellen werden mit Hilfe eines Lichtmikroskopes ausselektiert. Vor der Befruchtung werden die Eizellen für etwa einen Tag zur Reifung (Maturation) inkubiert. Nach der Befruchtung erfolgt eine weitere Kultivierung bis zum erwünschten Entwicklungsstadium in kleinen Petrischalen. Die Embryonen liegen frei in einem flüssigen Kulturmedium. Zum Schutz vor Austrocknung und Sauerstoff wird dieses Medium mit Öl (zumeist Paraffinöl) überschichtet. Die Inkubation erfolgt in einem Brutschrank bei festgelegter Temperatur und Gaszusammensetzung.

Die so gewonnenen Embryonen werden z.B. auf ein Empfängertier transferiert, eingefroren oder es finden weitergehende Untersuchungen an den Embryonen statt (KRÄUSSLICH und BREM 1997; Abb. 1).

Abbildung 1: Gewinnung von Embryonen (KRÄUSSLICH und BREM 1997)

Die Entwicklung der befruchteten Eizelle verläuft über verschiedene Zellteilungen bis hin zur Morula, die aus den außen liegenden Blastomeren und der inneren Zellmasse besteht (RÜSSE und SINOWATZ 1991; Abb. 2). Diese ballt sich zusammen und wird somit zur kompaktierten Morula. Die sich hieraus entwickelnde Blastozyste schlüpft aus ihrer Zona pellucida und kann sich in den Uterus einnisten (Implantation).

Bei der Kultur von Embryonen kann man sich somatische Zellen zu Nutze machen.

Durch eine Kokultur, das heißt gleichzeitige Kultur von Embryonen mit Körperzellen, werden hilfreiche Faktoren (z.B. Wachstumshormone) in das Medium abgegeben.

Zusätzlich werden „embryotoxische“ Stoffe (wie z.B. Stoffwechselprodukte, Sauerstoffradikale, Glukose) entfernt und die Sauerstoffspannung niedrig gehalten.

Es ist jedoch auch möglich, ein Medium zu konditionieren. Dabei werden einem Medium Zellen wie bei einer Kokultur zugegeben, welche hilfreiche Faktoren in das Medium sezernieren (wie z.B. Wachstumsfaktoren). Im Unterschied zur Kokultur werden diese Zellen vor dem Zusetzen der Embryonen aber wieder entfernt. Das auf diese Art vorbereitete, d.h. konditionierte Medium hat den Vorteil, dass es sterilisiert und das Risiko einer Infektion (Bakterien, Viren) minimiert werden kann.

1)Kompaktierte Morula 2)Schlüpfende Blastozyste

Abbildung 2: Entwicklungsstadien der Embryonen (GORDON 1994)

1)

2)

Um den Erfolg einer Kultur von Embryonen zu beurteilen, sind unterschiedliche Parameter gebräuchlich: So unterscheidet NIEMANN (1989) verschiedene Qualitätsgrade der Embryonen (Übersicht 1).

Übersicht 1: Beurteilung der Qualität von Rinderembryonen (NIEMANN 1989)

Qualität 1: Sehr gute Embryonen; dem Entwicklungsstand entsprechend, mit normaler Morphologie

Qualität 2: Gute Embryonen; dem Entwicklungsstand entsprechend, mit geringfügigen Abweichungen in der morphologischen Beschaffenheit, z.B. kleine Schäden der Zona pellucida, ausgeschleuste Blastomeren, vergrößerter perivitelliner Raum Qualität 3: Degenerierte Embryonen; dem erwarteten Entwicklungsstand

entsprechend, jedoch mit stärkerer Abweichung in der Morphologie.

Retardierte Embryonen; dem Entwicklungsstand nicht entsprechend.

Qualität 4: Unbefruchtete Eizellen

Anderen Wissenschaftlern , z.B. DOBRINSKY et al. (1996) und STOJKOVIC et al.

(1999), geht es bei der Beurteilung des Erfolges einer Kultivierung vor allem um den Prozentsatz an Embryonen, die sich über ein bestimmtes Teilungsstadium hinaus entwickeln. Hierbei ist vor allem interessant, wie viele Embryonen das sogenannte

„Blockstadium“ überwinden.

Bei dieser „Blockierung“ kommt es zum Stillstand in der Entwicklung, und zwar meist aufgrund nicht-optimaler Umweltbedingungen. Die Blöcke können reversibel sein.

Durch Veränderung und Optimierung des Mediums kann es dann zur Weiterentwicklung kommen. Geht jedoch die Vitalität verloren, ist der Block irreversibel. Somit können diese Entwicklungshemmungen Hinweise auf nicht optimale Kulturbedingungen geben. Die Stadien, in denen solche Blöcke vor allem auftreten, sind tierartspezifisch. So weist z.B. der Hamster besonders häufig im 2-, 4- und 8-Zellstadium eine Entwicklungshemmung auf, da er in dieser Phase sehr sensibel gegenüber äußeren Einflüssen ist. Im Unterschied zum Hamster ist die empfindliche Phase beim Schaf vor allem das 8- bis 16-Zellstadium (BAVISTER 1988).

Die Stadien, in denen derartige Blöcke auftreten, stehen auch im Zusammenhang mit der Aktivierung des embryonalen Genoms (Beginn eigener RNA-Synthese).

Außerdem kommen sie bei den meisten Spezies gehäuft zu dem Zeitpunkt vor, in dem die Embryonen normalerweise vom Eileiter in den Uterus wechseln (BAVISTER 1988).

3 Ernährung der Eizelle bis zur Blastozyste in vivo durch die Ovidukt- und Uterusflüssigkeit

Die Ovulation erfolgt nach RÜSSE und SINOWATZ (1991) im Metoestrus, der Zyklusphase zwischen dem Ende der Brunst und dem Beginn der Gelbkörperphase.

In dieser Zeit werden die Follikelzellen in Luteinzellen umgewandelt, die mit der Progesteronproduktion beginnen. Die Zeit von der Ovulation bis zum Beginn der Progesteronsekretion dauert beim Rind drei Tage. Unter dem Einfluss des Progesterons sezernieren die Uterindrüsen die sogenannte Uterinmilch (RÜSSE und SINOWATZ 1991), welche zusammen mit den beim Abbau der Uterusschleimhaut zugrunde gehenden Gewebeteilen und Blutextravasaten die Histiotrophe bildet, die den Embryo ernährt (MICHEL 1995). Bis zu dem Zeitpunkt der Implantation und Plazentation wird der Embryo also über die Ovidukt- und Uterusflüssigkeit ernährt.

In den Tabellen 2 und 3 sind die embryonalen Entwicklungsstadien verschiedener Spezies bezüglich ihrer Entwicklungsdauer dargestellt.

Tabelle 2 : Entwicklungsstadien von Nutztieren (RÜSSE und SINOWATZ 1991) Tage

p.c. Entwicklungsstadium

Rind Schaf Schwein Pferd

1 1-Z¹⁾ 1-Z 1- bis 2-Z

2 2-Z 2-Z /bis 39 Std 4-Z /bis 42 Std

1- bis 2-Z /bis 41 Std.

2- bis 4-Z /bis 48 Std.

4-Z 3 6- bis 8-Z 8 bis 16-Z 4 bis 8-Z 5-Z

4 8-Z 16-Z, M 8 bis 16-Z 12 bis 32-Z

5 16-Z M, Bl.⁴⁾ M, Bl. M, Bl.

6 32-Z, M²⁾ dito M, Bl. Bl.

7 Komp. M³⁾ dito Bl.-Schlupf 8 Blastozyste Bl.-Schlupf

9 Bl.-Schlupf⁵⁾

11 Impl.-Beginn

15 Impl.-Beginn⁶⁾ 19 Implantation

37 Implantation

1) Z = Zellstadium

2) M = Morula

3) Komp. M = Kompaktierte Morula

4) Bl. = Blastozyste

5) Bl.-Schlupf = Blastozystenschlupf

6) Impl.-Beginn = Implantationsbeginn

im Ovidukt im Uterus

Tabelle 3: Entwicklungsstadien von Labortieren (NEW 1966, DANIEL 1971) Entwicklungsstadium Entwicklungszeit Maus ¹⁾ Entwicklungszeit Ratte ²⁾

1-Zeller 0-1 Tage 1,5 Tage

2-Zeller 1-1,5 Tage 2,5 Tage

3-4-Zeller 2-2,5 Tage

4-Zeller 3,5 Tage

5-8-Zeller 2-3 Tage

8-12-Zeller 3,5-4 Tage

Morula 3-3,5 Tage 4 Tage

Blastozyste 3,5-4 Tage 4,5 Tage

1) NEW (1966) 2) DANIEL (1971)

im Ovidukt im Uterus

3.1 Zusammensetzung der Ovidukt- und Uterusflüssigkeit

Der Embryo entwickelt sich von der Zygote zur Blastozyste und wird in dieser Zeit über die Ovidukt- und Uterusflüssigkeit ernährt. Erst mit der Implantation und dem Anschluss an den maternalen Kreislauf kommt es hierüber zur weiteren Ernährung.

