In vitro Kultur humaner Embryonen unter vibrotaktiler. Sonja Traunfellner

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In vitro Kultur humaner Embryonen unter vibro- taktiler Stimulation

eingereicht von

Sonja Traunfellner

Mat.Nr.:

0505481

zur Erlangung des akademischen Grades

Master of Science M.Sc. (Clinical Embryology) im Rahmen des Universitätslehrganges

Klinische Embryologie

an der Karl-Franzens Universität Graz

ausgeführt am

Kinderwunschzentrum Goldenes Kreuz, Wien

unter der Anleitung von Betreuer

Prof. Dr. rer. nat. Markus Montag

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Ehrenwörtliche Erklärung

Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne fremde Hil- fe verfasst, andere als die angegebenen Quellen nicht benutzt und die den Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe. Die Arbeit wurde bisher in gleicher oder ähnlicher Form keiner anderen inländischen oder ausländischen Prü- fungsbehörde vorgelegt und auch noch nicht veröffentlicht. Die vorliegende Fassung ent- spricht der eingereichten elektronischen Version.

15.11.2012 Unterschrift

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Nietzsche

An dieser Stelle möchte ich meinen herzlichsten Dank an jene Personen richten, die mir während der gesamten Dauer meines Masterstudiums tatkräftig zur Seite gestanden sind.

So gilt mein spezieller Dank meinen Kolleginnen Simone Stadlbacher, Maria Thöni, Johanna Wolf, Nicole Ferstl und Heike Peball, die mich während des Studiums und im Speziellen während der Erstellung meiner Masterthesis in höchstem Maße motiviert und unterstützt haben.

In dieser Zeit war mir besonders Martina Wöber eine Quelle der Kraft und Inspiration. Sie hat mit ihren konstruktiven Ideen und ihrer Hilfsbereitschaft und Erfahrung einen wesentlichen Beitrag zum Erreichen meiner persönlichen Ziele beigetragen.

Ebenso bedanke ich mich von Herzen bei den beiden ärztlichen Leitern des Kinderwunsch- zentrums Goldenes Kreuz Univ.Prof.Dr. Andreas Obruca und Univ.Prof.Dr. Heinz Strohmer, die mich nicht nur finanziell unterstützt haben, sondern auch die Ressourcen, die für das Absolvieren des Masterlehrgangs für klinische Embryologie nötig waren, bereitgestellt haben.

Ich möchte weiters meinen Dank an das Embryologenforum Austria richten, die durch ein Stipendium wesentlich an der Finanzierung meines Studiums beteiligt waren.

Für die ausgezeichnete Betreuung und den tatkräftigen Support von Prof. Dr. rer. nat. Mar- kus Montag und Univ.Doz. Mag.Dr. Thomas Ebner speziell während des Verfassens meiner Masterthesis möchte ich ebenfalls meinen herzlichsten Dank aussprechen.

Besonders bedanken möchte ich mich jedoch bei meiner Familie und meinen engsten Freunden, die mir in jeder Lebenslage zur Seite stehen.

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Der Embryo ist unter natürlichen Bedingungen im Mutterleib permanenten dynamischen Sti- muli ausgesetzt, die beispielsweise durch die Peristaltik der Tube und die Zilien des

Flimmerepithels erzeugt werden. Speziell in den ersten fünf Tagen nach Ovulation sind somit Reibung und Bewegung ein fixer Bestandteil der Mikroumgebung des Embryos. Mit dem Bestreben einer möglichst physiologischen in-vitro Kultur gibt es demzufolge Ansätze, diese physikalischen Phänomene in das IVF Labor zu integrieren. Es wird vermutet, dass durch den Einsatz von Bewegung ein Abtransport von Schadstoffen sowie eine optimale Versor- gung mit frischen Nährstoffen gewährleistet wird, mit dem Ziel, die embryonale Entwicklung zu begünstigen. So konnten bereits durch Methoden wie Microfunnel oder durch den Einsatz von Wippen oder Vibrationen vorteilige Effekte hinsichtlich der Embryonalqualität und teilweise auch Erhöhungen der Schwangerschaftsrate gefunden werden. Diese aufwendigen und kostspieligen Methoden verhindern jedoch den routinemäßigen Einsatz im IVF-Labor ebenso wie die Tatsache, dass diese Methoden für kommerzielle Benchtop-Inkubatoren nicht anwendbar sind. In dieser Studie wurden die Eizellen von 20 Patientinnen jeweils in eine Studien- und eine Kontrollgruppe unterteilt und in zwei verschiedenen Benchtop- Inkubatoren kultiviert. Neben jedem Schälchen wurde ein Lautsprecher platziert, der bei der Kontrollgruppe auf „Mute“ und bei der Studiengruppe auf volle Lautstärke gestellt war. Wäh- rend der gesamten Dauer der in-vitro Kultur wurde in einem Intervall von 20 Minuten für jeweils eine Minute ein Ton mit einer Frequenz von 432 Hz abgespielt. Diese Beschallung erfolgte während der gesamten Dauer der in-vitro Kultur. Nach Auswertung konnten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich des Entwicklungspotentials in Studien- und Kontrollgrup- pe gefunden werden.

Der Einsatz von Schallwellen in der in-vitro Kultur humaner Embryonen ist, neben den oben genannten Ansätzen die Embryonalkultur physiologischer zu gestalten, neu und eine in den Routinebetrieb einfache zu integrierende Methode. Es wurde nachgewiesen, dass ein Ein- satz von Schallwellen mit entsprechenden Instrumentarien zumindest keinen nachteiligen Effekt mit sich bringt. Um weitere Aussagen zu treffen, sind Folgestudien mit Verwendung von beispielsweise anderen Frequenzen mit einem homogenen Studienkollektiv sinnvoll und in Planung.

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Under natural conditions the embryo is continously exposed to dynamic stimuli generated by the peristaltic movement of the tuba uterina and the ciliated epithelium. Especially the first five days after ovulation friction and movement are an integral part of the micro environment of the embryo. In order to provide physiological conditions in the in-vitro culture there have been attempts to integrate these physical phenomena in the IVF laboratory. It is believed that through these movements the removal of pollutants and the optimal supply of fresh nutriants is ensured, subsequently having a positive effect on embryo development. Former studies have shown that the use of methods like the Microfunnel or the use of paddles or vibration resulted in better embryo quality and in increased pregnancy rate. The complexity and high cost of these methods, however, as well as the fact that these methods are not applicable in commerical benchtop-incubators prevent the routine use in the common IVF laboratory. In the present study, the oocytes of 20 patients were divided into a study group and a control group and cultivated in two different benchtop-incubators. A small speaker was placed next to each culture dish, which, in the control group was set on 'mute' whereas in the study group was turned to full volume. Throughout the whole duration of cultivation, at an interval of twen- ty minutes, a single tone with a frequency of 432 Hz was played for one minute. The evalua- tion of the results showed no significant difference regarding embryo development between study group and control group.

The use of soundwaves in in-vitro culture of human embryos is a new attempt to provide physiological conditions for the embryo and is a method that can be easily integrated in routine laboratories. It was clearly established that the application of acoustic waves with appro- piate instruments does not have a negative effect on the embryo. To make further conclusi- ons follow-up studies, for example using different frequencies, and a more homogenous pa- tient collective will be necessary.

