In-vitro-Kultur beim Tier

Bei der in-vitro-Kultur von Tieren liegen vor allem über Hamsterembryonen die meisten Erkenntnisse vor, die auch als gesichert angesehen werden können. Neuere wissenschaftliche Untersuchungen beschäftigen sich auch intensiv mit der Spezies Rind, wie in den aktuellen Ausgaben der Zeitschrift Theriogenology ersichtlich. In diesem Kapitel wird zunächst auf die begleitenden Faktoren der Kultur eingegangen, da sie ebenfalls einen Einfluss auf den Kulturerfolg nehmen.

4.2.1 Anzahl von Embryonen im Kulturmedium

Laut PALASZ und THUNDATHIL (1998) sowie GORDON (1994) hat die Anzahl der Embryonen, die pro Volumen Medium kultiviert werden, Effekte auf deren Entwicklung. Der Prozentsatz an lebenden Embryonen war deutlich geringer, wenn sie einzeln kultiviert wurden, als wenn dies in Gruppen geschah (Tab. 9 und 10).

Tabelle 9: Überlebensrate von Mäuseembryonen in Abhängigkeit von der Zahl der Embryonen im Medium (GORDON 1994)

Anzahl Embronen in 50 µl Medium

Überlebensrate [%]

1 38,7

10 65,6

20 61,8

Tabelle 10: Kultivierungserfolg bei Rinderembryonen in Abhängigkeit von der Anzahl an Oozyten im Kulturmedium (n≈130; PALASZ und THUNDATHIL 1998)

Anzahl Oozyten pro 10 µl Kulturmedium

M¹⁾ [%]

B²⁾ [%]

5 39 11

10 44 10

20 75 60

1) M= Prozentsatz an Oozyten, die das Morulastadium erreichten

2) B= Prozentsatz an Oozyten, die bei einer weiteren Kultur das Blastozystenstadium erreichten

Eine Kultivierung von Mäuse- und Rinderembryonen in reduzierten Volumina u./o. in Gruppen führte auch nach AHERN und GARDNER (1998) zu einem höheren Prozentsatz an Embryonen, die sich zu Blastozysten entwickelten, und der ICM- (inner cell mass) Zellzahl (Tab. 11). Die Reduktion des Inkubierungsvolumens zur Embryonenrate führt zudem bei Mäuseembryonen nach GORDON (1994) zu einer höheren Überlebensrate. Die optimale Relation soll bei fünf Embryonen pro 10 µl Medium liegen.

Tabelle 11: Einfluss der Anzahl an Mäuseembryonen im Medium auf den Kultivierungserfolg (AHERN und GARDNER 1998)

Anzahl Embryonen pro 50 µl Kulturmedium

B¹⁾ [%]

IZ²⁾ [n]

1 45,8 15,6 + 1,8

2 55,2 37,1 + 3,3

3 71,8 43,6 + 4,3

n = 56 Embryonen pro Versuch

1)B = Prozentsatz von Embryonen, die nach 72 Stunden Kultur das Blastozystenstadium erreichten

2)IZ = ICM-Zellzahl der entstandenen Blastozysten

Dadurch lässt sich auch erklären, weshalb eine Kokultur mit Mäuseembryonen die Entwicklung von Rinderembryonen steigert. Parakrine Faktoren, die von den Embryonen sezerniert werden, sollen sich hier eher förderlich als hemmend auswirken (GORDON 1994). Der Autor äußert sich leider nicht über die Art der Faktoren, die hier günstig wirken sollen.

4.2.2 Zellkulturen und Konditionierung des Kulturmediums

Nach GORDON (1994) können sehr verschiedene Zelltypen erfolgreich zur Kokultur verwendet werden, da die Bildung embryotropher Faktoren (wie z.B. Wachstums-hormone) weder an die Tierart noch an ein bestimmtes Organ gebunden ist. Diese Zellen binden außerdem toxische Faktoren (wie z.B. Stoffwechselprodukte, Schwermetalle), die im Medium vorhanden sein können oder vom Embryo selbst produziert werden. Kokulturzellen sind hilfreich, um die Konzentrationen an Na⁺, K⁺, Cl^-, Mg²⁺, Ca²⁺ oder Glukose niedrig zu halten, was zu einer besseren Entwicklung von Embryonen führen kann. Durch den Verbrauch von Sauerstoff schützen die Zellen den Embryo zusätzlich vor Sauerstoffradikalen (GORDON 1994).