Aus diesem Grund ist die Zusammensetzung der Ovidukt- bzw. Uterusflüssigkeit von Interesse, da die Verhältnisse in vivo als optimal angesehen werden müssen. Die zusammengetragenen Werte verschiedener Autoren, die auch im folgenden Text erwähnt werden, sind in Tabelle 4 aufgeführt.

3.1.1 Milieubedingungen 3.1.1.1 pH-Wert

Der pH-Wert in der Ovidukt- und Uterusflüssigkeit lässt sich in vivo schlecht messen, da es schon bei der Gewinnung zu Verschiebungen des pH-Wertes kommt (STEVENS et al. 1964; IRITANI et al. 1969). Damit lassen sich auch die enormen Bandbreiten der Angaben zum pH-Wert in der Uterusflüssigkeit des Rindes von 5,8-7,1 erklären (Tab. 4).

3.1.1.2 Gaszusammensetzung

Der gemessene Sauerstoffpartialdruck in der Ovidukt- und Uterusflüssigkeit beträgt durchschnittlich 40-45 mm Hg (FISCHER und BAVISTER 1993; Tab. 4). Er ist also deutlich geringer als die atmosphärische Sauerstoffspannung.

3.1.1.3 Osmolarität

Der osmotische Druck in der Eileiterflüssigkeit kann mehr als 360 mosmol betragen und ist damit höher als in jedem Kulturmedium (GARDNER 1998). Durchschnittlich findet man jedoch beim Rind Werte um 350 mosmol (IRITANI et al. 1971; NICHOL et al. 1992).

3.1.2 Energiequellen/-substrate 3.1.2.1 Kohlenhydrate

Die gemessenen Glukosegehalte in der Eileiterflüssigkeit sind bei den verschiedenen Tierarten sehr unterschiedlich. Das Rind hat mit 10-16 mg/l die niedrigsten Werte der

hier behandelten Tierspezies. Darauf folgt das Schwein mit Gehalten von 27-180 mg/l. Das Kaninchen und Schaf befinden sich mit ihren gemessenen

Glukosewerten von durchschnittlich 100-430 mg/l im mittleren Bereich verglichen mit den anderen Tieren. Bei der Maus sind mit Werten um 500 mg/l in der Oviduktflüssigkeit die höchsten Glukosekonzentrationen festzustellen. Auffällig ist, dass der Glukosegehalt im Plasma bei allen Tierarten deutlich höher ist als in der Oviduktflüssigkeit (z.B. Rind 144 mg/l, Schwein 785-878 mg/l).

Über die Glukose- und Laktatgehalte in der Uterusflüssigkeit gibt es nur vom Schwein und Kaninchen einige Literaturangaben. Interessanterweise ist hier die festgestellte Glukosekonzentration des Schweines deutlich höher als in der Oviduktflüssigkeit. Im Gegensatz dazu ist der Gehalt beim Kaninchen in der Uterusflüssigkeit sehr viel niedriger (Tab. 4).

Die Konzentration des Laktates unterliegt den Angaben zufolge in der Oviduktflüssigkeit vom Schaf und Schwein -ähnlich wie die Glukose- großen Schwankungen, die von 140 mg/l bis hin zu 700 mg/l reichen. Die gemessenen Werte der Maus (400-450 mg/l) befinden sich auch innerhalb dieser Grenzen, weisen aber nicht so große Konzentrationsunterschiede auf. Das Kaninchen hat mit 1000 mg/l den höchsten Laktatgehalt, der aber in der Uterusflüssigkeit wiederum deutlich niedriger ist (Tab. 4). Beim Schwein differieren die durchschnittlichen Laktatgehalte in der Uterus- und Oviduktflüssigkeit nicht ganz so stark.

Zum Pyruvat lassen sich nur für die Maus und das Schwein Angaben machen (ca.

32 mg/l bzw. 18 mg/l). Diese Werte sind jedoch deutlich geringer als die vom Laktat.

3.1.2.2 Eiweiß -Proteine

Der festgestellte durchschnittliche Proteingehalt ist in der Eileiterflüssigkeit vom Schwein im Vergleich zu den anderen Tierarten mit 9-17 g/l am niedrigsten. Der Gehalt beträgt jedoch in der Uterusflüssigkeit mehr als das Doppelte. Die Proteinwerte des Kaninchens sind in der Oviduktflüssigkeit (30-44 g/l) deutlich höher als beim Schwein, im Uterus aber wieder niedriger (16-28 g/l). Die Angaben zum Proteingehalt in der Eileiter- als auch in der Uterusflüssigkeit (1-52 und 10-122 g/l) des Rindes zeigen erhebliche Unterschiede in der Konzentration, was eventuell methodisch bedingt ist.

-Aminosäuren

Die gemessenen Werte der Aminosäuren variieren sehr stark. So schwanken die Angaben zum Aspartatgehalt in der Oviduktflüssigkeit des Schweines von 3 mg/l bis 76 mg/l und des Kaninchens von 3 mg/l bis 71 mg/l.

Glycin kommt in der Ovidukt- und Uterusflüssigkeit bei allen Tierarten in hohen Konzentrationen vor (durchschnittlich 100 mg/l und mehr).

Glutamin bzw. Glutamat ist im Vergleich zu den anderen Aminosäuren bei allen Tierarten in hohen Konzentrationen zu finden (Tab.4); diese Aminosäure erwies sich auch in der Kultur als sehr hilfreich.

Die Konzentrationen von Prolin differieren je nach Autor erheblich. Die gemessenen Prolingehalte in der Oviduktflüssigkeit vom Schwein schwanken von 0 mg/l bis 138 mg/l.

Die höchsten Aminosäurenwerte in der Oviduktflüssigkeit des Schafes sind im Gegensatz zu den anderen Tierspezies beim Glycin (60-280 mg/l) und interessanterweise beim Phenylalanin (6-280 mg/l) gemessen worden.

Die vorherrschenden Aminosäuren in der Ovidukt- sowie Uterusflüssigkeit des Schweines sind vor allem Alanin, Glycin, Leucin, Lysin und Prolin. Das Kaninchen besitzt ähnliche Aminosäurenverhältnisse. Hier wurden aber nur niedrige Prolingehalte gefunden. Man konnte jedoch in der Ovidukt- und in der Uterusflüssigkeit hohe Serin- und Threoningehalte feststellen.

Eine Ausnahme ist das Rind, da hier ein deutlicher Anstieg der Aminosäurengehalte vom Ovidukt zum Uterus hin gemessen wurde und die Gehalte im Durchschnitt deutlich höher als bei den anderen Tierarten sind (Werte über 100 mg/l; Tab. 4). Ob hierfür methodische Gründe vorliegen, bleibt zu vermuten.

3.1.2.3 Fette

Fette scheinen, wenn überhaupt messbar, nur in geringen Konzentrationen in der Eileiter- und Uterusflüssigkeit vorzukommen. Lediglich beim Rind wurden Messungen vorgenommen, wobei hier in der Uterusflüssigkeit nur 0,01 mg/l Fett vorhanden war.

3.1.3 Mengen- und Spurenelementgehalte

Natrium und Kalium sind die wichtigsten Osmoregulatoren in der Ovidukt- und Uterusflüssigkeit.

Die Oviduktflüssigkeit des Rindes wies in Untersuchungen deutlich niedrigere Na-Konzentrationen (2080-2160 mg/l) als die des Uterus (2200-2770 mg/l) auf, obwohl im Plasma deutlich höhere Na-Konzentrationen (ca. 3100-3600 mg/l) üblich sind. In der Oviduktflüssigkeit von Schweinen und Kaninchen wurden durchschnittlich höhere Werte als beim Rind gemessen (2910-3390 mg/l und 2720-2950 mg/l), die auch ähnlich mit denen in der Uterusflüssigkeit sind (2210-2890 mg/l und 2740-3570 mg/l; Tab. 4).