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Inhaltsverzeichnis ... 1

Abbildungsverzeichnis ... 2

1 Einleitung ... 5

1.1 Die Bedeutung der Tuba uterina für die Entwicklung von Embryonen ... 5

1.2 Bewegte Embryonalkultur ... 6

1.3 Erzeugung von Vibration durch Schallwellen ... 8

1.4 Forschungsfrage und Hypothese ... 9

2 Material und Methoden ...13

2.1 Patientenkollektiv ...13

2.2 Ablauf der Embryonalkultur unter vibrotaktiler Stimulation ...13

2.3 System zur Wiedergabe des Tons ...15

2.4 Präklinische Studien zum Ausschluss einer möglichen Toxizität der verwendeten Materialien und Methoden ...16

2.4.1 Sperm-Survival-Test ...16

2.4.2 In-vitro Kultur pathologisch befruchteter Eizellen unter vibrotaktiler Stimulation ...17

2.5 Statistische Auswertung ...18

3 Ergebnisse ...19

3.1 Sperm-Survival Test ...19

3.2 Präklinische Studie an pathologisch befruchteten Eizellen ...20

3.3 Embryonalentwicklung unter vibrotaktiler Stimulation ...20

4 Diskussion ...27

Literaturverzeichnis ...31

Internetquellen ...33

Anhang ...34

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Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Microfunnel Systems ... 7

Abbildung 2: Benchtopinkubator MINC™ (Cook, Limerick, Irland) ...10

Abbildung 3: Wasserbewegungen bei 432 Hz ...11

Abbildung 4: Wiedergabesystem ...15

Abbildung 5: Platzierung von Kulturschälchen und Lautsprechern im MINC ...16

Abbildung 6: 4-Zellrate, Morulabildungsrate, Blastulationsrate ...22

Abbildung 7: Embryonalqualität am Tag 3 ...23

Abbildung 8: Embryonalqualität am Tag 5 ...24

Abbildung 9: Utilisationrate ...25

Abbildung 10: Dokumentationsblatt einer Studienpatientin ...26

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Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Ergebnisse des Sperm-Survival Tests ...19 Tabelle 2: Übersicht der Ergebnisse ...21 Tabelle 3: Technische Daten des verwendeten LautsprechersLLLLLLLLLLL. 41 Tabelle 4: Unterteilung der Embryonen am Tag 3 in drei Qualitätsstufen ...42 Tabelle 5: Unterteilung der Blastozysten in 3 Qualitätsgrade ...43

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Abkürzungsverzeichnis

COCLLLLLLLLL.... Cumulus-Oozyten-Komplex ICMLLLLLLLLLL... Innere Zellmasse

ICSILLLLLLLLLL.. Intrazytoplasmatische Spermieninjektion IVFLLLLLLLLLL.... In-vitro Fertilisierung

IVMLLLLLLLLLL... In-vitro Maturation MINCLLLLLLLL... Mini-Inkubator

sERLLLLLLLLLL.. Smooth endoplasmatic reticulum TELLLLLLLLLLL. Trophektoderm

TESELLLLLLLLLL Testikuläre Spermienextraktion WHOLLLLLLLL... World Health Organisation

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1 Einleitung

Die in-vitro Kultur humaner Embryonen stellt seit Anbeginn der assistierten Reproduktion eine große Herausforderung dar. Obwohl im Bereich der Optimierung der Kulturbedin- gungen in den letzten Jahrzehnten große Fortschritte erlangt werden konnten, ist jedes Erzielen einer Schwangerschaft durch Befruchtung außerhalb des Körpers eher der Fä- higkeit des Embryos, sich an die suboptimalen Konditionen in vitro anzupassen, zuzu- schreiben, als der Fähigkeit des Embryologen oder der Embryologin, ihn zu kultivieren.¹ Betrachtet man den natürlichen Weg des Embryos durch die verschiedenen Abschnitte des Eileiters bis hin zum Uterus, sind dramatische Veränderungen an der Physiologie des Embryos, dessen Bedarf an Nährstoffen und deren Bereitstellung durch den weiblichen Reproduktionstrakt innerhalb dieser frühen Phase der Embryonalentwicklung erkennbar.

Dadurch erklärt sich die Erfordernis eines Kulturmediums, das in Bezug auf seine Zu- sammensetzung den physiologischen Bedingungen möglichst ähnlich ist.² Dieser Hinter- grund führte beispielsweise zur Entwicklung sequentieller Medien, die dem Embryo in seinen verschiedenen Entwicklungsstadien die jeweils richtige Konzentration an Nährstof- fen bereitstellen sollen.³ Um sich noch mehr den physiologischen Gegebenheiten zu nä- hern gibt es weitere Strategien, die die natürliche Mikroumgebung des Embryos in der Tube auf zellulärer Ebene mit einbeziehen.

1.1 Die Bedeutung der Tuba uterina für die Entwicklung von Embryonen

Die Tuba uterina ist ein dem weiblichen Reproduktionstrakt zugehöriges Organ, das wäh- rend der frühen Embryonalentwicklung komplexe Aufgabenbereiche übernimmt. Die Mu- cosa der Tube ist in longitudinale Falten gelegt, welche zum distalen Ende hin immer stärker gewunden sind und das Lumen beinahe zur Gänze ausfüllen. Das einschichtige Epithel beinhaltet Flimmer- und Drüsenzellen, die in den verschiedenen Abschnitten je nach Zyklusphase in unterschiedlichem Verhältnis vorkommen. Ebenso ist eine Muskel- schicht vorhanden, die peristaltische Kontraktionen für beispielsweise den Keimzelltrans- port erzeugen kann.⁴ Eine grundlegende Aufgabe des Eileiters ist die Aufnahme des Cu- mulus-Oocyten-Komplexes (COC) im Bereich des Infundibulums und die Aufnahme von

1 Vgl. Gardner, D.K./Lane, M. (2004), S. 211

2 Vgl. Mercader, A./Valbuena, D./Simón, C. (2006), S. 8

3 Vgl. Gardner, D.K./Lane, M. (2004), S. 2017

4 Vgl. Hartmann, M./Pabst, M.A./Dohr, G. (2011), S. 101

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6 Samenzellen im Isthmus. Der Übergang des Uterus in den Eileiter übernimmt hierbei zu- sätzlich die Funktion einer Barriere zur Spermienselektion. In weiterer Folge werden die simultane Kapazitation und Hyperaktivierung durch das Gewebe der Tube unterstützt.⁵ Aber auch der aktive Transport von COCs, Embryonen und Samenzellen ist eine der Hauptaufgaben. Das Schlagen der Zilien, Kontraktionen der glatten Muskulatur und der Fluss des tubalen Sekrets bilden hierbei die Mechanismen zur Beförderung des Embryos in den Uterus.⁶ Die Bewegungsmuster der Zilien selbst und die ähnliche Größe des Lu- mens von Ampulle und Isthmus der Tube und dem Durchmesser des Embryos lassen vermuten, dass die befruchtete Eizelle durch das Einwirken von Kompressionen und Scherkräften zusätzliche entwicklungsfördernde Stimuli erhält.⁷ Die Frequenz der durch die Zilien des Tubenepithels erzeugten Vibrationen konnte im Bereich 5-20Hz determiniert werden.⁸ Diese Annahmen legitimieren das Bestreben dynamische Faktoren in die bisher übliche statische Embryonalkultur aufzunehmen um sich ein weiteres Stück an die natürli- chen Bedingungen im Mutterleib anzunähern. Verschiedene Methoden wurden bisher hauptsächlich im Tiermodell, teilweise aber auch an humanen Embryonen getestet.