So können sich Rinderembryonen gemäß GORDON (1994) erfolgreich in einem Kokultursystem mit Fibroblastenzellen von Mäuseembryonen (in einem CR1aa-Medium) entwickeln. Eine Kokultur mit Cumuluszellen oder Trophoblastenvesikeln

fördert ebenso die frühe Entwicklung von Rinderembryonen über das

„8-Zellblockstadium“. Eine Alternative zur Nutzung von Cumuluszellen ist die Verwendung eines Monolayers aus Granulosazellen. Granulosa- und Cumuluszellen findet man in vivo als Hülle um die Eizelle.

GORDON (1994) berichtet von Versuchen, in denen bei Verwendung von Granulosazellen die besten Erfolge erzielt wurden (Tab. 12). Die Ergebnisse mit den verschiedenen Monolayern sind sich jedoch ähnlich.

Tabelle 12: Auswirkung der Verwendung verschiedener Monolayer auf den Kulturerfolg von bovinen Embroynen (GORDON 1994)

Verwendeter Zellmonolayer B¹⁾ [%]

Ohne 13,2

Granulosa 37,2

Ovidukt 31,7

Uterus 26,1

Granulosa + Ovidukt 32,5

Granulosa + Uterus 32,7

Ovidukt + Uterus 30,3

Granulosa + Ovidukt + Uterus 33,4

1) B = Prozentsatz von Embryonen, die sich zu Blastozysten entwickelten

Bei Schafembryonen kann nach BAVISTER (1988) der „8-Zell-Entwicklungsblock“

vermieden werden, wenn sie mit einem Eileiterzellmonolayer oder sogar nur mit Fibroblasten kultiviert werden. Eileiterzellen sind in der Lage, PDGF zu produzieren, welches die Embryonalentwicklung zusätzlich stimuliert. Ältere Schafembryonen (8- bis 16-Zeller) entwickeln sich auch ohne Kokultur bei ausschließlicher Verwendung eines SOF (synthetic oviductal fluid)-Mediums weiter.

Bei Rinderembryonen können Eileiterepithelzellen die Entwicklung vom 5- bis 8-Zeller zur späten Morula oder zum Blastozysten in einem SOF-Medium unterstützen. Ohne Kokultur ist keine Entwicklung nach dem 8- bis 16-Zellstadium festzustellen.

Eileiterzellen produzieren somit Faktoren (s.o.), die für eine normale Entwicklung des Embryos erforderlich zu sein scheinen. Außerdem werden Komponenten, die für den Embryo schädlich sind, beseitigt (wie z.B. Sauerstoffradikale, Glukose).

Fibroblastenzellen können zwar in der Reduktion der Sauerstoffspannung effektiv sein, was zu einer verbesserten Embryonalentwicklung führt, sie sollen aber nicht in der Lage sein, embryotrophe Faktoren zu sezernieren (BAVISTER 1988).

Es ist jedoch nicht immer nötig, eine Kokultur zu betreiben. So sind laut GORDON (1994) Medien, welche mit Eileitergewebe konditioniert wurden, genauso effektiv für die Kultur von Rinderembryonen von der Zygote bis zum Blastozystenstadium wie eine Kokultur.

Durch den Gebrauch von konditionierten Medien können nach GORDON (1994) ebenso Rinderembryonen von guter Qualität produziert werden, wobei die Risiken einer Kontamination mit Viren (v.a. BVD) im Vergleich zur Kokultur reduziert sind. Es erreichten in etwa gleiche Prozentsätze an Embryonen das Blastozystenstadium bei Verwendung von Medien, die mit Eileiterzellen (BOEC) konditioniert wurden (32%), wie bei dem Standard-BOEC (Bovine Oviductal Epithel Cell)-Monolayersystem (28%).