Chlorid ist den Angaben zufolge sowohl in der Uterus- als auch in der Oviduktflüssigkeit des Schweines und des Kaninchens in sehr hohen Konzentrationen vorhanden (um 4000 mg/l). Das Rind zeigt hier wesentlich niedrigere Gehalte (max.

400 mg/l).

Beim tierartlichen Vergleich hat das Rind in der Ovidukt- und Uterusflüssigkeit die höchsten gemessenen Kalium-Werte von durchschnittlich 1730 mg/l, beim Schwein ist die K-Konzentration deutlich geringer (390-800 mg/l). Das Kaninchen jedoch weist die geringsten Gehalte (190-360 mg/l) auf. Auffällig sind die deutlich höheren Konzentrationen gegenüber denen, die im Serum üblich sind (z.B. Schwein: 156-196 mg/l).

Magnesium ist in der Ovidukt- sowie Uterusflüssigkeit nur in geringen Konzentrationen festzustellen. In der Uterusflüssigkeit sind durchschnittlich etwas höhere Werte als in der Oviduktflüssigkeit vorhanden (z.B. beim Kaninchen 2,2-2,6 im Vergleich zu 1,7-2,5 mg/l).

Phosphor ist in den Flüssigkeiten des Reproduktionstraktes von allen Tierarten zu finden, wobei die angegebenen Gehalte in der Eileiterflüssigkeit durchschnittlich niedriger als in der Uterusflüssigkeit sind. Das Rind bildet jedoch eine Ausnahme. Hier verhält es sich genau entgegengesetzt. Bei keiner Tierart liegen die Werte jedoch über 100 mg/l, allgemein sind Konzentrationen von 23-94 mg/l zu beobachten.

Ta

belle 4

Von der Maus ließen sich nur Angaben zu Kohlenhydraten und Eiweiß der Oviduktflüssigkeit finden (Tab. 5).

Tabelle 5: Nährstoffgehalte in der Oviduktflüssigkeit der Maus (Angaben in mg/l, außer Protein in g/l; GARDNER und LEESE 1990)

Glukose 586,8-637,2

Pyruvat 29,58-34,8

Laktat 397,83-454,79

Protein 9-12,8

Glutamin 23,36-35,04

Glutaminsäure 52,56-84,68 Besondere Werte:

Die Follikelflüssigkeit enthält beim Rind laut KANO et al. (1998) verschiedene Glykosaminoglykane, wie z.B. Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat, welche von den Cumulus- und Granulosazellen nach gonadotroper Stimulation sezerniert werden. Die Proteoglykane Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat sind auch in der Eileiter- und Uterusflüssigkeit vorhanden (Tab. 6).

Tabelle 6: Glykosaminoglykankonzentrationen in der Ovidukt- und Uterus- flüssigkeit des Rindes (alle Angaben in mg/ml; KANO et al. 1998)

Ovidukt Uterus Proteinkonzentration 1,2-52,0 10,0-18,6 Glykosaminoglykankonzentration 0,1-4,7 2,0-3,7

Hyaluronsäure 0,04-1,83 0,32-0,59

Chondroitinsulfat 0,01-0,56 0,38-0,70

3.2 Vergleich der Zusammensetzung der Oviduktflüssigkeit mit der des Serums

Die angegebenen Glukosekonzentrationen in der Eileiterflüssigkeit sind im Vergleich zum Blutserum sehr gering (Tab. 7). Im Unterschied dazu sind die Laktatwerte in der Oviduktflüssigkeit höher.

Der durchschnittliche Proteingehalt der Eileiterflüssigkeit ist interessanterweise deutlich unterhalb des Durchschnittsgehaltes vom Serum, obwohl Eiweiß für den jungen Embryo sehr wichtig sein soll (Tab. 7).

Die Flüssigkeit des Eileiters unterscheidet sich laut BAVISTER (1988) auch in der ionischen Zusammensetzung von Blutseren, vor allem durch den höheren Kalium- und reduzierten Natriumgehalt (Tab. 7). So sind in der Oviduktflüssigkeit des Rindes

durchschnittlich 2120 mg Natrium/l gemessen worden. Deutlich höhere Na-Konzentrationen zeigt das Serum des Rindes (~3360 mg/l). Der Kaliumgehalt

beträgt in der Eileiterflüssigkeit ca. 1720 mg/l, im Gegensatz zu den Gehalten im Serum mit lediglich 160 mg/l.

Interessanterweise sind die Phosphatgehalte in der Oviduktflüssigkeit des Rindes höher als im Serum, obwohl sich Phosphate in der Kultur junger Embryonen als negativ erwiesen haben.

Tabelle 7: Nährstoffzusammensetzung der Oviduktflüssigkeit und des Blutserums von Rind und Schwein (alle Angaben in mg/l, außer Protein in g/l)

(1) CARLSON et al. 1970 (2) OLDS und VAN DEMARK 1957 (3) KANO et al. 1998 (4) TORNESI et al. 1993 (5) KRAFT und DÜRR 1995 (6) BICKHARDT 1992

(7) NICHOL et al. 1992 (8) IRITANI et al. 1974 (9) IRITANI et al. 1971 (10) LAMOTHE und GUAY 1970

Rind Schwein

Ovidukt Serum Ovidukt Serum

Glukose 10-15 ⁽¹⁾ 144 ⁽⁴⁾ 27-180 ^(7,8) 785-878 ⁽⁵⁾ Laktat 45-267 ⁽⁶⁾ 190-670 ^(7,8) 268-350 ⁽⁵⁾

Pyruvat 15-23 ⁽⁷⁾ 9-10 ⁽⁵⁾

Protein 1,2-52 ^(2,3) 50-80 ⁽⁵⁾ 9-17 ⁽⁸⁾ bis 86 ⁽⁵⁾

Triglyceride 150-450 ⁽⁵⁾ bis 440 ⁽⁵⁾

Na 2080-2160 ⁽²⁾ 3105-3611 ⁽⁵⁾ 2906-3390 ⁽⁸⁾ 3220-3680 ⁽⁵⁾ Cl 400 (NaCl) ⁽²⁾ 3191-3900 ⁽⁵⁾ 3342-4286 ⁽⁸⁾ 3616-3758 ⁽⁵⁾ Ca 102-125 ⁽²⁾ 88-116 ⁽⁵⁾ 64-148 ⁽⁸⁾ 96-120 ⁽⁵⁾ K 1180-2250 ⁽²⁾ 137-176 ⁽⁵⁾ 390-582 ⁽⁸⁾ 156-196 ⁽⁵⁾ Mg 33,8 ⁽¹⁰⁾ 19-29 ⁽⁵⁾ 4-8 ⁽⁸⁾ 12-32 ⁽⁵⁾

P 97 ⁽²⁾ 50-71 ⁽⁵⁾ 23-40 ⁽⁹⁾ 65-102 ⁽⁵⁾

4 Entwicklungs- und Ernährungsbedingungen in vitro (vom 1-Zeller bis zum Blastozystenstadium)

4.1 In-vitro-Kultur beim Menschen

Den höchsten Wissensstand über die in-vitro-Kultur von Embryonen findet man beim Menschen. Aus diesem Grunde wird an dieser Stelle zusammenfassend der diesbezügliche Kenntnisstand dargestellt.

Doch auch hier ist laut CONAGHAN et al. (1998) das Wissen über den Bedarf für die Kultur von frühen Teilungs- zu Blastozystenstadien noch lückenhaft.

Bei Verwendung komplexer Medien wie z.B. HAM`s F10 oder MEM, welche für die Kultur von somatischen Zellen entwickelt wurden, sind „mehr“ Inhaltsstoffe enthalten als für eine optimale Entwicklung der Embryonen nötig. Sie stehen damit im Gegensatz zu den einfachen Medien (ausgeglichene Salzlösungen wie EBSS- Medium), welche zu „wenig“ Nährstoffe enthalten sollen (CONAGHAN et al., 1998;

GARDNER und LANE 1998).

Als Energiequellen werden zum einen Kohlenhydrate und zum anderen Aminosäuren verwendet. Die Embryonen der verschiedenen Zellstadien bevorzugen Pyruvat als Kohlenhydratquelle. Glukose gewinnt erst im Blastozystenstadium an Bedeutung. Sie kann bis dahin nicht oxidiert werden und wirkt sich negativ auf die Entwicklung aus.

Bei Supplementation von Aminosäuren oder EDTA zum Medium wird jedoch die glykolytische Aktivität in den frühen Embryonen gehemmt. Dadurch können die negativen Effekte von Glukose ausglichen werden (GARDNER und LANE 1998).