1.2 Bewegte Embryonalkultur

Der Ansatz der bewegten Zellkultur wurde in den vergangen Jahren bereits von mehreren Forschungsgruppen aufgegriffen. Die ersten Versuche hierzu resultierten in der Entwick- lung von Microfluidic Systemen, die das Kulturmedium zirkulieren ließen um so den Emb- ryo stetig mit frischen Nährstoffen zu versorgen und gleichzeitig Schadstoffe abzutrans- portieren. Der methodische Zugang dazu war die Platzierung von Embryonen in einem Mikrokanal, durch den das Kulturmedium gepumpt wurde.⁹ Dieser kontinuierliche Flüssig- keitstransport führte jedoch erst zu schlechterer Embryonalentwicklung, was dem durch Scherkräfte erzeugten Stress und dem Abtransport autokriner wachstumsfördernder Fak- toren zugeschrieben wurde.¹⁰Xie et al. (2006) haben mittels Rotation eines Microdroplet Kultursystems ohne Microfluidic-Technik sogar feststellen können, dass durch Scherkräfte von 1,2 dyn/cm² sogar Zelltod induziert werden kann. Dieser Wert liegt jedoch bedeutend höher als es unter physiologischen Bedingungen vorkommt.¹¹ Eine erneute Überarbeitung

5 Vgl. Besenfelder, U./Havlicek, V./Brem, G. (2012), S.156

6 Vgl. Kölle, S./Reese, S./ Kummer, W. (2010), S. 792

7 Vgl. Matsuura, K. et al. (2010), S. 359

8 Vgl. Paltieli, Y. et al. (1995), S. 1641

9 Vgl. Minseok, S.K. et al. (2009), S. 3277

10 Vgl. Hickman, D.L. et al. (2002) S. 124

11 Vgl. Xie, Y. et al. (2006), S. 53

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7 dieser Methodik führte zur Entwicklung des Microfunnel Systems, das sich durch die Plat- zierung des Embryos in einer trichterförmigen Vertiefung zum Microfluidic System unter- scheidet. Die Zirkulation des Kulturmediums wird hierbei durch einen Kanal erreicht, der an der Unterseite der Vertiefung vorbeiführt.¹² Folgende Abbildung visualisiert den Aufbau dieses Systems.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Microfunnel Systems Quelle: Grafik erstellt durch die Verfasserin

Mit Hilfe dieses Microfunnel Systems konnten Heo et al. (2010) nicht nur die Embryonal- qualität, gemessen an der Zellzahl der Blastozysten, sondern auch die Implantations- und Schwangerschaftsraten bei Mäusen signifikant steigern.¹³ Für den routinemäßigen Gebrauch müsste dieses komplexe System jedoch drastisch vereinfacht werden. Eine weitere Möglichkeit das Kulturmedium in Bewegung zu versetzen ist beispielsweise die Verwendung einer Wippe. So haben Koike et al. (2010) den meiotischen Reifungsprozess und die Entwicklung bis hin zur Blastozyste in einem dynamischen versus einem statischen Kultursystem untersucht. Hierfür wurden direkt aus dem Ovarialgewebe des Schweins gewonnene COCs für In-vitro Maturation (IVM) mit anschließender IVF und Blastozystenkultur verwendet und entweder in einem Schälchen inkubiert, das wie üblich während der Kulturdauer statisch im Inkubator oder aber auf einer Wippe stand. Die Wip- pe wurde hierfür darauf programmiert einen Neigungswinkel von 20° einzunehmen, diesen für eine Minute zu halten und sich dann innerhalb von zwölf Sekunden zur anderen Seite im selben Winkel zu neigen. In dieser Studie konnten signifikante Verbesserungen der Expansion der COCs nach IVM und eine signifikante Erhöhung der Zellzahl der Blastozysten gefunden werden.¹⁴ Eine andere Methode um die Embryonalkultur in Bewe-

12 Vgl. Heo, Y.S. (2010), S. 614

13 Vgl. Heo, Y.S. (2010), S. 616f

14 Vgl. Koike, T. et al. (2010), S. 553f

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8 gung zu versetzen ist der Einsatz von Vibration. Isachenko et al. (2010) konnten mittels dieses Verfahrens eine drastische Erhöhung der embryonalen Entwicklungsfähigkeit feststellen. Die untersuchten Embryonen wurden dabei in einem einstündigen Intervall für jeweils fünf Sekunden einer Vibration mit einer Frequenz von 20 Hz ausgesetzt. Es ergab sich aus den Daten dieser Studie eine Erhöhung der Schwangerschaftsrate um 30% am Tag 3 und um 37% am Tag 5 beim Transfer von Embryonen aus der Gruppe der dynamischen Kultur.¹⁵

1.3 Erzeugung von Vibration durch Schallwellen

Ein alternativer Weg ein Kultursystem, oder genauer das Kulturmedium, in Bewegung zu versetzen, ist der Einsatz von Schall. Schallwellen in den unterschiedlichsten Frequenzen werden schon seit Langem zu medizinischen Zwecken verwendet. Das wohl bekannteste Einsatzgebiet findet sich in der Ultraschalldiagnostik. Aber auch zu therapeutischen Zwe- cken wird Schall immer häufiger eingesetzt, so entstand beispielsweise die Sparte der Musiktherapie, die sich durch den gezielten Einsatz musikalischer Mittel der Erhaltung und Wiederherstellung körperlicher und geistiger Gesundheit widmet. So kann exempla- risch gesehen durch die gezielte Verwendung von Musik der Stresshormonspiegel sowie der Sauerstoffverbrauch, die Herzfrequenz, der Blutdruck oder aber auch das Schmerz- empfinden gesenkt werden.¹⁶ Über die Wirkungsweise von Schallwellen auf zellulärer Ebene ist jedoch noch wenig bekannt. Pabst (2010) verfolgte diesen Ansatz und gewann Endothelzellen aus den Arterien humaner Plazenten, kultivierte diese in zwei Gefäßen und platzierte je eine Peter Hess-Therapieklangschale (Typ: Herzschale) auf den beiden Gebinden. Eine der beiden Klangschalen wurde innerhalb von drei aufeinanderfolgenden Tagen je eine Stunde pro Tag in Schwingung gebracht, die andere Klangschale wurde zum Vergleich nicht angeschlagen. Anschließend an diese Behandlung wurden die Endo- thelzellen sowohl morphologisch via Phasenkontrasmikroskopie wie auch quantitativ mittels Casy Cell Counter untersucht. Obwohl keine morphologischen Unterschiede erkennbar waren, konnten in der Zellpopulation der beschallten Probe signifikante Erhöhungen der Gesamtzellzahl (p=0,026) und der Anzahl an viablen Zellen (p=0,017) gefunden werden. Dieses Ergebnis legt die Vermutung nahe, dass durch die Beschallung die Teilungs- rate gesteigert und die Sterberate gesenkt wird.¹⁷ Diese Studie zeigt, dass auch durch Schallwellen induzierte Vibrationen vergleichbare positive Effekte wie in der bewegten Zellkultur bewirken können.

15 Vgl. Isachenko, E. et al. (2010), S. 570ff

16 Vgl. Kraus, W. (2011), S. 35

17 Vgl. Pabst, M.A. (2010), S. 25ff

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9

1.4 Forschungsfrage und Hypothese

Die obig erwähnten Versuche ein Kultursystem, speziell in Hinsicht auf Embryonalkultur, in Bewegung zu versetzen, um die physiologischen Bedingungen in der Tuba uterina zu imitieren, verlangen zur Gänze spezielle Apparaturen, auf denen die Kulturschälchen platziert werden, oder sogar eigens generierte Schälchen. Dieser beträchtliche Aufwand ist für den Routinebetrieb eines IVF-Labors kaum zu bewerkstelligen, speziell wenn Benchtop-Inkubatoren zur Kultivierung der Embryonen verwendet werden. Das Prinzip von Benchtop-Inkubatoren besteht in einer Minimierung des inneren Volumens durch ein spezielles Design bei dem die Kulturschälchen direkt der beheizten Fläche aufliegen und die Türen des Inkubators nach oben geöffnet werden. Der große Vorteil dieser Art von Inkubatoren besteht in der schnellen Wiederherstellung der Betriebstemperatur nach dem Öffnen und Schließen. Ebenso kann unter Verwendung von Mischgas gearbeitet werden, da ein sehr geringer Gasverbrauch besteht. Abbildung 2 zeigt einen Benchtop-Inkubator der Firma Cook (MINC™, Cook, Limerick, Irland), welcher auch im Zuge dieser Studie zur Verwendung kam.