Ein mit bovinem Serumalbumin supplementiertes CZB-Medium (mit niedriger Osmolarität, ohne Glukose, reich an Laktat oder Glutamin) ist nach Konditionierung mit BOEC-Zellen dem M-199 Medium überlegen.

Bei der Kultivierung in einem mit BOEC-konditionierten Medium zeigte sich jedoch eine geringere ICM-Zellzahl der Embryonen als bei Kultivierung mit einem BOEC-Monolayer.

Ein ungünstiger Effekt bei Nutzung von konditionierten Medien ist, dass ihnen essentielle Fettsäuren fehlen. Die Ursache dafür liegt darin begründet, dass das Kulturmedium zum Schutz vor Austrocknung mit Silikonöl überschichtet ist, welches die für die Blastozystenformation essentiellen Fettsäuren absorbieren soll. In einer Kokultur geben die Zellen kontinuierlich Lipide in das Kulturmedium ab, die somit ständig zur Verfügung stehen.

Ebenso ist es möglich, ein Medium mit Blastozysten zu konditionieren. So war der Prozentsatz früher boviner Embryonen, die sich zu Blastozysten entwickelten, deutlich höher bei Verwendung von BCM (blastozyst conditioned medium) als ohne Konditionierung (Tab.13).

Tabelle 13: Wirkung eines mit Blastozysten konditionierten Mediums auf den Kulturerfolg von Rinderembryonen (GORDON 1994)

Behandlung B¹⁾ [%]

Kontrolle ohne BCM 48,1 Kultur in BCM ab Tag 3 55,6 Kultur in BCM ab Tag 0 59,3

n = 349 Embryonen pro Versuch

1) B = Prozentsatz an Zygoten, die sich zu Blastozysten entwickelten

4.2.3 Milieubedingungen bei der in vitro Kultur 4.2.3.1 Temperatur

Der Embryo erweist sich in der Kultur als sehr empfindlich gegenüber Temperaturschwankungen. Beim Rind sind höhere Teilungsraten bei 37° C festzustellen als bei 39° C (GORDON 1994). Warum trotzdem standardmäßig mit einer Temperatur von 39° C gearbeitet wird, lässt sich nicht aus der Literatur entnehmen (KRÄUSSLICH und BREM 1997).

4.2.3.2 Gaszusammensetzung, pH-Wert, Puffer

In Embryonenkulturen mit Serum und/oder Kokultur ist es laut GORDON (1994) vorteilhaft für die Entwicklung, die Sauerstoffspannung von 20% auf 5% zu reduzieren und zuverlässige Chelatbildner zuzufügen (z.B. 5 µM EDTA). In herkömmlichen Systemen wird mit 5% CO2 gearbeitet, dabei herrscht ein pH-Wert von über 7,4. Auch hier ist eine Sauerstoffspannung von 5% gegenüber 20% vorzuziehen. Der stimulierende Effekt von CO2 ist laut BAVISTER (1988) durch seine Funktion als permanente schwache Säure bedingt, was eine Reduktion des intrazellulären pH-Wertes bewirkt.

Die verschiedenen Systeme (10 % CO2 in Luft, 5% CO2, 5% O2, 90% N2 und 5% CO2, 10% O2, 85% N2 ) sollen sich nicht als vorteilhafter gegenüber konventionellen 5%

CO2 in der Luftgasphase erweisen (GORDON 1994).

Um die negativen Effekte von Sauerstoffradikalen auszugleichen, werden laut GORDON (1994) Schwefelkomponenten mit niedrigem Molekulargewicht (Thiole), wie z.B. ß-Mercaptoethanol und Cysteamin verwendet. Diese Supplementation führt zu einer Zunahme des intrazellulären Glutathions, welches in der Lage ist, die Sauerstoffradikale zu beseitigen. Dadurch kommt es wiederum zu einer Steigerung der Blastozystenentwicklungsrate (GORDON 1994).