Ab dem Blastozystenstadium kann der Embryo Glukose oxidativ oder glykolytisch als Energiequelle nutzen (GARDNER und LANE 1998).

Der Bedarf an Aminosäuren verändert sich laut GARDNER und LANE (1998) ebenfalls mit dem Alter des Embryonen. Bis zum Morulastadium reicht es aus, wenn im Kulturmedium die „nicht-essentiellen“ Aminosäuren (Alanin, Glutamat, Glutamin, Glycin, Prolin und Serin) vorhanden sind. Diese Aminosäuren werden von den Trophoektodermzellen genutzt.

Ab dem Morulastadium gewinnen die „essentiellen“ Aminosäuren an Bedeutung, welche für die Bildung der ICM (Inner Cell Mass) benötigt werden (GARDNER und LANE 1998).

Nach CONAGHAN et al. (1998) ist HTF (human tubal fluid) eines der ersten Medien, welches speziell für die Kultur von humanen Embryonen entwickelt wurde. Dieses Medium sowie das T6- und EBSS (Earle`s balanced salt solution)-Medium werden zur Zeit weitgehend für die Kultur von humanen Embryonen benutzt.

Zur Vermeidung bakterieller Infektionen bzw. einer Vermehrung von Mikroorganismen währung der Kultivierung werden in der Regel Antibiotika wie Penicillin und Streptomycin sowie Phenolrot zugegeben.

Tabelle 8: Aktuell verwendete Zusammensetzung der Kulturmedien¹⁾ für die in-vitro Kultur von Menschenembryonen (alle Angaben in mg/l, sofern nicht angegeben; CONAGHAN et al. 1998; LEESE 1998; QUINN et al. 1985)

Glukose 500,4-1000,8

Laktat 1904,6-2344,3

Pyruvat 26,1-40,89

BSA 0-4000

NaCl 5814,9-6844,5

KCl 105,96-402,84

CaCl2 x 2 H2O 261,66-299,88 MgSO4 x 7 H2O 49,26-174,87 PO4

3- 50,32-138

NaHCO3 1848-2100

Penicillin U/ml 100-133

Streptomycin µg/ml 0-50

Phenolrot 10

1) T6, HTF und EBSS

4.2 In-vitro-Kultur beim Tier

Bei der in-vitro-Kultur von Tieren liegen vor allem über Hamsterembryonen die meisten Erkenntnisse vor, die auch als gesichert angesehen werden können. Neuere wissenschaftliche Untersuchungen beschäftigen sich auch intensiv mit der Spezies Rind, wie in den aktuellen Ausgaben der Zeitschrift Theriogenology ersichtlich. In diesem Kapitel wird zunächst auf die begleitenden Faktoren der Kultur eingegangen, da sie ebenfalls einen Einfluss auf den Kulturerfolg nehmen.

4.2.1 Anzahl von Embryonen im Kulturmedium

Laut PALASZ und THUNDATHIL (1998) sowie GORDON (1994) hat die Anzahl der Embryonen, die pro Volumen Medium kultiviert werden, Effekte auf deren Entwicklung. Der Prozentsatz an lebenden Embryonen war deutlich geringer, wenn sie einzeln kultiviert wurden, als wenn dies in Gruppen geschah (Tab. 9 und 10).

Tabelle 9: Überlebensrate von Mäuseembryonen in Abhängigkeit von der Zahl der Embryonen im Medium (GORDON 1994)

Anzahl Embronen in 50 µl Medium

Überlebensrate [%]

1 38,7

10 65,6

20 61,8

Tabelle 10: Kultivierungserfolg bei Rinderembryonen in Abhängigkeit von der Anzahl an Oozyten im Kulturmedium (n≈130; PALASZ und THUNDATHIL 1998)

Anzahl Oozyten pro 10 µl Kulturmedium

M¹⁾ [%]

B²⁾ [%]

5 39 11

10 44 10

20 75 60

1) M= Prozentsatz an Oozyten, die das Morulastadium erreichten

2) B= Prozentsatz an Oozyten, die bei einer weiteren Kultur das Blastozystenstadium erreichten

Eine Kultivierung von Mäuse- und Rinderembryonen in reduzierten Volumina u./o. in Gruppen führte auch nach AHERN und GARDNER (1998) zu einem höheren Prozentsatz an Embryonen, die sich zu Blastozysten entwickelten, und der ICM- (inner cell mass) Zellzahl (Tab. 11). Die Reduktion des Inkubierungsvolumens zur Embryonenrate führt zudem bei Mäuseembryonen nach GORDON (1994) zu einer höheren Überlebensrate. Die optimale Relation soll bei fünf Embryonen pro 10 µl Medium liegen.

Tabelle 11: Einfluss der Anzahl an Mäuseembryonen im Medium auf den Kultivierungserfolg (AHERN und GARDNER 1998)

Anzahl Embryonen pro 50 µl Kulturmedium

B¹⁾ [%]

IZ²⁾ [n]

1 45,8 15,6 + 1,8

2 55,2 37,1 + 3,3

3 71,8 43,6 + 4,3

n = 56 Embryonen pro Versuch

1)B = Prozentsatz von Embryonen, die nach 72 Stunden Kultur das Blastozystenstadium erreichten

2)IZ = ICM-Zellzahl der entstandenen Blastozysten

Dadurch lässt sich auch erklären, weshalb eine Kokultur mit Mäuseembryonen die Entwicklung von Rinderembryonen steigert. Parakrine Faktoren, die von den Embryonen sezerniert werden, sollen sich hier eher förderlich als hemmend auswirken (GORDON 1994). Der Autor äußert sich leider nicht über die Art der Faktoren, die hier günstig wirken sollen.

4.2.2 Zellkulturen und Konditionierung des Kulturmediums

Nach GORDON (1994) können sehr verschiedene Zelltypen erfolgreich zur Kokultur verwendet werden, da die Bildung embryotropher Faktoren (wie z.B. Wachstums- hormone) weder an die Tierart noch an ein bestimmtes Organ gebunden ist. Diese Zellen binden außerdem toxische Faktoren (wie z.B. Stoffwechselprodukte, Schwermetalle), die im Medium vorhanden sein können oder vom Embryo selbst produziert werden. Kokulturzellen sind hilfreich, um die Konzentrationen an Na⁺, K⁺, Cl^-, Mg²⁺, Ca²⁺ oder Glukose niedrig zu halten, was zu einer besseren Entwicklung von Embryonen führen kann. Durch den Verbrauch von Sauerstoff schützen die Zellen den Embryo zusätzlich vor Sauerstoffradikalen (GORDON 1994).

So können sich Rinderembryonen gemäß GORDON (1994) erfolgreich in einem Kokultursystem mit Fibroblastenzellen von Mäuseembryonen (in einem CR1aa- Medium) entwickeln. Eine Kokultur mit Cumuluszellen oder Trophoblastenvesikeln

fördert ebenso die frühe Entwicklung von Rinderembryonen über das

„8-Zellblockstadium“. Eine Alternative zur Nutzung von Cumuluszellen ist die Verwendung eines Monolayers aus Granulosazellen. Granulosa- und Cumuluszellen findet man in vivo als Hülle um die Eizelle.

GORDON (1994) berichtet von Versuchen, in denen bei Verwendung von Granulosazellen die besten Erfolge erzielt wurden (Tab. 12). Die Ergebnisse mit den verschiedenen Monolayern sind sich jedoch ähnlich.

Tabelle 12: Auswirkung der Verwendung verschiedener Monolayer auf den Kulturerfolg von bovinen Embroynen (GORDON 1994)

Verwendeter Zellmonolayer B¹⁾ [%]

Ohne 13,2

Granulosa 37,2

Ovidukt 31,7

Uterus 26,1

Granulosa + Ovidukt 32,5

Granulosa + Uterus 32,7

Ovidukt + Uterus 30,3

Granulosa + Ovidukt + Uterus 33,4

1) B = Prozentsatz von Embryonen, die sich zu Blastozysten entwickelten

Bei Schafembryonen kann nach BAVISTER (1988) der „8-Zell-Entwicklungsblock“

vermieden werden, wenn sie mit einem Eileiterzellmonolayer oder sogar nur mit Fibroblasten kultiviert werden. Eileiterzellen sind in der Lage, PDGF zu produzieren, welches die Embryonalentwicklung zusätzlich stimuliert. Ältere Schafembryonen (8- bis 16-Zeller) entwickeln sich auch ohne Kokultur bei ausschließlicher Verwendung eines SOF (synthetic oviductal fluid)-Mediums weiter.