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10 Abbildung 2: Benchtop-Inkubator MINC™ (Cook, Limerick, Irland)

Quelle: Cookartlab [online]

Im Hinblick auf die Methodik der bewegten Embryonalkultur stellt dieser Typ von Inkuba- tor jedoch ein Hindernis dar, da er den Einsatz von Wippen oder Vibrationsplatten aufgrund der Dimension der Gerätschaften und des Innenraums des Inkubators unmöglich macht. Ein alternierender Weg um Bewegung zu erzeugen ist der Einsatz von Schallwel- len. Dies sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden.

Die Schallwelle an sich ist eine mechanische, longitudinale Welle, produziert durch schnelle Druckänderungen. Sie benötigt ein Ausbreitungsmedium, in dem sie sich abhän- gig von Temperatur und Dichte mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten fortsetzen kann.

So breitet sie sich beispielsweise in Wasser schneller aus als im Medium Luft. Die Fre- quenz einer Schallwelle bestimmt ihre Tonhöhe, die je nach Intensität vom menschlichen Ohr wahrgenommen werden kann. Was wir also als Ton hören, ist im Grunde eine durch Druckschwankungen erzeugte Welle, die das umliegende Medium in Schwingung ver- setzt.¹⁸ Auf diese physikalischen Grundsätze stützt sich der methodische Ansatz dieser Studie, in der eine bestimmte Schallwelle/Frequenz verwendet wird, um das Kulturmedi- um dermaßen in Schwingung zu versetzen, dass die darin befindlichen humanen Embry- onen durch die minimalen Bewegungen am Boden des Kulturschälchens reiben. Dadurch sollen Stimuli gesetzt werden, die die physiologischen Konditionen im Eileiter imitieren.

Die Forschungsfrage, die dieser Studie zugrunde liegt, ist demnach, ob durch das Abspie- len von Tönen innerhalb des Inkubators tatsächlich ein ähnlich positiver Effekt erzielt werden kann, wie Koike et al. (2010) durch die verbesserte Blastozystenqualität unter Ver-

18 Vgl. Physics [online]

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11 wendung einer Wippe fanden.¹⁹ Dass Schall tatsächlich in der Lage ist, Flüssigkeiten in Schwingung zu versetzen, soll anstehende Abbildung zeigen, auf der eine Schale mit Wasser abgebildet ist, die auf der Membran eines Lautsprechers während des Abspielens eines Tons platziert wurde.

Abbildung 3: Wasserbewegungen bei 432 Hz

Quelle: MagicAqua – Wasserklangbilder, Michael Memminger, Rosenheim, Deutschland

Auf den Einsatz eines ganzen Musikstückes wurde verzichtet, da dies aufgrund der Fülle an verschiedenen Frequenzen zu komplex wäre um ein reproduzierbares Ergebnis zu erzielen. Der Ton, der verwendet wurde, hat eine Frequenz von 432 Hz. Dies ist eine Fre- quenz im hörbaren Bereich, die knapp unter dem aktuell gängigen Kammerton von 440 Hz liegt. Es gibt im Bereich der klassischen Musik Bestrebungen, den Kammerton auf eine Frequenz von 432 Hz zu fixieren. Die Philosophie dahinter liegt in der Physiologie der Stimme und des Gehörs des Menschen. So war beispielsweise Guiseppe Verdi ein Verfechter dieses Kammertons. In seinen Opern wird weitestgehend die Frequenz 432 Hz verwendet um besonders entspannende Harmonien zu erzeugen.²⁰ Eine weitere Intention diesen Ton zu wählen, hat den Hintergrund, dass die Zahl 432 ein Vielfaches von Acht ist, welche auch die Frequenz der α-Wellen des menschlichen Gehirns ist. α-Wellen treten beim Menschen in Zuständen der Entspannung auf, wie beispielsweise kurz vor dem Ein- schlafen oder unmittelbar nach dem Erwachen.²¹ Es wird von Seiten der Autorin die Hypo- these aufgestellt, dass Schallwellen als dynamisches Element innerhalb eines Kultursys-

19 Vgl. Koike, T. et al. (2010), S. 554

20 Vgl. Omega432 [online]

21 Vgl. Medizinfo [online]

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12 tems soweit in das Entwicklungspotential humaner Embryonen eingreifen können, dass im Speziellen die Qualität von Blastozysten und Embryonen in Teilungsstadien gesteigert werden kann.

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2 Material und Methoden

2.1 Patientenkollektiv

An dieser Studie nahmen insgesamt 20 Paare teil, die sich im Zeitraum von Juni bis Ok- tober 2012 einer Kinderwunschbehandlung am Kinderwunschzentrum Goldenes Kreuz in Wien unterzogen. Hierzu waren die Einschlusskriterien männliche Subfertilität und eine Mindesteizellzahl von zehn, wobei diese anhand der Zahl der Follikel über 16mm zum Zeitpunkt der Ovulationsinduktion berechnet wurde. Auf Alter und einheitliche Stimulati- onsprotokolle wurde bei der Patientenrekrutierung keine Rücksicht genommen, da aus- schließlich qualitative Aspekte der Embryonalentwicklung vom Tag der Eizellentnahme bis inklusive Tag 5 zur Auswertung kamen. Die Unterteilung der Eizellen in Studien- und Kon- trollgruppe erfolgte innerhalb jedes einzelnen Eizellkollektivs einer Patientin, wodurch kein primärer Anspruch auf einheitliche hormonelle Stimulation entstand. Eine eingeschränkte Befruchtungsrate in vorangegangenen Behandlungszyklen (Befruchtungsrate unter 30%) oder die Gewinnung von Samenzellen für die ICSI durch TESE bildeten grundlegende Ausschlusskriterien. Paare mit höhergradiger Oligoasthenoteratozoospermie (<5% Kon- zentration; <20% progressiv bewegliche Samenzellen; <10% Normalformen nach WHO) am Tag der Follikelpunktion wurden ebenso exkludiert.

Morphologische Merkmale, die eine Qualitätseinschränkung der Eizellen vermuten ließen, wie beispielsweise prominente Vakuolen bei mehr als 25% der Eizellen oder das Vorhan- densein von glattem endoplasmatischen Retikulum (sER), trugen ebenso einen Aus- schluss aus der Studie zur Folge wie das Erreichen von Metaphase II bei weniger als 70%

der Eizellen oder eine Anzahl an Eizellen in Metaphase II unter 7.

Jedes Paar, das anhand der genannten Kriterien für diese Studie in Frage kam, wurde mittels eines Aufklärungsbogens über die Konditionen der Studie informiert. Nach Zu- stimmung des Paares wurde eine Einwilligungserklärung beider Partner unterschrieben, was bedeutet, dass auch eine Ablehnung dieser ein Ausschlusskriterium bildete.²²

Für die Durchführung dieser Studie wurde ein positives Votum der Ethikkommission der Landes- Frauen- und Kinderklinik Linz abgegeben .

2.2 Ablauf der Embryonalkultur unter vibrotaktiler Stimulation

Den Startpunkt der vibrotaktilen Stimulation bildete die ICSI. Zuvor wurden die gewonnen COC, wie routinemäßig so im IVF Labor des Kinderwunschzentrums Goldenes Kreuz praktiziert, in einer Vertiefung eines 4-well NUNC Schälchens mit 700µl G-IVF™ PLUS

22 Aufklärungsbogen und Einwilligungserklärung sind dem Anhang zu entnehmen

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14 (Vitrolife, Göteburg, Schweden) abgelegt. Die Kultur erfolgte in Benchtop-Inkubatoren (MINC™, Cook, Limerick, Irland) bei 37°C unter Mischgaszufluss (Spezifikation: 6,5%

CO2, 5%O2, 88,5%N2, Firma: Air Liquide, Wien). Nach Denudation wurden die Eizellen mikroskopisch auf ihren Reifegrad untersucht.

