4 Entwicklungs- und Ernährungsbedingungen in vitro (vom 1-Zeller bis zum Blastozystenstadium)
4.3 Vergleich verschiedener Medien bei der Kultivierung einzelner Spezies
In vielen Untersuchungen über die Kultivierung von Embryonen werden verschiedene Standardmedien verwendet, die meist multifaktorielle Unterschiede aufweisen. Daher ist oft nur bedingt eine Erklärung der besseren Kultivierungsergebnisse bei Verwendung eines bestimmmten Mediums möglich. Die Erfolge können auf die grundsätzlich veränderte Zusammensetzung zurückzuführen sein sowie auf den Überschuss bzw. Mangel eines einzelnen Stoffes.
Einige Standardmedien erweisen sich jedoch im Vergleich mit anderen als geeigneter für die Kultur von Embryonen einer bestimmten Tierspezies.
Aufgrund der vielfältigen Ursachen der unterschiedlichen Ergebnisse einer Kultur mit Standardmedien kann keine Zuordnung zu den Kapiteln erfolgen, in denen es um die Folgen einzelner Supplementationen geht. Die Ergebnisse werden deshalb in diesem Kapitel gesondert aufgeführt.
4.3.1 Labortierspezies
Ein CZB-Medium mit Mäuseoviduktzellen kann erfolgreich für die Kultur vom 1-Zeller des Hamsters, der Maus und der Ratte zur Morula/Blastozyste genutzt werden (GORDON 1994).
Die Mäuseeizelle entwickelt sich laut NEW (1966) in Krebs-Ringerbikarbonat zum Zweizeller, wenn CaCl2 durch Ca-Laktat ausgetauscht wird oder Na-Laktat zum Medium zugegeben wird (= Whittens Medium). Mäuseembryonen können gut in Whittens-Medium (Krebs-Ringer-Bikarbonat + 1 mg/ml Glukose und 10µg/ml Strep-tomycin und Penicillin, sowie 1 mg/ml bovines Albumin, mit 5% CO2, pH 7,4) vom 8-Zeller zur Blastozyste kultiviert werden. Besser entwickeln sich 2-Zellstadien der Maus zur Blastozyste in Brinsters Kulturmedium, welches eine Abwandlung von Krebs-Ringer-Bikarbonat darstellt. Im Gegensatz zum Whittens Medium unterstützt laut POUEYMIROU et al. (1989) ein CZB-Medium, welchem Glukose fehlt und Glutamin zugefügt wurde, die Entwicklung vom 1-Zellembryo der Maus über das 2-Zellstadium hinaus. Es fördert im stärkeren Maß die absolute Proteinsynthese in 2-Zellembryonen der Maus im Vergleich zum Whittens Medium. CHATOT et al.
(1989) stellten fest, dass es bei der Kultivierung von 1-Zellembryonen der Maus in M16 (Whittingham`s orginal medium 16), Whittens Medium oder EBSS mit EDTA generell am Tag 4 im 2-Zellstadium zu einem „Block“ kam. Die Zugabe von 1 mM Glutamin oder die Elimination der Glukose aus dem Medium M16 erlaubte 7-34% der 1-Zeller, sich über den 2-Zellblock zu entwickeln und 1-2% bis zur Morula oder Blastozyste.
Laut CHATOT et al. (1989) entwickelte sich in einem CZB-Medium (ohne Glukose) ein höherer Prozentsatz von Mäusezygoten durch das 2-Zellstadium zu Morula-stadien im Vergleich zu einer Kultur in BMOC-2, modifizierten M16, modifizierten Whittens-Medium oder EBSS+EDTA. Die Zugabe von Glukose zum CZB-Medium wirkte sich hemmend auf die Entwicklung aus. Ab dem fünften Kultivierungstag entwickelte sich im CZB-Medium jedoch der größte Teil der Embryonen nicht normal weiter, unabhängig davon, ob Glukose im Medium vorhanden war oder nicht. Bei einer Kultur von 1-Zellembryonen der Maus in einem CZB-Medium, welches ein Laktat/Pyruvat-Verhältnis von 116:1 hatte, 1 mM Glutamin und 0,1 mM EDTA, jedoch
keine Glukose enthielt, überwanden bei CHATOT et al. (1989) 83% das
2-Zellstadium. Aber nur 9% dieser Embryonen entwickelten sich weiter zu Blastozysten. Eine Kultur von 1-Zellembryonen der Maus für 48 Stunden in einem CZB-Medium, gefolgt von einer Übertragung in ein CZB-Medium + Glukose führte dazu, dass sich 58% aller 1-Zeller zu Morula- oder Blastozystenstadien entwickelten.
Die Entwicklungshemmung des 1-Zellembryonen der Maus durch Glukose beschränkte sich auf die ersten 48 Stunden der Kultur.
Kaninchenembryonen wachsen in vitro in verschieden Medien (Brinster`s BMOC-3, Mc Coy´s 5a, Medium 199, HAM´s F10 und F12). Das Medium, welches jedoch die beständigsten Resultate erzielt, ist ein spezielles synthetisches Medium zur Kultur von Kaninchenembryonen (s. Tab. 76; DANIEL 1978).