Bei Rinderembryonen können Eileiterepithelzellen die Entwicklung vom 5- bis 8-Zeller zur späten Morula oder zum Blastozysten in einem SOF-Medium unterstützen. Ohne Kokultur ist keine Entwicklung nach dem 8- bis 16-Zellstadium festzustellen.

Eileiterzellen produzieren somit Faktoren (s.o.), die für eine normale Entwicklung des Embryos erforderlich zu sein scheinen. Außerdem werden Komponenten, die für den Embryo schädlich sind, beseitigt (wie z.B. Sauerstoffradikale, Glukose).

Fibroblastenzellen können zwar in der Reduktion der Sauerstoffspannung effektiv sein, was zu einer verbesserten Embryonalentwicklung führt, sie sollen aber nicht in der Lage sein, embryotrophe Faktoren zu sezernieren (BAVISTER 1988).

Es ist jedoch nicht immer nötig, eine Kokultur zu betreiben. So sind laut GORDON (1994) Medien, welche mit Eileitergewebe konditioniert wurden, genauso effektiv für die Kultur von Rinderembryonen von der Zygote bis zum Blastozystenstadium wie eine Kokultur.

Durch den Gebrauch von konditionierten Medien können nach GORDON (1994) ebenso Rinderembryonen von guter Qualität produziert werden, wobei die Risiken einer Kontamination mit Viren (v.a. BVD) im Vergleich zur Kokultur reduziert sind. Es erreichten in etwa gleiche Prozentsätze an Embryonen das Blastozystenstadium bei Verwendung von Medien, die mit Eileiterzellen (BOEC) konditioniert wurden (32%), wie bei dem Standard-BOEC (Bovine Oviductal Epithel Cell)-Monolayersystem (28%).

Ein mit bovinem Serumalbumin supplementiertes CZB-Medium (mit niedriger Osmolarität, ohne Glukose, reich an Laktat oder Glutamin) ist nach Konditionierung mit BOEC-Zellen dem M-199 Medium überlegen.

Bei der Kultivierung in einem mit BOEC-konditionierten Medium zeigte sich jedoch eine geringere ICM-Zellzahl der Embryonen als bei Kultivierung mit einem BOEC- Monolayer.

Ein ungünstiger Effekt bei Nutzung von konditionierten Medien ist, dass ihnen essentielle Fettsäuren fehlen. Die Ursache dafür liegt darin begründet, dass das Kulturmedium zum Schutz vor Austrocknung mit Silikonöl überschichtet ist, welches die für die Blastozystenformation essentiellen Fettsäuren absorbieren soll. In einer Kokultur geben die Zellen kontinuierlich Lipide in das Kulturmedium ab, die somit ständig zur Verfügung stehen.

Ebenso ist es möglich, ein Medium mit Blastozysten zu konditionieren. So war der Prozentsatz früher boviner Embryonen, die sich zu Blastozysten entwickelten, deutlich höher bei Verwendung von BCM (blastozyst conditioned medium) als ohne Konditionierung (Tab.13).

Tabelle 13: Wirkung eines mit Blastozysten konditionierten Mediums auf den Kulturerfolg von Rinderembryonen (GORDON 1994)

Behandlung B¹⁾ [%]

Kontrolle ohne BCM 48,1 Kultur in BCM ab Tag 3 55,6 Kultur in BCM ab Tag 0 59,3

n = 349 Embryonen pro Versuch

1) B = Prozentsatz an Zygoten, die sich zu Blastozysten entwickelten

4.2.3 Milieubedingungen bei der in vitro Kultur 4.2.3.1 Temperatur

Der Embryo erweist sich in der Kultur als sehr empfindlich gegenüber Temperaturschwankungen. Beim Rind sind höhere Teilungsraten bei 37° C festzustellen als bei 39° C (GORDON 1994). Warum trotzdem standardmäßig mit einer Temperatur von 39° C gearbeitet wird, lässt sich nicht aus der Literatur entnehmen (KRÄUSSLICH und BREM 1997).

4.2.3.2 Gaszusammensetzung, pH-Wert, Puffer

In Embryonenkulturen mit Serum und/oder Kokultur ist es laut GORDON (1994) vorteilhaft für die Entwicklung, die Sauerstoffspannung von 20% auf 5% zu reduzieren und zuverlässige Chelatbildner zuzufügen (z.B. 5 µM EDTA). In herkömmlichen Systemen wird mit 5% CO2 gearbeitet, dabei herrscht ein pH-Wert von über 7,4. Auch hier ist eine Sauerstoffspannung von 5% gegenüber 20% vorzuziehen. Der stimulierende Effekt von CO2 ist laut BAVISTER (1988) durch seine Funktion als permanente schwache Säure bedingt, was eine Reduktion des intrazellulären pH- Wertes bewirkt.

Die verschiedenen Systeme (10 % CO2 in Luft, 5% CO2, 5% O2, 90% N2 und 5% CO2, 10% O2, 85% N2 ) sollen sich nicht als vorteilhafter gegenüber konventionellen 5%

CO2 in der Luftgasphase erweisen (GORDON 1994).

Um die negativen Effekte von Sauerstoffradikalen auszugleichen, werden laut GORDON (1994) Schwefelkomponenten mit niedrigem Molekulargewicht (Thiole), wie z.B. ß-Mercaptoethanol und Cysteamin verwendet. Diese Supplementation führt zu einer Zunahme des intrazellulären Glutathions, welches in der Lage ist, die Sauerstoffradikale zu beseitigen. Dadurch kommt es wiederum zu einer Steigerung der Blastozystenentwicklungsrate (GORDON 1994).

Es zeigt sich auch, dass z.B. Kaninchenzygoten in einem makromolekülfreien Medium eine schnellere Entwicklung haben, wenn mehrere geeignete Antioxidantien zum Medium gegeben werden. Hier ermöglichen Taurin und Superoxid-Dismutase eine beschleunigte Entwicklung zu expandierten Blastozysten. Die effektivste Sauerstoffkonzentration für die Kultur von Kaninchenzygoten bis zur geschlüpften Blastozyste liegt bei 5% (GORDON 1994).

Sauerstoffradikale werden auch für die Blockierung der Entwicklung im 2-Zellstadium von Mäuseembryonen verantwortlich gemacht. Das hat sich laut RIEGER (1992) und GORDON (1994) durch die Beobachtung bestätigt, dass die Blockade weitgehend aufgehoben wurde, wenn eine Supplementation mit Superoxid-Dismutase oder reduziertem Glutathion stattfand. Außerdem soll die Kultivierung mit einer geringen Sauerstoffatmosphäre vor allem zwischen dem 1- und 2-Zellstadium positive Effekte auf die Entwicklung haben (GORDON 1994).

In proteinfreien Medien ohne Kokultur erhält man bei einer Sauerstoffspannung von 5% einen größeren Prozentsatz an bovinen Blastozysten als bei Verwendung einer höheren Sauerstoffspannung. Bei Benutzung von BRL (buffalo rat liver)-Zellen als Kokultur ist jedoch der Ertrag an Rinderembryonen bei der normalen atmosphärischen Sauerstoffspannung (20,8%) höher als bei 5% O2.

TAKAHASHI et al. (1999) haben in entsprechenden experimentellen Unter-suchungen festgestellt, dass die Entwicklung von bovinen Embryonen durch den Zeitpunkt einer Konzentrationsveränderung des Sauerstoffes beeinflusst wird. Sie haben an bestimmten Kultivierungstagen den Sauerstoffgehalt von 5 auf 20% gesteigert, bzw.

von 20 auf 5% gesenkt. Hierbei zeigte sich, dass eine Veränderung im

Sauerstoffgehalt vor allem zwischen den Tagen vier und sechs einen Einfluss auf die Entwicklung hat. Die höchsten Prozentsätze an Embryonen erreichten das Blastozystenstadium, wenn sie die ersten vier Tage in einer 5%igen Sauerstoffatmosphäre kultiviert wurden.

Nach MACHATY et al. (1998) sollen Schweineblastozysten in NCSU (North Carolina State University) 23 - Medium unter 20% O2 eine bessere Qualität bezüglich der Trophoektoderm- und Gesamtzellzahl haben als solche, die bei geringerer Sauerstoffspannung kultiviert werden.

Durch die Zugabe von Hyaluronsäure (0,5 mg/ml) werden nach EDWARDS et al.