Nach dem Zufallsprinzip wurden die denudierten Eizellen in zwei Gruppen unterteilt und anschließend in zwei, bei Eizellanzahlen über 20 aber auch mehr, Durchgängen mittels ICSI befruchtet. Unmittelbar danach wurden sie in zwei Kulturschälchen mit jeweils 700µl G1™ v5 PLUS (Vitrolife, Göteburg, Schweden) abgelegt und in den für diese Studie prä- parierten MINCs über Nacht inkubiert. Während der gesamten Laufzeit der Studie wurden zwei MINCs für die vibrotaktile Stimulation verwendet, die, wie im weiteren Verlauf dieser Arbeit noch genauer beschrieben, mit Lautsprechern bestückt waren. Es wurden aus- schließlich die Vertiefungen 2 und 4 der 4-well NUNC Schälchen verwendet, um den Ab- stand zur Tonquelle möglichst gering zu halten.

Circa 18 Stunden nach ICSI wurden die Eizellen auf Vorkernbildung untersucht und im Anschluss in ein neues Schälchen, befüllt mit 500µl G1™ Medium und überschichtet mit 300µl Ovoil™ (Vitrolife), überführt. Eizellen, die zwei Vorkerne zeigten, wurden für die weitere Kultur in Gruppen in die Vertiefungen 2 und 4 abgelegt. Eizellen ohne Vorkerne oder mit nur einem Vorkern wurden in den restlichen Vertiefungen abgelegt, aber für die Auswertung der Ergebnisse nicht herangezogen, selbst wenn eine Entwicklung bis hin zum Blastozystenstadium stattgefunden hat.

Ab diesem Zeitpunkt wurden die Embryonen in einem Abstand von circa 24 Stunden aus dem Inkubator genommen und beurteilt. Zu diesem Zweck wurde ein Scoringsystem verwendet, dass sich aus der Anzahl der Blastomeren, deren Größe und dem Fragmentati- onsgrad zusammensetzt.²³ Am dritten Tag nach Follikelpunktion wurden die Embryonen in ein neues Schälchen mit 500µl G2™ v5 PLUS (Vitrolife) überschichtet mit 300µl Ovoil™ transferiert. Für den Embryotransfer am Tag 5 nach Follikelpunktion wurde, wie routinemäßig im Kinderwunschzentrum Goldenes Kreuz praktiziert, je nach Alter und Wunsch der Patientin, der Embryo oder die beiden Embryonen mit dem besten Score vorbereitet. Alle überzähligen Embryonen, die ebenso Top-Qualität aufwiesen, wurden kryokonserviert. Jedoch wurde für die Prozesse des Embryotransfers und der Kryokon- servierung keine Rücksicht darauf genommen, ob der jeweilige Embryo der Studien- oder Kontrollgruppe zugehörig war.

Für den Transfer wurden die Embryonen in eine neue Schale überführt. Da im Kinder- wunschzentrum Goldenes Kreuz bei speziellen Indikationen wie wiederholtem Inplantati- onsversagen oder Alter der Patientin über 35 Jahre das Transfermedium EmbryoGlue®

23 Vgl. Tews G. et al. (2007), S.18

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15 (Vitrolife) angeboten wird, wurde das Transferschälchen jeweils entweder mit 500µl dieses Mediums oder mit G2™ v5 PLUS befüllt. EmbryoGlue® enthält den Zusatz Hyaluron- säure, welcher die Viskosität des Mediums erhöht und somit das Einnistungspotential des Embryos steigert. Diese Eigenschaft führt auch zu einer Steigerung der Implantations- und Schwangerschaftsrate.²⁴ Für die Auswertung der Ergebnisse dieser Studie hat die Verwendung dieser beider Medien keinen Einfluss, da das Scoring am Tag fünf den End- punkt der Datenerfassung darstellt und die Embryonen erst danach in das Transferschäl- chen überführt wurden. Demnach waren über den Studienzeitraum standartisierte Kultur- bedingungen durchgehend gegeben.

2.3 System zur Wiedergabe des Tons

Für das Abspielen des Tons direkt im Inkubator wurde ein kommerziell erhältlicher Mini Mp3-Player (China) verwendet, der über einen Klinkenstecker mit einem Miniaturlautspre- cher²⁵ (Conrad, Wien, Österreich) verbunden war (Abbildung 4). Um in einem Intervall von 20 Minuten den gewählten Ton abspielen zu können, wurde ein Mp3-File erstellt, welches mit einer Vorlaufzeit von 20 Sekunden ohne jegliche Schallproduktion den Ton von 432 Hz für eine Minute beinhielt. Für weitere 18 Minuten und 40 Sekunden folgte wiederum ein Leerlauf. Durch den „Repeat-Modus“ des Mp3-Players wurde dieses File in einer End- losschleife abgespielt. Kontrollen auf Funktionalität erfolgten einmal wöchentlich bei allen verwendeten Lautsprechern und Mp3-Playern. Hierfür wurden die Lautsprecher erst aus dem Inkubator entfernt und außerhalb des Kultursystems auf Funktion getestet, um die Kulturbedingungen möglichst konstant zu halten. Zu keinem Zeitpunkt des Studienver- laufs erfolgte eine Kontrolle des Wiedergabesystems mit negativem Ergebnis.

Abbildung 4: Wiedergabesystem Quelle: Foto erstellt durch die Verfasserin

24 Vgl. Urman, B. et al. (2008), S. 607ff

25 Typ LSM-M50 M/F, Artikelnummer: 3354055-62, Miniaturlautsprecher mit Mylarmembran zur Sprachübertragung, Nennbelastbarkeit 200mW, Impedanz 8Ω

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16 Um Vergleichbarkeit der Studien- zur Kontrollgruppe zu erzielen, wurde neben jedem Kul- turschälchen obige Konstruktion platziert. Der einzige Unterschied bestand in der Laut- stärke, in der das Mp3-File abgespielt wurde. Demnach wurde bei der Studiengruppe die Lautstärke auf Maximum und bei der Kontrollgruppe auf Minimum, also „Mute“, gestellt.

Die Begründung dafür liegt in der technischen Apparatur des Lautsprechers selbst, der eine Magnetspule im Inneren enthält und somit ein elektromagnetisches Feld erzeugt, selbst wenn kein hörbarer Ton produziert wird. Bezüglich der Bestückung der Benchtop- Inkubatoren wurden in den jeweiligen MINC-Hälften nur entweder Studien- oder Kontroll- embryonen kultiviert. Demnach waren die Wiedergabesysteme in einer MINC-Kammer entweder beide auf maximale Lautstärke aufgedreht oder beide auf „Mute“ gestellt. Abbil- dung 5 dient hierzu der Visualisierung der Stellplatzaufteilung in den MINCs.

Abbildung 5: Platzierung von Kulturschälchen und Lautsprechern im MINC Quelle: Foto erstellt durch die Verfasserin

2.4 Präklinische Studien zum Ausschluss einer möglichen Toxi- zität der verwendeten Materialien und Methoden

2.4.1 Sperm-Survival-Test

Ein Sperm-Survival-Test bildete die primäre Maßnahme um eine eventuelle Toxizität des Lautsprechers im feuchtwarmen Klima des Inkubators zu erkennen. Es wurden drei Ver- suchsreihen angelegt, die im Folgenden erläutert werden. Für jede Versuchsreihe wurde je eine normozoosperme Samenprobe mittels Dichtegradientenzentrifugation aufbereitet.