4.3.2 Nutztierspezies
Rinderembryonen entwickeln sich laut GORDON (1994) in SOF oder M-199 auch ohne Kokultur zu Blastozystenstadien. Dabei kann mit 5% oder 20% Sauerstoff gearbeitet werden. Die morphologische Qualität der Embryonen ist besser aufrecht-zuerhalten, wenn FCS und Eileiterzellen als Kokultur in Kombination mit einem SOF-Medium benutzt werden als die alleinige Verwendung von SOF (GORDON 1994).
Der Prozentsatz an Zygoten, die sich zu Blastozysten entwickeln, ist in M-199 und Menezo`s B Medium nach GORDON (1994) vergleichbar (41,1% und 35,4% geteilte Oozyten).
Eine Kultur von Schafembryonen in SOF ist nur schlecht möglich. Von frühen Schaf-embryonen, die in SOF + 20% Humanserum unter 5% Sauerstoffspannung kultiviert wurden, überlebten nach 6 Tagen nur 3% (GORDON 1994). Ein modifiziertes SOF mit 20% Humanserum und einer geringen Glukosekonzentration (1,5 mM) ist effektiver für die Blastozystenentwicklung als SOF mit hohen Glukosegehalten (2,3 mM; KHURANA 1992; GORDON 1994). Spätere Stadien (8- bis 16-Zeller) können laut BAVISTER (1988) gut in SOF ohne spezielle Supplementation kultiviert werden. Über 50% sind nach dem Transfer in der Lage, sich weiter zu entwickeln.
Frühe Schweineembryonen können in einfachen Medien wie z.B. ein TALP (modifiziertes Tyrodes/Albumin/Na-Laktat/Na-Pyruvat)-Medium über das „Block-stadium“ hinaus kultiviert werden (GORDON 1997).
Beltsville Embryo Culture Medium 3 (BECM-3) ist jedoch laut DOBRINSKY et al.
(1996) speziell zur Unterstützung der Entwicklung von der porcinen Zygote bis zum Blastozystenstadium entwickelt worden. Bei Zugabe von fetalem bovinen Serum (FBS) zu BECM-3 am späten 5. Tag der Kultur (späte Morula/frühe Blastozyste) entwickelten sich 80% zu geschlüpften Blastozysten. Wurde FBS jedoch schon ab dem 2- bis 8-Zellstadium zugegeben, wirkte sich die Zulage schädlich auf die Entwicklung aus (Tab. 38). Die Supplementierung mit BSA (bovine serum albumin) zeigte ähnliche Ergebnisse wie mit fetalem bovinen Serum.
Tabelle 38: Effekt der Proteinsupplementation für die ersten 24 Stunden der Kultur auf die Entwicklungsfähigkeit von Schweineembryonen in BECM-3 (DOBRINSKY et al. 1996)
Proteinquelle n GB1) [%]
BECM-3 19 74
BECM-3 + Bovines Serum Albumin 18 78 BECM-3 + Fetales Bovines Serum 18 6
1)GB = Prozentsatz an 2-Zellstadien, die sich zu geschlüpften Blastozysten
Die reduzierte Entwicklungsfähigkeit der Embryonen, die in BSA kultiviert werden, kann nach DOBRINSKY et al. (1996) durch „Kontaminationen“ bei der Herstellung von BSA bedingt sein. Der Autor macht leider keine Angaben, welcher Art die Kontaminationen sind. Die Kombination von vorheriger Kultur in BECM-3 (ohne Proteinsupplementation) und später mit FBS ergibt einen hohen Prozentsatz an Blastozysten und geschlüpften Blastozysten. Durch eine Supplementierung mit FBS ab dem Morulastadium sollen die entstehenden Blastozysten eine durchschnittlich höhere Zellzahl als ohne FBS haben (DOBRINSKY et al. 1996).
Der Schweineembryo kann aber auch erfolgreich in einem CZB-Medium + Mäuseoviduktzellen kultiviert werden (GORDON 1994).
Bei Verwendung eines modifizierten Whitten`s Mediums entwickeln sich laut NEW (1966) nur wenige 1- und 2-Zellembryonen von Schweinen über das „Blockstadium“
hinaus. In späteren Stadien (nach dem 4-Zeller) ist eine Entwicklung zur Blastozyste möglich, dies führt aber oft zu einer reduzierten Vitalität der Embryonen. Bei Kultivierung in einem modifizierten Krebs-Ringer-Bikarbonat-Medium (modifiziertes KRB), welches Kombinationen an Glukose, Laktat, Pyruvat und BSA enthält, zeigt sich nach 24 Stunden Kultivierung eine deutliche Abnahme der Überlebensfähigkeit der Embryonen nach dem Transfer. Nach GORDON (1997) ist eine Kokultur von frühen Schweineembryonen mit POEC (Pig Oviductal Epithelial Cells) geeignet, um die Blockierung der Entwicklung im 4-Zellstadium zu überwinden; die porcinen Eileiterzellen produzieren die hierfür nötigen Faktoren. Eine Kombination von PEF (Pig Fetal Endometrial Fibroblasts) und POEC ist ebenso geeignet, um den „4-Zell-block“ zu überwinden.