Es zeigt sich auch, dass z.B. Kaninchenzygoten in einem makromolekülfreien Medium eine schnellere Entwicklung haben, wenn mehrere geeignete Antioxidantien zum Medium gegeben werden. Hier ermöglichen Taurin und Superoxid-Dismutase eine beschleunigte Entwicklung zu expandierten Blastozysten. Die effektivste Sauerstoffkonzentration für die Kultur von Kaninchenzygoten bis zur geschlüpften Blastozyste liegt bei 5% (GORDON 1994).

Sauerstoffradikale werden auch für die Blockierung der Entwicklung im 2-Zellstadium von Mäuseembryonen verantwortlich gemacht. Das hat sich laut RIEGER (1992) und GORDON (1994) durch die Beobachtung bestätigt, dass die Blockade weitgehend aufgehoben wurde, wenn eine Supplementation mit Superoxid-Dismutase oder reduziertem Glutathion stattfand. Außerdem soll die Kultivierung mit einer geringen Sauerstoffatmosphäre vor allem zwischen dem 1- und 2-Zellstadium positive Effekte auf die Entwicklung haben (GORDON 1994).

In proteinfreien Medien ohne Kokultur erhält man bei einer Sauerstoffspannung von 5% einen größeren Prozentsatz an bovinen Blastozysten als bei Verwendung einer höheren Sauerstoffspannung. Bei Benutzung von BRL (buffalo rat liver)-Zellen als Kokultur ist jedoch der Ertrag an Rinderembryonen bei der normalen atmosphärischen Sauerstoffspannung (20,8%) höher als bei 5% O2.

TAKAHASHI et al. (1999) haben in entsprechenden experimentellen Unter-suchungen festgestellt, dass die Entwicklung von bovinen Embryonen durch den Zeitpunkt einer Konzentrationsveränderung des Sauerstoffes beeinflusst wird. Sie haben an bestimmten Kultivierungstagen den Sauerstoffgehalt von 5 auf 20% gesteigert, bzw.

von 20 auf 5% gesenkt. Hierbei zeigte sich, dass eine Veränderung im

Sauerstoffgehalt vor allem zwischen den Tagen vier und sechs einen Einfluss auf die Entwicklung hat. Die höchsten Prozentsätze an Embryonen erreichten das Blastozystenstadium, wenn sie die ersten vier Tage in einer 5%igen Sauerstoffatmosphäre kultiviert wurden.

Nach MACHATY et al. (1998) sollen Schweineblastozysten in NCSU (North Carolina State University) 23 - Medium unter 20% O2 eine bessere Qualität bezüglich der Trophoektoderm- und Gesamtzellzahl haben als solche, die bei geringerer Sauerstoffspannung kultiviert werden.

Durch die Zugabe von Hyaluronsäure (0,5 mg/ml) werden nach EDWARDS et al.

(1998) die Zellen des Embryo vor reaktivem Sauerstoff geschützt und so die Entwicklungsfähigkeit von in vivo entstandenen Zygoten des Schweines zu Blastozystenstadien gesteigert (siehe auch Glykosaminoglykane). Durch Zusatz von Hyaluronsäure war der Prozentsatz an Embryonen, die sich zu Blastozystenstadien entwickelten, ab den Tagen 5 und 7 besser als ohne eine solche Ergänzung. Beim Rind führt gemäß EDWARDS et al. (1998) eine Zugabe von Hyaluronsäure zum Kulturmedium zu einer Produktion von zellreicheren Blastozysten (ICM- und Trophoektodermzellen) als ohne Hyaluronsäure.

Eine Supplementation mit ß-Mercaptoethanol kann laut ABEYDEERA et al. (1998) einen positiven Effekt auf die in-vitro-Kultur haben, ist aber abhängig von der Konzentration der Zulage. So kommt es bei einer Steigerung von 25 auf 50 µM ß-Mercaptoethanol zu einer reduzierten Blastozystenentwicklungsrate beim Schwein (ABEYDEERA et al. 1998; Tab. 14).