Hierfür wurden eigens gemischte Gradientenlösungen verwendet, wobei 1,5ml 90%iges SpermGrad™ (Vitrolife) in GM501 SpermActive (Gynemed, Lensahn, Deutschland) mit 1,5ml 45%iges SpermGrad™ in GM501 SpermActive überschichtet wurde. Die Samen-

(22)

17 probe bildete den obersten Layer, wobei maximal 2ml Ejakulat pro Zentrifugenröhrchen auf den Gradienten geschichtet wurden. Nach diesem ersten Zentrifugationsschritt für 20 Minuten bei 1100rpm wurde das Pellet aspiriert und in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt. Es folgte ein Waschschritt mit 5ml äquilibriertem G-IVF™ PLUS (Vitrolife) bei 1800rpm für 10 Minuten. Im Anschluss wurde der Überstand abgekippt und das Pellet erneut in G-IVF™ PLUS resuspendiert. Dichte und Beweglichkeit wurden in einem Trop- fen der Suspension in der Makler Zählkammer bestimmt. Daraufhin wurden 0,5ml der Suspension in jeweils eine Vertiefung von zwei 4-well NUNC Schälchen eingebracht und im Großrauminkubator unter 6%iger CO2 Atmosphäre (Hera Cell, Thermo Scientific, Wal- tham, USA) mit größtmöglichem Abstand voneinander platziert. Unmittelbar neben eines der beiden Schälchen wurde ein Lautsprecher abgelegt und in einer ersten Versuchsreihe ohne das Abspielen eines Tones für 24 Stunden gemeinsam inkubiert. Die zweite Probe wurde ohne Lautsprecher inkubiert, um einen Normwert zu erhalten. Nach Ablauf von 24 Stunden wurden erneut die Beweglichkeit in der Makler Zählkammer bestimmt.

In einer weiteren Versuchsreihe wurde wieder eine Samenprobe wie oben beschrieben präpariert, suspendiert und auf Beweglichkeit analysiert.

Daraufhin wurde aber jene Methodik angewandt, welche im weiteren Verlauf der Studie für die Kultur von Embryonen zum Einsatz kommen sollte. Demnach wurden in jeweils eine Vertiefung zweier 4-well NUNC Schälchen 500µl Samensuspension pipettiert und je ein Lautsprecher in unmittelbarer Umgebung positioniert. Bei einem Lautsprecher wurde das Mp3-File mit maximaler Lautstärke abgespielt, beim Anderen im „Mute-Modus“. Die Inkubation erfolgte dabei wieder im Hera Cell.

Da die Möglichkeit bestand, dass sich aufgrund des hohen Volumens des Großrauminku- bators ein möglicher toxischer Effekt der verwendeten Gerätschaften im Sperm Survival Test nicht niederschlagen würde, wurde derselbe Versuchsansatz erneut im MINC durch- geführt.

Zusammengefasst ergab diese Analysenreihe, dass sowohl durch die verwendeten Mate- rialien wie Lautsprecher und Kabel im feuchtwarmen Klima eines Inkubators aber auch durch das direkte Einwirken von Schallwellen in einem zyklischen Intervall von 20 Minuten keine negative Auswirkung auf die Spermien hinsichtlich der Motilität und Vitalität von Samenzellen nach 24 Stunden Inkubation induziert wurde. Diese Aussage legitimierte weitere Analysen im Zuge der Präklinik dieser Studie.

2.4.2 In-vitro Kultur pathologisch befruchteter Eizellen unter vibrotaktiler Stimula- tion

Zum Ausschluss eines negativen Effektes durch das Einwirken der Schallwellen auf die Entwicklungsfähigkeit von Embryonen wurden Eizellen, die am ersten Tag nach Follikel-

(23)

18 punktion 3PN aufwiesen, unter den unter 1.2 und 1.3 beschriebenen Bedingungen für weitere zwei Tage kultiviert und ebenso in einem Intervall von circa 24 Stunden beurteilt.

Die Datensammlung dieser vorklinischen Studie nahm circa 2 Monate in Anspruch. Eizel- len mit mehr als 3PN wurden aus dieser Untersuchung ausgeschlossen, da sie nach an- fänglicher Beobachtung kaum Potential für regelmäßige Teilung besaßen. Im Gegensatz dazu entwickelte sich der überwiegende Teil der 3PN Eizellen bis zum Tag 3 ähnlich jener mit 2PN. Allerdings führte diese Maßnahme zu einer geringen Anzahl an Testeizellen, wodurch die Notwendigkeit einer Abwandlung im Scoringsystem entstand um trotzdem ein Ergebnis zu erhalten. Es wurde das Scoringsystem von Steer et al. (1992) angewandt²⁶, das bis Ende des Jahres 2011 im IVF Labor des Kinderwunschzentrums Golde- nes Kreuz routinemäßig verwendet wurde. Dieser Score beinhaltet zwei Zahlen, wobei die Erste die Anzahl der Blastomeren darstellt. Die zweite Zahl kennzeichnet die Qualität des Embryos in Hinblick auf den Fragmentationsgrad und die Regelmäßigkeit der Zellen und ergibt einen Faktor von 1 bis 4., wobei der Faktor 4 in diesem Fall für die beste Qualität steht. Genauer gesagt erhält ein 4-Zeller mit Topqualität also einen Score von 16, bei ge- ringgradigen qualitativen Einschränkungen einen Score von 12 und so weiter.²⁷ Insgesamt wurden 24 Eizellen mit 3PN in dieser präklinischen Studie untersucht und der Durch- schnitt des Scorings der Studiengruppe von Tag 2 und Tag 3 dem der Kontrollgruppe ge- genübergestellt.

2.5 Statistische Auswertung

Für die statistische Auswertung wurden die Ergebnisse mittels Chi-Quadrat-Test analysiert wobei ein Wert von p<0,050 als signifikant erachtet wurde.

26 Vgl. Steer C.V. et al. (1992), S. 117

27 Im weiteren Text erfolgt die schriftliche Form dieses Scorings wie folgt: 4/16 für beispielsweise einen 4-Zeller mit einem Score von 16

(24)

19

3 Ergebnisse

3.1 Sperm-Survival Test

Vor Beginn der Versuchsreihe mit Embryonen wurde zum Ausschluss einer möglichen Toxizität der verwendeten Materialien und Methoden ein Sperm-Survival Test in mehreren Ansätzen durchgeführt.

Im ersten Ansatz wurden je 500µl einer präparierten Samenprobe in zwei verschiedenen 4-well Schälchen mit größtmöglichem Abstand im Hera Cell für 24 Stunden inkubiert. Ne- ben einem Schälchen wurde ein Lautsprecher platziert, der jedoch keinen Ton abspielte.

In Ansatz zwei wurden wieder dieselben Probenvolumina im Hera Cell platziert, wobei nun neben jedem Schälchen ein Lautsprecher platziert wurde und einer der Lautsprecher das für diese Studie generierte Musikfile mit voller Lautstärke abspielte, der andere aber auf „Mute“ geschalten war.