(1998) die Zellen des Embryo vor reaktivem Sauerstoff geschützt und so die Entwicklungsfähigkeit von in vivo entstandenen Zygoten des Schweines zu Blastozystenstadien gesteigert (siehe auch Glykosaminoglykane). Durch Zusatz von Hyaluronsäure war der Prozentsatz an Embryonen, die sich zu Blastozystenstadien entwickelten, ab den Tagen 5 und 7 besser als ohne eine solche Ergänzung. Beim Rind führt gemäß EDWARDS et al. (1998) eine Zugabe von Hyaluronsäure zum Kulturmedium zu einer Produktion von zellreicheren Blastozysten (ICM- und Trophoektodermzellen) als ohne Hyaluronsäure.

Eine Supplementation mit ß-Mercaptoethanol kann laut ABEYDEERA et al. (1998) einen positiven Effekt auf die in-vitro-Kultur haben, ist aber abhängig von der Konzentration der Zulage. So kommt es bei einer Steigerung von 25 auf 50 µM ß-Mercaptoethanol zu einer reduzierten Blastozystenentwicklungsrate beim Schwein (ABEYDEERA et al. 1998; Tab. 14).

Tabelle 14: Effekt verschiedener ß-Mercaptoethanol-Konzentrationen während der in vitro Maturation auf die Zellzahl von Blastozysten des Schweines (ABEYDEERA et al. 1998)

ß-Mercaptoethanol [µM]

Trophoektoderm- Zellzahl (n) der

Blastozysten¹⁾

Absolute Zellzahl (n) der

Blastozysten¹⁾ 0,0 30,4 ± 3,4 34,9 ± 3,8 12,5 40,7 ± 6,1 47,4 ± 7,4 25,0 62,5 ± 8,0 67,5 ± 8,1 50,0 50,2 ± 4,4 54,5 ± 5,0

1) nach 144 h Kultivierungsdauer

ß-Mercaptoethanol ist vor allem bei hoher Sauerstoffspannung von Vorteil. Durch die Zugabe ß-Mercaptoethanol kommt es zu einer stärkeren Synthese von Glutathion, welches die Zelle vor Sauerstoffradikalen schützt (CAAMANO et al. 1998; Tab. 15).

Interessanterweise ist die Glutathionkonzentration in der Zelle bei einer Kultur mit 25 µmol ß-Mercaptoethanol/l größer als bei Verwendung von 50 µmol/l. Dies erklärt auch die reduzierte Entwicklung bei höheren Konzentrationen von ß-Mercaptoethanol beim Schwein in den Versuchen von ABEYDEERA et al. (1998).

Tabelle 15: Einfluss von ß-Mercaptoethanol auf den Kulturerfolg von Rinderembryonen unter Berücksichtigung unterschiedlicher Sauerstoffspannungen (CAAMANO et al. 1998)

ß-Mercapto- ethanol [µM]

Anzahl kultivierter Oozyten

Sauerstoff- spannung [%]

B¹⁾ [%]

0 153 20 13,7

20 153 20 26,1

0 151 5 24,5

20 151 5 25,1

1) B = Prozentsatz an Eizellen, die sich zu Blastozysten entwickelten

Die günstigen Effekte von ß-Mercaptoethanol und N-Acetyl-Cystein auf die in-vitro- Entwicklung und Glutathionsynthese von bovinen Embryonen werden auch von LEE et al. (1999) und GORDON (1994) betont. LEE et al. (1999) bewiesen, dass die Zugabe von ß-Mercaptoethanol zu einer höheren Anzahl an Blastozysten und geschlüpften Blastozysten führt. N-Acetyl-Cystein führt nur zu einem höheren Anteil an geschlüpften Blastozysten. Beide Stoffe sind jedoch in der Lage, die Glutathionsynthese des Embryonen zu verbessern (Tab. 16).

Tabelle 16: Der Effekt einer Zugabe von ß-Mercaptoethanol oder N-Acetylcystein auf den Kulturerfolg von bovinen Zygoten (LEE et al. 1999)

Anzahl Zygoten B¹⁾ [%] GB²⁾ [%]

KSOM + FCS 451 31,7 52,3

+ N-Acetylcystein 451 31,1 80,9

+ ß-Mercaptoethanol 449 49,4 78,6

1) B = Prozentsatz an Zygoten, die sich zu Blastozysten entwickelten

2) GB = Prozentsatz an Blastozysten, die sich zu geschlüpften Blastozysten entwickelten

Die Kapazität des 2-Zellembryos der Maus zur Regulation des pH-Wertes sind nach GARDNER (1998) eher gering. Spezifische Aminosäuren können jedoch als intrazelluläre pH-Puffer agieren. Diese Aminosäuren, wie z.B. Glycin, können wie ein intrazelluläres Zwitterion wirken, um pH-Fluktuationen zu minimieren. Bei einem pH von 6-7 liegen z.B. Taurin und Glycin als Zwitterionen vor. Vor der Kompaktierung hilft die Anwesenheit von nicht-essentiellen Aminosäuren (vor allem Glutamin) im Kulturmedium, die intrazellulären pH-Verschiebungen zu minimieren. Nach der Kompaktierung verlieren die Aminosäuren an Bedeutung, was die Regulierung des Säuren-Basen-Haushaltes betrifft (GARDNER 1998).

Die Entwicklung von 8-Zellstadien des Hamsters in vitro zeigt sich laut BAVISTER (1988) unbeeinträchtigt innerhalb eines pH-Bereiches von 6,5 bis 7,4 im Kulturmedium.

4.2.3.3 Osmolarität

Die Osmolarität des Kulturmediums kann das Wachstum der Embryonen beeinflussen. Werden Embryonen in so hohen Osmolaritäten wie im Eileiter vorkommend (im Extremfall bis 360 mosm/l) ohne Osmolyten inkubiert, ist die Entwicklung deutlich beeinträchtigt. Gerade bei Osmolaritäten von 280-310 mosm/l kann nach GARDNER (1998) ohne Zugabe von Aminosäuren und Ionen ein

„zellulärer Stress“ entstehen. Osmolyten sind Stoffe, die in der Lage sind, Ionen zu binden und deren osmotische Aktivität zu verhindern. Die Zugabe von Osmolyten in das Kulturmedium, wie z.B. Glycin, Glutamin, Taurin oder Betain, erlaubt auf diese Art auch bei höheren Osmolaritäten eine gute Embryonalentwicklung. Bei einer Osmolarität von 290-300 mosm entstehen mehr Blastozysten bei Verwendung von Osmolyten (im Vergleich zu einer Kultur ohne solche Stoffe; GARDNER 1998).

4.2.4 Energiequellen/-substrate

Die wichtigsten Nährstoffe für die Entwicklung von Präimplantations-Embryonen der Säugetiere sind nach GARDNER (1998) Kohlenhydrate und Aminosäuren. Sie sichern nicht nur die Energieversorgung, sondern schützen den Embryo auch vor

„zellulärem Stress“, welcher durch suboptimale Kulturbedingungen in vitro induziert wird. Embryonen von Hamster, Maus, Rind und Schaf haben bis nach der Kompaktierung der Morula nur eine limitierte Kapazität, Glukose zu verarbeiten.

Pyruvat, Laktat und Aminosäuren sind die bevorzugten Substrate zur Energieversorgung der Embryonen bis zum Stadium der Morula. Erst in der Zeit der Kompaktierung kommt es zu einer forcierten Glukoseaufnahme und einem höheren Glukoseverbrauch durch den Embryo (GARDNER 1998).

4.2.4.1 Kohlenhydrate

Während der frühen Teilungsphase wird nach RIEGER (1992) die Entwicklung von Embryonen durch Glukose, Hypoxanthin und Sauerstoff inhibiert, indem diese Substanzen die zelluläre Produktion von Sauerstoffradikalen steigern, welche auf verschiedene Art und Weise schädlich für die frühe Embryonalentwicklung sind.

Glutamin und Antioxidantien sind in der Lage, die Sauerstoffradikale zu entfernen und verbessern dadurch die weitere Entwicklung (RIEGER 1992).

Die Hemmung durch höhere Glukosekonzentrationen auf die Entwicklung kann z.B.

bei Rattenblastozysten durch Zugabe von Superoxid-Dismutase, Katalase oder Glutathionperoxidase reduziert oder sogar eliminiert werden (RIEGER 1992).

Das natürliche Vorkommen von Glukose in der Ovidukt- und Uterusflüssigkeit zeigt laut GARDNER (1998), dass deren Toxizität auf den Embryo in vitro generell als ein

„Artefakt“ angesehen werden muss.