Tabelle 14: Effekt verschiedener ß-Mercaptoethanol-Konzentrationen während der in vitro Maturation auf die Zellzahl von Blastozysten des Schweines (ABEYDEERA et al. 1998)

ß-Mercaptoethanol

1) nach 144 h Kultivierungsdauer

ß-Mercaptoethanol ist vor allem bei hoher Sauerstoffspannung von Vorteil. Durch die Zugabe ß-Mercaptoethanol kommt es zu einer stärkeren Synthese von Glutathion, welches die Zelle vor Sauerstoffradikalen schützt (CAAMANO et al. 1998; Tab. 15).

Interessanterweise ist die Glutathionkonzentration in der Zelle bei einer Kultur mit 25 µmol ß-Mercaptoethanol/l größer als bei Verwendung von 50 µmol/l. Dies erklärt auch die reduzierte Entwicklung bei höheren Konzentrationen von ß-Mercaptoethanol beim Schwein in den Versuchen von ABEYDEERA et al. (1998).

Tabelle 15: Einfluss von ß-Mercaptoethanol auf den Kulturerfolg von Rinderembryonen unter Berücksichtigung unterschiedlicher Sauerstoffspannungen (CAAMANO et al. 1998)

ß-Mercapto-

1) B = Prozentsatz an Eizellen, die sich zu Blastozysten entwickelten

Die günstigen Effekte von ß-Mercaptoethanol und N-Acetyl-Cystein auf die in-vitro- Entwicklung und Glutathionsynthese von bovinen Embryonen werden auch von LEE et al. (1999) und GORDON (1994) betont. LEE et al. (1999) bewiesen, dass die Zugabe von ß-Mercaptoethanol zu einer höheren Anzahl an Blastozysten und geschlüpften Blastozysten führt. N-Acetyl-Cystein führt nur zu einem höheren Anteil an geschlüpften Blastozysten. Beide Stoffe sind jedoch in der Lage, die Glutathionsynthese des Embryonen zu verbessern (Tab. 16).

Tabelle 16: Der Effekt einer Zugabe von ß-Mercaptoethanol oder N-Acetylcystein auf den Kulturerfolg von bovinen Zygoten (LEE et al. 1999)

Anzahl Zygoten B¹⁾ [%] GB²⁾ [%]

KSOM + FCS 451 31,7 52,3

+ N-Acetylcystein 451 31,1 80,9

+ ß-Mercaptoethanol 449 49,4 78,6

1) B = Prozentsatz an Zygoten, die sich zu Blastozysten entwickelten

2) GB = Prozentsatz an Blastozysten, die sich zu geschlüpften Blastozysten entwickelten

Die Kapazität des 2-Zellembryos der Maus zur Regulation des pH-Wertes sind nach GARDNER (1998) eher gering. Spezifische Aminosäuren können jedoch als intrazelluläre pH-Puffer agieren. Diese Aminosäuren, wie z.B. Glycin, können wie ein intrazelluläres Zwitterion wirken, um pH-Fluktuationen zu minimieren. Bei einem pH von 6-7 liegen z.B. Taurin und Glycin als Zwitterionen vor. Vor der Kompaktierung hilft die Anwesenheit von nicht-essentiellen Aminosäuren (vor allem Glutamin) im Kulturmedium, die intrazellulären pH-Verschiebungen zu minimieren. Nach der Kompaktierung verlieren die Aminosäuren an Bedeutung, was die Regulierung des Säuren-Basen-Haushaltes betrifft (GARDNER 1998).

Die Entwicklung von 8-Zellstadien des Hamsters in vitro zeigt sich laut BAVISTER (1988) unbeeinträchtigt innerhalb eines pH-Bereiches von 6,5 bis 7,4 im Kulturmedium.