Ansatz drei unterschied sich durch die Inkubation im Benchtop-Inkubator, wo im weiteren Verlauf auch die Embryonalkultur stattfand. Vor und nach jedem Testansatz wurde die Gesamtbeweglichkeit²⁸ der jeweiligen Proben erhoben und miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Testansatz Gesamtbeweglichkeit nach Aufbereitung

Gesamtbeweglichkeit nach 24 Stunden

Beweglichkeitsabnahme in %

Ansatz 1:

Ohne Lautspre- cher

74% 52% 22%

Mit Lautsprecher 56% 18%

Ansatz 2:

Ohne Sound 69% 43% 26%

Mit Sound 41% 28%

Ansatz 3:

Ohne Sound 75% 49% 26%

Mit Sound 50% 25%

Tabelle 1: Ergebnisse des Sperm-Survival Tests Quelle: Tabelle erstellt durch die Verfasserin

Der Sperm-Survival Test wurde für normal erachtet, wenn der Beweglichkeitsverlust nach 24 Stunden einen Wert von 50% nicht überschritt. Weiters wurde für die drei Testansätze

28 A+B nach WHO Kriterien (1992)

(25)

20 ein Cut off von 10% Unterschied in der Beweglichkeitsabnahme nach 24 stündiger Inku- bation von Studien- versus Kontrollsample bestimmt, der für ein positives Absolvieren des Tests nicht überschritten werden durfte. Tabelle 1 zeigt also, dass in allen drei Testansät- zen die Beweglichkeitsabnahme unter 10% lag und demnach eine Toxizität der verwendeten Materialien und Methoden ausgeschlossen werden konnte.

3.2 Präklinische Studie an pathologisch befruchteten Eizellen

Die präklinische Untersuchung der Methodik dieser Studie umfasste die Kultur unter vibrotaktiler Stimulation von 22 pathologisch befruchteten Eizellen. Aufgrund dieser geringen Anzahl wurde, wie in Kapitel 2.4.2 beschrieben, der kumulative Embryoscore verwendet, um eine einfache und aussagekräftige Analyse zu ermöglichen. Die erste Zahl gibt hierbei die Anzahl der Blastomeren an. Die zweite Zahl entsteht durch die Multiplikation eines Faktors von eins bis vier mit der Blastomeranzahl, wobei der Faktor vier für die beste Qualität steht. Ebenso wurden die Embryonen im Zuge der täglichen Beurteilung fotogra- fiert und nach Abschluss der Datenerfassung von einer Embryologin gescored, um Verfäl- schungen durch wechselndes Personal oder Tagesverfassung der Embryologin auszu- schließen.

In der Gegenüberstellung der 3PN Eizellen ergab sich ein durchschnittlicher Score in der Studiengruppe mit Beschallung am Tag 2 von 4/13,7 (Zellzahl/Score) und am Tag 3 von 7,8/25,9. In der Kontrollgruppe ohne Beschallung wurde ein Score am Tag 2 von 4/12 erfasst. Am Tag 3 lag dieser bei 6,8/21,6. In der statistischen Auswertung dieser Daten zeigten sich sowohl für den Vergleich der Blastomeranzahl als auch den Score p-Werte

>0,050. Bei nicht signifikant unterschiedlichen Ergebnisse, zeigt dies, dass kein nachteili- ger Effekt bezüglich der Entwicklungsfähigkeit humaner Embryonen unter vibrotaktiler Stimulation zu erwarten ist, wodurch der Zweck dieser präklinischen Analyse erfüllt wurde und die Rekrutierung von Patientinnen und Patienten im Juni 2012 beginnen konnte.

3.3 Embryonalentwicklung unter vibrotaktiler Stimulation

Insgesamt wurden 295 Metaphase II Eizellen von 20 Patienten-Behandlungszyklen in diese Studie inkludiert. Die durchschnittliche Eizellanzahl pro Patientin betrug 14,75 (Range: 7 bis 26). Tabelle 2 zeigt eine Übersicht über die Resultate, ausgedrückt sowohl in Prozent- als auch in absoluten Zahlen inklusive P-Werte.

(26)

21

Mit Schall Ohne Schall P-Wert

MII-Oozyten 155 140

2PN 118 (76,1%) 107 (76,4%) 0,95

4-Zellrate 53 (44,9%) 58 (54,2%) 0,16

Embryoqualität A (Tag 3) 59 (50,0%) 59 (55,1%) 0,44

Embryoqualität B (Tag 3) 52 (44,1%) 34 (31,8%) 0,058 Embryoqualität C (Tag 3) 7 (5,9%) 14 (13,1%) 0,066

Morulabildung 14 (11,9%) 14 (13,1%) 0,78

Blastozystenbildung 62 (52,5%) 61 (57,0%) 0,50

Blastozystenqualität A 32/62 (51,6%) 31/61 (50,8%) 0,93

Blastozystenqualität B 24 (38,7%) 21 (34,4%) 0,62

Blastozystenqualität C 6 (9,7%) 9 (14,8%) 0,39

Utilisationsrate 35/118 (29,7%) 36/107 (33,7%) 0,52

Tabelle 2: Übersicht der Ergebnisse Quelle: Tabelle erstellt durch die Verfasserin

Hinsichtlich der embryonalen Entwicklungsfähigkeit unter den Konditionen der vibrieren- den versus der statischen Kultur wurde zu verschiedenen Zeitpunkten ein Scoring erhoben und verglichen. Abbildung 6 zeigt in einer graphischen Aufarbeitung die Gegenüber- stellung der 4-Zellrate (Tag 2), der Morulabildungsrate (Tag 4) und der Blastulationsrate (Tag 5) in den beiden Eizellpopulationen.

(27)

22 Abbildung 6: 4-Zellrate, Morulabildungsrate, Blastulationsrate

Quelle: Diagramm erstellt durch die Verfasserin

Es zeigte sich im Bezug auf die 4-Zellrate eine nicht signifikante Erhöhung der 4-Zellrate in der Gruppe der Embryonen ohne Schall (p=0,16). Die Rate der Embryonen, die das 4- Zellstadium am Tag 2 erreichten lag bei 54,2% in der Gruppe ohne Beschallung während in der Gruppe mit Beschallung nur ein Wert von 44,9% erreicht wurde. Ausschlaggebend war hierfür ausschließlich die Blastomeranzahl ohne Rücksicht auf Fragmentationsgrad oder Uniformität der Blastomeren. Eine weitere Unterteilung der Qualitätsstufen innerhalb dieses Zellstadiums ließ keine signifikanten Unterschiede innerhalb der beiden Gruppen erkennen. Im Hinblick auf die Morulabildungsrate ergab sich mit 13,1% Morulaformation in der Gruppe mit Schall und 11,9% in der Gruppe ohne Schall kein signifikanter Unter- schied (p=0,78). Die Blastozystenbildungsrate lag in der Studiengruppe bei 52,5% versus 57% in der Kontrollgruppe. Auch dieser Unterschied zeigt keine statistische Signifikanz (p=0,50).

Zur weiteren Analyse der Embryonen am Tag 3 und am Tag 5 erfolgte eine Unterteilung in drei Gruppen (A-C) anhand ihrer Qualität. Die Gesichtspunkte, die für diese Untertei- lung herangezogen wurden, sind den Tabellen 4 und 5 dem Anhang zu entnehmen.

0 10 20 30 40 50 60

4-Zellrate Morulabildungsrate Blastulationsrate

Mit Schall Ohne Schall

(28)

23 Abbildung 7: Embryonalqualität am Tag 3

Hinsichtlich der Ergebnisse für Tag 3 ergaben sich für den Qualitätsgrad A eine Anzahl von 50% in der Gruppe der Embryonen mit Beschallung, während ohne Beschallung 55,1% der Embryonen diese höchste Qualitätsstufe erreichten. Dieser Unterschied von 5,1% ist jedoch statistisch nicht signifikant (p=0,44). Für Qualitätsgrad B waren die Ergeb- nisse 44,1% und 31,8%, für Qualitätsgrad C 5,9% und 13,1% wobei auch hier keine statistische Signifikanz erreicht wurde (p=0,058; p=0,066), obwohl ein leichter Trend erkennbar ist. Dieser weist jedoch beim Qualitätsgrad B auf eine Erhöhung in der Gruppe der Embryonen mit Beschallung hin, beim Qualitätsgrad C findet sich die Erhöhung jedoch in der Gruppe der Embryonen ohne Beschallung. In der weiteren Auswertung wird dieser leichte Trend vernachlässigt, da vorrangig nach einem Unterschied bei den Qualität A Embryonen gesucht wurde.