Der Verbrauch von Glukose steht nach GARDNER (1998) unter der Kontrolle von spezifischen glykolytischen Regulatoren. Kontrolliert wird die Glykolyse über die Aktivität des Enzyms Phosphofruktokinase, welche durch das ATP-ADP-Verhältnis der Zelle beeinflusst wird. Ein weites ATP zu ADP Verhältnis hemmt das Enzym ebenso wie Zitrat. Diese Bedingungen existieren in frühen Embryonen. Wenn sich der Embryo zum Blastozystenstadium entwickelt, ändern sich die Verhältnisse und als Begleiterscheinung kommt es zu einer gesteigerten Glykolyse. Die glykolytischen

präsent. Glukose wird aber über den Pentosephosphatweg metabolisiert (GARDNER 1998).

Der Glukosemetabolismus soll während der Präimplantationsperiode zusätzlich vom Geschlecht der Embryonen abhängig sein. Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase ist zwar ein X-Chromosom-gebundenes Enzym und der limitierende Faktor in dem Pentosephosphatweg; aber überraschenderweise ist der absolute Glukose- metabolismus in männlichen Embryonen deutlich höher als in weiblichen. Eine Erklärung hierfür soll in dem schnelleren Wachstum der männlichen Embryonen liegen (RIEGER 1992 und KHURANA 1992).

SCHINI und BAVISTER (1988) bewiesen mit ihren Versuchen, dass sich 2-Zellembryonen des Hamsters in HECM-1 ohne Glukose deutlich häufiger zu 4-Zellstadien entwickelten als mit Glukose. Kein Embryo erreichte jedoch das 8-Zellstadium, wenn Glukose und Phosphate im Medium vorhanden waren. In einem

weiteren Experiment zeigte sich, dass die Entwicklung in einem HECM1-Medium mit Phosphat deutlich geringer war. Nur in HECM1-Medien ohne Phosphat kam es zu weiteren Teilungen (über den 8-Zeller hinaus). Desoxyglukose blockierte im Gegensatz zur Glukose die Entwicklung der Hamsterembryonen auch in Abwesenheit von Phosphat.

Da die 1-Zellembryonen des Hamsters sehr empfindlich gegenüber verschiedenen energieliefernden Substraten und -konzentrationen sind, wurde für sie durch McKIERNAN et al. (1991) ein optimiertes HECM entwickelt, das sogenannte HECM-

3. In den Versuchen war Pyruvat allein nicht in der Lage, die Entwicklung von 1-Zellembryonen des Hamsters zum 4-Zeller zu gewährleisten. Bei Verwendung von

Laktat als einziger Energiequelle entwickelten sich 14% der kultivierten 1-Zellstadien zur Morula oder Blastozyste. Der höchste Prozentsatz an Blastozysten konnte jedoch bei einer reduzierten Laktatkonzentration (<10 mM) mit gleichzeitiger Zugabe von entweder zwanzig Aminosäuren (s. HECM1, Tab. 72) oder 0,2 mM Glutamin verzeichnet werden. Die 2-Zellstadien des Hamsters können, im Gegensatz zu den oben beschriebenen 1-Zellstadien, nur mit Laktat bis zur Blastozyste kultiviert werden.

Bei Zugabe von zwanzig Aminosäuren und Laktat erreichten 70-75% der 2-Zellhamster das Blastozystenstadium. Glutamin kann ebenso als ausschließliche

Energie- und Stickstoffquelle für die Entwicklung vom 2-Zeller zur Morula/Blastozyste dienen. Dies ist jedoch in dem 1-Zellstadium des Hamsters noch nicht möglich.

Durch eine Zulage von Pyruvat kann die Entwicklung von 2-Zellhamstern nicht gesteigert werden. Die meisten 1-Zellembryonen des Hamsters entwickeln sich aber zu Blastozysten bei Konzentrationen von 0,25 mM Pyruvat und 3,5 mM Laktat sowie 0,2 mM Glutamin.

Embryokulturmedien vom Rind basieren laut GORDON (1994) häufig auf Krebs- Ringer-Bikarbonat Salzlösungen mit den Energiequellen Pyruvat, Glukose und Laktat.

Fehlt Glukose im Kulturmedium (M-199 + 2% FCS) während der frühen Phasen der Embryonalentwicklung, kommt es aber wie beim Hamsterembryonen zu einer verbesserten weiteren Entwicklung. Glukose wird demnach laut GORDON (1994) und GARDNER (1998) erst in späteren Stadien (Morula/Blastozyste) wichtig.

Das Vorhandensein von Glukose in einem semidefinierten Medium (M-199 mit BSA, Laktat und Pyruvat) hemmt laut GORDON (1994) die frühen Entwicklungsstadien von Rinderembryonen, insbesondere im 8-Zellstadium. Fünf Tage nach der in-vitro- Fertilisation (16-Zellstadien) wird die Entwicklung zu Blastozystenstadien durch eine Glukose-Zulage verbessert. Die Zugabe von Glukose zu einem Pyruvat/Laktat- Medium in der Zeit der Kompaktierung unterstützt bei Mäusen den Übergang von der Morula zur Blastozyste; ist keine Glukose vorhanden, sollen sich die Embryonen nicht über das Morulastadium hinaus entwickeln.

Beim Schaf wird Glukose erst nach dem 16-Zellstadium als Energiequelle bedeutsam.

Die Zunahme der Glukoseaufnahme nach diesem Stadium kann nach GORDON (1994) auf die Abnahme des ATP/ADP-Verhältnisses zurückgeführt werden. In einem modifizierten CZB-Medium mit Glutamin können sich Schafembryonen auch ohne Pyruvat, Laktat und Glukose zu Blastozystenstadien entwickeln (GORDON 1994).

Glukose ist also nach GORDON (1994) nicht essentiell für die Entwicklung von Schafembryonen, eine Supplementation in niedrigen Konzentrationen soll aber förderlich sein. Höhere Glukosekonzentrationen könnten die Entwicklung der Schafembryonen durch die Hemmung des Zitratzyklus behindern. Von welchen Glukosegehalten GORDON (1994) ausgeht, ist allerdings nicht näher erläutert.

Die Supplementation von Glukose hemmt jedoch nach KHURANA (1992) generell die Entwicklung von 1- zu 2-Zellembryonen des Schafes, wobei aber in Anwesenheit von Carbonsäuren (R-OOH; z.B. Ameisen- oder Essigsäure) niedrige Glukosegehalte einen förderlichen Effekt haben.

Der Glukosestoffwechsel nimmt laut RIEGER (1992) und GARDNER (1998) bei Mäusen, Schweinen und Schafen deutlich vom 2-Zeller bis zur Blastozyste zu.

Schweineembryonen metabolisieren jedoch vor dem 8-Zellstadium kaum Glukose.

Zwischen dem 2-Zell- und dem expandierten Blastozystenstadium von Rindern kommt es nach RIEGER (1992) zu einem 15-fachen Anstieg in der Fähigkeit, Glukose über den Pentosephosphatweg zu metabolisieren. Ebenso ist in dieser Zeit ein 30-facher Anstieg des absoluten Glukosemetabolismus festzustellen. Allein in der Zeit der Entwicklung von der Morula zur expandierten Blastozyste verdoppelt sich der absolute Glukoseumsatz. Die Steigerung des Glukosemetabolismus geschieht dabei schrittweise (Ausnahme Pferd: lineare Zunahme).

Bei Embryonen von Schweinen, Schafen und Rindern ist laut RIEGER (1992) die erste messbare Zunahme im Glukosemetabolismus um die Zeit der Aktivierung des embryonalen Genoms zu beobachten. Dieses geschieht nach KRÄUSSLICH (1994) bei den bovinen und ovinen Embryonen zwischen dem 8- und 16-Zellstadium, wobei sie aber bis zum 12-Zellstadium sehr wenig Glukose verbrauchen. Bei Schweine- embryonen kommt es zwischen dem 4- und 8-Zellstadium zur Aktivierung des embryonalen Genoms und bei Pferdeembryonen zwischen dem 8- und 16-Zell- stadium. Der Mäuseembryo scheint nach RIEGER (1992) eine Ausnahme zu sein, weil die Hexokinaseaktivität zwischen dem 1- und 2-Zellstadium zur Zeit der Genom- aktivierung um mehr als das Dreifache zunimmt, aber die erste messbare Steigerung im Glukosemetabolismus nicht vor dem 8-Zellstadium festzustellen ist. Bei Kaninchen- und Mäuseembryonen ist die Formation der Blastozyste mit einem deutlichen Synthese- und Aktivitätsanstieg der Na⁺/K⁺-ATPase verbunden. Die Zunahme im Glukoseverbrauch während der Blastulation steht im Zusammenhang mit dem Energiebedarf dieser Ionenpumpe. Die Energie, die aus Glukose gewonnen wird, entsteht durch anaerobe Glykolyse, da der Krebszyklus nur eine untergeordnete Rolle im Glukosestoffwechsel von Rinder-, Kaninchen- und Schafblastozysten spielt (RIEGER 1992).