4.2.3.3 Osmolarität

Die Osmolarität des Kulturmediums kann das Wachstum der Embryonen beeinflussen. Werden Embryonen in so hohen Osmolaritäten wie im Eileiter vorkommend (im Extremfall bis 360 mosm/l) ohne Osmolyten inkubiert, ist die Entwicklung deutlich beeinträchtigt. Gerade bei Osmolaritäten von 280-310 mosm/l kann nach GARDNER (1998) ohne Zugabe von Aminosäuren und Ionen ein

„zellulärer Stress“ entstehen. Osmolyten sind Stoffe, die in der Lage sind, Ionen zu binden und deren osmotische Aktivität zu verhindern. Die Zugabe von Osmolyten in das Kulturmedium, wie z.B. Glycin, Glutamin, Taurin oder Betain, erlaubt auf diese Art auch bei höheren Osmolaritäten eine gute Embryonalentwicklung. Bei einer Osmolarität von 290-300 mosm entstehen mehr Blastozysten bei Verwendung von Osmolyten (im Vergleich zu einer Kultur ohne solche Stoffe; GARDNER 1998).

4.2.4 Energiequellen/-substrate

Die wichtigsten Nährstoffe für die Entwicklung von Präimplantations-Embryonen der Säugetiere sind nach GARDNER (1998) Kohlenhydrate und Aminosäuren. Sie sichern nicht nur die Energieversorgung, sondern schützen den Embryo auch vor

„zellulärem Stress“, welcher durch suboptimale Kulturbedingungen in vitro induziert wird. Embryonen von Hamster, Maus, Rind und Schaf haben bis nach der Kompaktierung der Morula nur eine limitierte Kapazität, Glukose zu verarbeiten.

Pyruvat, Laktat und Aminosäuren sind die bevorzugten Substrate zur Energieversorgung der Embryonen bis zum Stadium der Morula. Erst in der Zeit der Kompaktierung kommt es zu einer forcierten Glukoseaufnahme und einem höheren Glukoseverbrauch durch den Embryo (GARDNER 1998).

4.2.4.1 Kohlenhydrate

Während der frühen Teilungsphase wird nach RIEGER (1992) die Entwicklung von Embryonen durch Glukose, Hypoxanthin und Sauerstoff inhibiert, indem diese Substanzen die zelluläre Produktion von Sauerstoffradikalen steigern, welche auf verschiedene Art und Weise schädlich für die frühe Embryonalentwicklung sind.

Glutamin und Antioxidantien sind in der Lage, die Sauerstoffradikale zu entfernen und verbessern dadurch die weitere Entwicklung (RIEGER 1992).

Die Hemmung durch höhere Glukosekonzentrationen auf die Entwicklung kann z.B.

bei Rattenblastozysten durch Zugabe von Superoxid-Dismutase, Katalase oder Glutathionperoxidase reduziert oder sogar eliminiert werden (RIEGER 1992).

Das natürliche Vorkommen von Glukose in der Ovidukt- und Uterusflüssigkeit zeigt laut GARDNER (1998), dass deren Toxizität auf den Embryo in vitro generell als ein

„Artefakt“ angesehen werden muss.

Der Verbrauch von Glukose steht nach GARDNER (1998) unter der Kontrolle von spezifischen glykolytischen Regulatoren. Kontrolliert wird die Glykolyse über die Aktivität des Enzyms Phosphofruktokinase, welche durch das ATP-ADP-Verhältnis der Zelle beeinflusst wird. Ein weites ATP zu ADP Verhältnis hemmt das Enzym ebenso wie Zitrat. Diese Bedingungen existieren in frühen Embryonen. Wenn sich der Embryo zum Blastozystenstadium entwickelt, ändern sich die Verhältnisse und als Begleiterscheinung kommt es zu einer gesteigerten Glykolyse. Die glykolytischen

präsent. Glukose wird aber über den Pentosephosphatweg metabolisiert (GARDNER 1998).

Der Glukosemetabolismus soll während der Präimplantationsperiode zusätzlich vom Geschlecht der Embryonen abhängig sein. Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase ist zwar ein X-Chromosom-gebundenes Enzym und der limitierende Faktor in dem Pentosephosphatweg; aber überraschenderweise ist der absolute Glukose-metabolismus in männlichen Embryonen deutlich höher als in weiblichen. Eine Erklärung hierfür soll in dem schnelleren Wachstum der männlichen Embryonen liegen (RIEGER 1992 und KHURANA 1992).