Nach GORDON (1997) werden Schweineembryonen bei Verwendung von einem BMOC-Medium, das mit FCS oder BSA supplementiert ist, mit größerem Erfolg durch den 4-Zellblock kultiviert als bei Verwendung anderer Medien (Ham`s F-10, Ham`s F-12, Whittens Medium). Frühe Schweineembryonen sollen sich erfolgreich bei Verwendung von einfachen Medien (modifiziertes Tyrode`s Medium, welches Laktat und Pyruvat enthält) über das „Blockstadium“ hinaus entwickeln. Diese können somit in einem einfachen HEPES-gepufferten Medium in Luft vom 1-Zellstadium zur Blastozyste kultiviert werden. Bei einem Vergleich von MACHATY et al. (1998) zwischen einem NCSU-23-Medium (Standardkultursystem beim Schweineembryo) mit einem KSOM/aa-Medium zeigten Schweineembryonen in NCSU-23 eine höhere Durchschnittszahl an ICM-Kernen. Sie hatten zudem eine höhere Trophoektoderm- und absolute Kernzahl. Überraschenderweise war bei einer Kultur in 5% CO2 in Luft eine höhere Trophoektoderm- und absolute Kernzahl festzustellen als bei 5% CO2, 5% O2 und 90% N2.
KSOM ist eine modifizierte Version von dem Simplex-Optimized Medium, beide Medien wurden für die Kultur von Mäuseembryonen vom 1-Zell- durch das 2-Zell-stadium entwickelt. KSOM/aa (KSOM + nicht-essentielle und essentielle Aminosäuren) wird ebenso erfolgreich für die Kultur von Rinder- und Kaninchenembryonen verwendet. KSOM/aa und NCSU-23 unterstützen aber auch die Entwicklung vom porcinen 1- bis 2-Zellembryonen zu frühen Blastozystenstadien. Die deutlich höhere Zellzahl in NCSU-23 zeigt, dass dieses für Schweineembryonen geeigneter ist als KSOM/aa. In beiden Medien kommt es jedoch zu einer Entwicklung über das 4-Zellblockstadium hinaus (MACHATY et al. 1998).
FANCSOVITS et al. (1998) kamen bei dem Vergleich von drei einfach definierten Medien mit einem Kokultursystem (TCM-199 + Cumulus- und Granulosazellen) zu den in Tabelle 39 aufgelisteten Ergebnissen.
Tabelle 39: Einfluss verschiedener Kulturmedien auf die Weiterentwicklung des Rinderembryos (FANCSOVITS et al. 1998)
Z1) [%] B2) [%] B2) [%]
Medium n
Tag 4 Tag 7 Tag 8
CR1aa 296 41,5 30,5 45,8
SOF 292 37,7 21,9 33,3
KSOM 287 45,5 26,8 33,3
Kokultur 849 44,8 30,2 45,1
1)Z = Prozentsatz an Embryonen, die sich zu 8- bis 16-Zellstadien entwickelten
2)B = Prozentsatz an Embryonen, die sich zu Blastozysten entwickelten
Ein anderer Versuch von JOO et al. (1998) zeigte, dass eine Kokultur mit BRL (Buffalo Rat Liver)-Zellen bei der Kultivierung von Rinderembryonen in TCM-199 am erfolgreichsten war (Tab. 40).
Tabelle 40: In-vitro-Entwicklung von Rinderembryonen bei Verwendung verschiedener Monolayer (JOO et al. 1998)
Medium n MB1) [%]
TCM-199 114 17
+ Eileitergewebe vom Rind 120 39
+ Granulosazellen 120 48
+ Verozellen (african green monkey cells) 130 48
+ BRL (buffalo rat liver) 125 58
1) MB = Prozentsatz an Rinderembryonen, die das Morula-/Blastozysten-stadium erreichten
KAJIHARA et al. (1999) machten einen Versuch über den Einfluss unterschiedlicher Kulturmedien auf Rinderembryonen (Tab. 41).
Tabelle 41: Einfluss von TCM 199, CR1aa und USU-6 auf die Entwicklung von Rinderembryonen (KAJIHARA et al. 1999)
Medium n B1) EB2)
TCM 199 370 17 15
CR1aa 373 37 27
USU-6 341 9 2
1)B = Prozentsatz an Oozyten, die sich zu Blastozysten entwickelten
2)EB = Prozentsatz an Oozyten, die sich zu expandierten Blastozysten entwickelten
Bei dem Vergleich zwischen CR1aa mit TCM 199 und USU-6 zeigte sich, dass ein höherer Prozentsatz der Rinderembryonen das Blastozystenstadium erreichte, wenn sie in CR1aa kultiviert wurden. Es gibt keinen Unterschied in der Entwicklung zur expandierten Blastozyste zwischen der Kultur in TCM 199 und CR1aa (KAJIHARA et al. 1999).
Pferdeembryonen können laut GORDON (1994) erfolgreich in HAM`s F12 und Dulbeccos modifiziertem Eagle`s Medium (F12DME) mit einer Oviduktzellkokultur kultiviert werden.