Während der verschiedenen Zellstadien benötigen bovine Embryonen laut KRISHER und BAVISTER (1998) vor allem Glutamin und Pyruvat zur Energiegewinnung. Der Glutaminbedarf der Mäuseembryonen sinkt im Übergang vom 4-Zell- zum 8-Zell- stadium. Zu diesem Zeitpunkt nimmt die Bedeutung von Glukose für die folgende Embryona-entwicklung zu. Die Glykolyse wird erst nach dem Morulastadium bedeutend. Kulturbedingungen können aber die Fähigkeit des Embryos, bestimmte Energiesubstrate zu metabolisieren, beeinflussen. Bei einer in-vitro-Maturation mit LH kommt es zu einer zunehmenden glykolytischen Aktivität sowie Glukose- und

Glukose oder anorganischem Phosphat fördert nach PETTERS et al. (1990) die Entwicklung von Schweineembryonen zu Morula- und Blastozystenstadien in demselben Ausmaß, wie es durch Glukose geschieht. Glutamin ist nach PETTERS et al. (1990) ebenso hilfreich für Hamster- wie für Kaninchenoozyten. Es ist also möglich, Glukose für die Energiegewinnung durch Glutamin zu ersetzen. In MEM (minimal essential medium), welches Glutamin enthält, wird z.B. eine bessere Entwicklung von 4- bis 8-Zellembryonen des Schweines beobachtet als in einem Krebs-Ringer-Bikarbonat- Medium, welches mit Glukose supplementiert ist. In der Zeit der Entwicklung von der Morula zur Blastozyste soll jedoch eine Glutaminzugabe keine Effekte haben. Die Zugabe von Glukose ist aber für Schweinembryonen essentiell, wenn Glutamin fehlt, und erweist sich als nicht hemmend, wie bei Hamster- und Mäuseembryonen beobachtet wurde. Glutamin kann aber auch als einzige exogene Energiequelle für die Entwicklung der Schweinezygote zum Blastozysten- stadium dienen.

Der negative Effekt von Phosphat in den Medien, in welchen Glukose vorhanden ist, entspricht den hemmenden Effekten, die bei Hamsterembryonen gesehen werden.

Glukose selbst ist jedoch nicht nachteilig für die Entwicklung von Rinder- und Schafembryonen (PETTERS et al. 1990). Unter konventionellen Kulturbedingungen (Medien, basierend auf einfach ausgeglichenen Salzlösungen mit Zugabe von Laktat und Pyruvat, aber ohne Aminosäuren) hemmt Glukose jedoch die Zygote und die Embryonen im Teilungsstadium (GARDNER 1998). Die Blockierung der Entwicklung im 2-Zellstadium von Mäuseembryonen ist laut RIEGER (1992) deutlich seltener oder gar zu vermeiden, wenn Glukose durch Fruktose ersetzt wird. Ein Defizit an Glukose- 6-Phosphat-Isomerase (welche Glukose-6-Phosphat in Fruktose-6-Phosphat umwan- delt) verursacht im frühen Mäuseembryo eine abnorme Akkumulation von Glykogen, welches mit dem Entwicklungsblock assoziiert wird (RIEGER 1992).

Beim Rind ist die optimale Glukosekonzentration in einem modifizierten SOF-Medium (supplementiert mit 10% Humanserum) nach GORDON (1994) abhängig von der Dauer der Kultur. An den Tagen 1 bis 3 der Kultur sollte die Glukosekonzentration bei 0,188 mM und an den Tagen 4 bis 8 bei 1,5 mM liegen. Gehalte über 3 mM an den Tagen 1 bis 3 hemmen die Embryonen.

Auch DONNAY et al. (1999) bewiesen, dass die Zugabe von Glukose zu den Morulastadien zwar keinen Effekt auf die Blastozystenentwicklung vom Rind an den Tagen 6 und 7 hatte, aber zu einer Steigerung des Prozentsatzes von entstehenden Blastozysten am Tag 8 führt (Tab. 17). Die Pyruvataufnahme der Blastozysten ist in Anwesenheit von Glukose geringer, während die von Laktat nicht beeinflusst wird.

Tabelle 17: Effekt einer Glukosesupplementation an verschiedenen Tagen der Kultur auf den Kulturerfolg vom Rind (DONNAY et al. 1999)

Ohne Glukose n = 82 Embryonen

+ 990 mg/l Glukose n = 85 Embryonen

B¹⁾ am Tag 6 33 + 7 33 + 4

B am Tag 7 60 + 6 66 + 6

B am Tag 8 65 + 6 80 + 4

1)B = Prozentsatz an Eizellen, die sich zu Blastozysten entwickelten

Glukose in Kombination mit Phosphat hat, wie schon erwähnt, nachteilige Effekte. So formt sich auch nach KHURANA (1992) ein höherer Anteil von in vitro gewonnenen Rinderzygoten zu Blastozysten, wenn Phosphat bis auf 0,5 mM reduziert ist und Glukose erst nach 72-stündiger Kultivierung zugegeben wird (GORDON 1994 empfiehlt jedoch keine Glukosezulage vor dem 16-Zellstadium). Ebenso ist die Entwicklung von 8-Zellembryonen der Ratte vor allem in den Medien gehemmt, welche Glukose und Phosphat enthalten.

Der negative Effekt von Glukose in Anwesenheit von Phosphat ist bei Hamster- embryonen als „Cabtree effect“ bekannt (Cabtree effekt = Hemmung der Respiration und oxidativen Phosphorylierung der Glukose). Dieser wird für den 2-Zellblock von Hamsterembryonen verantwortlich gemacht. Kulturmedien für Hamsterembryonen ohne Glukose und Phosphat ermöglichen eine bessere Entwicklung von 2-Zell- zu 8-Zell-/Morulastadien sowie von 8-Zellstadien zu Blastozysten (KHURANA 1992).

LUDWIG et al. (1999) zeigten in experimentellen Untersuchungen, dass eine 24-stündige Kultur mit 1,25 µM anorganischem Phosphat zu einer Abnahme der durchschnittlichen Zellzahl beim Hamster führt, aber keinen deutlichen Effekt auf die weitere Entwicklung hat. Konzentrationen über 1,25 µM hemmen die Entwicklung signifikant, und zwar in allen Stadien (Tab. 18). Eine Kultur mit anorganischem Phosphat soll zu einem deutlichen Anstieg des intrazellulären pH-Wertes führen.

Tabelle 18: Effekt steigender Phosphatkonzentrationen auf den Kulturerfolg von Hamsterembryonen in HECM (LUDWIG et al. 1999)

Phosphatgehalt im Medium [µM] B¹⁾ [%]

0 76,19

1,25 70,59

2,50 8,54

5,00 0

n = 30 Embryonen pro Versuch

1) B = Prozentsatz von 2-Zellembryonen, die sich zu Blastozysten entwickelten

Bei Schweineembryonen wird eine höhere Anzahl an Blastozysten beobachtet, wenn 4-Zellstadien in Medien ohne Laktat und Pyruvat kultiviert werden, als wenn beide

Substrate zugegeben werden. Pyruvat allein hemmt die Entwicklung der 4-Zellembryonen des Schweines (KHURANA 1992). Die beste Entwicklung von

Schweineembryonen wird laut PETTERS et al. (1990) in Medien erzielt, die Glukose und Glutamin enthalten. In einem Krebs-Ringer-Bikarbonat-Medium, dem jede exogene Energiequelle fehlt (Glukose oder Glutamin), ist den Schweineembryonen nach dem 4-Zellstadium keine Weiterentwicklung möglich. Die beste Entwicklung wird mit Glukose und/oder Glutamin erzielt (siehe Tab. 19). Der Effekt von Glutamin ist unabhängig von Phosphat im Medium. Das Medium ohne Glutamin unterstützt die Entwicklung nur, wenn Glukose zur Verfügung steht. Phosphat und Glukose interagieren miteinander (s.o.); ein höherer Prozentsatz an Embryonen entwickelt sich zu Blastozysten in Abwesenheit von Phosphat (PETTERS et al. 1990).