SCHINI und BAVISTER (1988) bewiesen mit ihren Versuchen, dass sich 2-Zellembryonen des Hamsters in HECM-1 ohne Glukose deutlich häufiger zu 4-Zellstadien entwickelten als mit Glukose. Kein Embryo erreichte jedoch das 8-Zellstadium, wenn Glukose und Phosphate im Medium vorhanden waren. In einem

weiteren Experiment zeigte sich, dass die Entwicklung in einem HECM1-Medium mit Phosphat deutlich geringer war. Nur in HECM1-Medien ohne Phosphat kam es zu weiteren Teilungen (über den 8-Zeller hinaus). Desoxyglukose blockierte im Gegensatz zur Glukose die Entwicklung der Hamsterembryonen auch in Abwesenheit von Phosphat.

Da die 1-Zellembryonen des Hamsters sehr empfindlich gegenüber verschiedenen energieliefernden Substraten und -konzentrationen sind, wurde für sie durch McKIERNAN et al. (1991) ein optimiertes HECM entwickelt, das sogenannte

HECM-3. In den Versuchen war Pyruvat allein nicht in der Lage, die Entwicklung von 1-Zellembryonen des Hamsters zum 4-Zeller zu gewährleisten. Bei Verwendung von

Laktat als einziger Energiequelle entwickelten sich 14% der kultivierten 1-Zellstadien zur Morula oder Blastozyste. Der höchste Prozentsatz an Blastozysten konnte jedoch bei einer reduzierten Laktatkonzentration (<10 mM) mit gleichzeitiger Zugabe von entweder zwanzig Aminosäuren (s. HECM1, Tab. 72) oder 0,2 mM Glutamin verzeichnet werden. Die 2-Zellstadien des Hamsters können, im Gegensatz zu den oben beschriebenen 1-Zellstadien, nur mit Laktat bis zur Blastozyste kultiviert werden.

Bei Zugabe von zwanzig Aminosäuren und Laktat erreichten 70-75% der 2-Zellhamster das Blastozystenstadium. Glutamin kann ebenso als ausschließliche

Energie- und Stickstoffquelle für die Entwicklung vom 2-Zeller zur Morula/Blastozyste dienen. Dies ist jedoch in dem 1-Zellstadium des Hamsters noch nicht möglich.

Durch eine Zulage von Pyruvat kann die Entwicklung von 2-Zellhamstern nicht gesteigert werden. Die meisten 1-Zellembryonen des Hamsters entwickeln sich aber zu Blastozysten bei Konzentrationen von 0,25 mM Pyruvat und 3,5 mM Laktat sowie 0,2 mM Glutamin.

Embryokulturmedien vom Rind basieren laut GORDON (1994) häufig auf Krebs-Ringer-Bikarbonat Salzlösungen mit den Energiequellen Pyruvat, Glukose und Laktat.

Fehlt Glukose im Kulturmedium (M-199 + 2% FCS) während der frühen Phasen der Embryonalentwicklung, kommt es aber wie beim Hamsterembryonen zu einer verbesserten weiteren Entwicklung. Glukose wird demnach laut GORDON (1994) und GARDNER (1998) erst in späteren Stadien (Morula/Blastozyste) wichtig.

Das Vorhandensein von Glukose in einem semidefinierten Medium (M-199 mit BSA, Laktat und Pyruvat) hemmt laut GORDON (1994) die frühen Entwicklungsstadien von Rinderembryonen, insbesondere im 8-Zellstadium. Fünf Tage nach der in-vitro-Fertilisation (16-Zellstadien) wird die Entwicklung zu Blastozystenstadien durch eine Glukose-Zulage verbessert. Die Zugabe von Glukose zu einem Pyruvat/Laktat-Medium in der Zeit der Kompaktierung unterstützt bei Mäusen den Übergang von der Morula zur Blastozyste; ist keine Glukose vorhanden, sollen sich die Embryonen nicht über das Morulastadium hinaus entwickeln.

Beim Schaf wird Glukose erst nach dem 16-Zellstadium als Energiequelle bedeutsam.

Die Zunahme der Glukoseaufnahme nach diesem Stadium kann nach GORDON (1994) auf die Abnahme des ATP/ADP-Verhältnisses zurückgeführt werden. In einem modifizierten CZB-Medium mit Glutamin können sich Schafembryonen auch ohne Pyruvat, Laktat und Glukose zu Blastozystenstadien entwickeln (GORDON 1994).

Glukose ist also nach GORDON (1994) nicht essentiell für die Entwicklung von Schafembryonen, eine Supplementation in niedrigen Konzentrationen soll aber förderlich sein. Höhere Glukosekonzentrationen könnten die Entwicklung der Schafembryonen durch die Hemmung des Zitratzyklus behindern. Von welchen Glukosegehalten GORDON (1994) ausgeht, ist allerdings nicht näher erläutert.

Die Supplementation von Glukose hemmt jedoch nach KHURANA (1992) generell die Entwicklung von 1- zu 2-Zellembryonen des Schafes, wobei aber in Anwesenheit von Carbonsäuren (R-OOH; z.B. Ameisen- oder Essigsäure) niedrige Glukosegehalte einen förderlichen Effekt haben.

Der Glukosestoffwechsel nimmt laut RIEGER (1992) und GARDNER (1998) bei Mäusen, Schweinen und Schafen deutlich vom 2-Zeller bis zur Blastozyste zu.

Schweineembryonen metabolisieren jedoch vor dem 8-Zellstadium kaum Glukose.

Zwischen dem 2-Zell- und dem expandierten Blastozystenstadium von Rindern kommt es nach RIEGER (1992) zu einem 15-fachen Anstieg in der Fähigkeit, Glukose über den Pentosephosphatweg zu metabolisieren. Ebenso ist in dieser Zeit ein 30-facher Anstieg des absoluten Glukosemetabolismus festzustellen. Allein in der Zeit der Entwicklung von der Morula zur expandierten Blastozyste verdoppelt sich der absolute Glukoseumsatz. Die Steigerung des Glukosemetabolismus geschieht dabei schrittweise (Ausnahme Pferd: lineare Zunahme).

Bei Embryonen von Schweinen, Schafen und Rindern ist laut RIEGER (1992) die erste messbare Zunahme im Glukosemetabolismus um die Zeit der Aktivierung des embryonalen Genoms zu beobachten. Dieses geschieht nach KRÄUSSLICH (1994) bei den bovinen und ovinen Embryonen zwischen dem 8- und 16-Zellstadium, wobei sie aber bis zum 12-Zellstadium sehr wenig Glukose verbrauchen. Bei Schweine-embryonen kommt es zwischen dem 4- und 8-Zellstadium zur Aktivierung des embryonalen Genoms und bei Pferdeembryonen zwischen dem 8- und 16-Zell-stadium. Der Mäuseembryo scheint nach RIEGER (1992) eine Ausnahme zu sein,

Bei Embryonen von Schweinen, Schafen und Rindern ist laut RIEGER (1992) die erste messbare Zunahme im Glukosemetabolismus um die Zeit der Aktivierung des embryonalen Genoms zu beobachten. Dieses geschieht nach KRÄUSSLICH (1994) bei den bovinen und ovinen Embryonen zwischen dem 8- und 16-Zellstadium, wobei sie aber bis zum 12-Zellstadium sehr wenig Glukose verbrauchen. Bei Schweine-embryonen kommt es zwischen dem 4- und 8-Zellstadium zur Aktivierung des embryonalen Genoms und bei Pferdeembryonen zwischen dem 8- und 16-Zell-stadium. Der Mäuseembryo scheint nach RIEGER (1992) eine Ausnahme zu sein,

Im Dokument Die Ernährung von Embryonen bis zum Blastozystenstadium (Seite 26-56)