0 10 20 30 40 50 60

Qualität A Qualität B Qualität C

Qualität am Tag 3

(29)

24 Abbildung 8: Embryonalqualität am Tag 5

Am Tag 5 erreichten in der Gruppe der Embryonen unter Schallexposition 51,6% den höchsten Qualitätsgrad A, vergleichend zu einem Wert von 50,8% in der Gruppe ohne Schallexposition. Für die Qualitätsgrade B und C ergaben sich Werte von 38,7% und 9,7% in der Gruppe mit Schall sowie 34,4% und 14,8% in der Gruppe ohne Schall. Auch hier waren die Unterschiede der beiden Gruppen statistisch nicht signifikant (p=0,93;

p=0,62; p=0,39).

Da die Auswahl der Embryonen für die Verwendung für den Embryotransfer und die Kryo- konservierung auch subjektiver Wahrnehmung der Embryologin oder des Embryologen obliegt, wurde auch die Utilisationsrate in die Auswertung mit aufgenommen. Es wurden hierfür jeweils jene Embryonen im Entwicklungsstadium der Blastozyste herangezogen, die entweder für einen Embryotransfer oder eine Kryokonservierung herangezogen wurden.

0 10 20 30 40 50 60

Qualität A Qualität B Qualität C

Qualität am Tag 5

(30)

25 Abbildung 9: Utilisationrate

Es ergab sich in der Studiengruppe ein Wert von 29,7% im Gegensatz zu 33,7% in der Kontrollgruppe. Auch dieser Unterschied von 4% ist statistisch nicht signifikant (p=0,52).

Zusammengefasst zeigten sich in dieser Studie also keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Entwicklungsfähigkeit humaner Embryonen unter vibrotaktiler Stimulation.

In Einzelfällen waren jedoch leichte Trends zu erkennen. Abbildung 10 zeigt den Auszug des Dokumentationsblattes einer Studienpatientin, bei der eine deutlich verbesserte Blastozystenqualität in der Studiengruppe der Eizellen gefunden werden konnte. Dies ist als exemplarischer Auszug zu sehen, die Autorin nimmt jedoch von jeglicher Aussage dieses Einzelfalles Abstand. In dieser Abbildung wird die Entwicklung der Embryonen einer Studienpatientin von Tag 0 bis Tag 5 gezeigt, wobei das Scoring jedes einzelnen Tages in einer anderen Farbe dargestellt wird. Ergänzend ist nochmals zu erwähnen, dass die Embryonen in Gruppen kultiviert wurden und demnach das Scoring der jeweiligen Tage den einzelnen Eizellen aus Plausibilitätsgründen zugeordnet wurde. Die Ergeb- nisse des Scorings der verschiedenen Entwicklungsstufen sind demnach als Be- standsaufnahme zu sehen. Eine sichere Aussage über die Entwicklung über den Zeitraum der fünf Tage der in-vitro Kultur kann nicht getroffen werden.

27 28 29 30 31 32 33 34

Utilisationrate

(31)

26 Abbildung 10: Dokumentationsblatt einer Studienpatientin

Quelle: Datenbank, Kinderwunschzentrum Goldenes Kreuz

Ersichtlich ist hier eine Anzahl von 12 Metaphase II Eizellen die nach ICSI in Studien- und Kontrollgruppe unterteilt wurden. Es waren jeweils sechs Eizellen der jeweiligen Gruppe zugehörig, wobei die oberen sechs beschallt wurden. Es zeigte sich eine Blastulationsrate von 83% in der Studiengruppe versus 66,7% in der Kontrollgruppe. Auffällig war jedoch eher, dass in der Studiengruppe vier der erhaltenen Blastozysten mindestens das Stadi- um der vollen Blastozyste erreichten. In der Kontrollgruppe fanden sich ausschließlich frühe Blastozysten, welche deutliche Fragmentationen zeigten. Die Embryonen in der Gruppe mit Beschallung wiesen jedoch, bis auf eine frühe Blastozyste, keine erkennbaren Fragmentationen auf.

(32)

27

4 Diskussion

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen weitgehend keine signifikanten Unterschiede einer Embryonalkultur unter vibrotaktiler Stimulation gegenüber herkömmlichen statischen Kul- tursystemen.

Bei näherer Betrachtung der frühen Embryonalentwicklung der ersten drei Tage zeigt sich innerhalb der aktuellen Ergebnisse eine nicht signifikante Erhöhung der 4-Zellrate um circa 10% (p=0,16) sowie eine ebenso nicht signifikant höhere Anzahl an Qualität A Emb- ryonen am Tag 3 (50% vs. 55,1%; p=0,44). Obwohl aus den Resultaten der vorliegenden Studie auch kein eindeutiger Trend ersichtlich ist, könnte trotzdem die Vermutung aufgestellt werden, dass die Embryonen in diesem Entwicklungsstadium diese Art von Stimula- tion sogar als störend empfinden könnten. Bezeichnend für diese Phase in der Entwick- lung ist die Genaktivität, die bis zum 4-Zellstadium ausschließlich durch das maternale Genom zustande kommt. Erst bei den folgenden Teilungszyklen wird sukzessive das embryonale Genom aktiviert.²⁹ Auch der Metabolismus des Embryos ist bis zu diesem Zeitpunkt noch verhältnismäßig ruhig, was den tendenziell negativen Effekt der Vibration erklären könnte. Unterstützt wird diese Vermutung durch die Minimierung des Unter- schieds zwischen Studien- und Kontrollgruppe am Tag 5 auf circa 1% Unterschied bei Qualität A Blastozysten. Als mögliche Konsequenz könnte beispielsweise die Stimulation durch Schallwellen erst ab dem Stadium des 8-Zellers durchgeführt werden.

Die gefundenen Resultate stehen nun im Gegensatz zu den Ergebnissen anderer Stu- dien, die den Effekt von Bewegung in der Embryonalkultur analysiert und bereits einen vorteiligen Effekt gefunden haben. Im Speziellen sind jedoch die Ergebnisse der Studien mit Verwendung von Vibration zur Erzeugung von Bewegung in der Embryonalkultur von besonderer Bedeutung, da der Einsatz von Vibration der Methodik in vorliegender Studie am ähnlichsten ist. Zusammengefasst konnte in der Studie von Isachenko et al. (2010) durch eine Vibration von 20 Hz für fünf Sekunden in einem Intervall von einer Stunde eine Erhöhung der Schwangerschaftsrate um 30% am Tag 3 und um 37% am Tag 5 gefunden werden. Das Patientenkollektiv bestand jedoch nur aus 23 Kinderwunschpaaren, von denen aufgrund der Gesetzeslage in Deutschland jeweils zwei Embryonen unter Studienbe- dingungen kultiviert wurden.³⁰ Sowohl die geringe Anzahl an Studienteilnehmern und Stu- dienteilnehmerinnen, wie auch die Tatsache, dass in jedem Fall alle Embryonen einer Probandin entweder dem statischen oder dem dynamischen Kultursystem zugehörig waren lassen dieses Ergebnis, zumindest nach Meinung der Autorin, fragwürdig erscheinen.

29 Vgl. Elder, K./Dale, B. (2011) S. 64

30 Vgl. Isachenko, E. et al. (2010), S. 570ff

(33)

28 Ebenso stellt sich die Frage, ob die angewandte Methodik in dieser Studie tatsächlich den gewünschten Effekt erzielen kann. Da sich die Auswahl der Frequenz auf den Zilienschlag der Flimmerzellen innerhalb des Tubenepithels gründet, bleibt zu diskutieren, warum die Exposition nur für 5 Sekunden in einstündlichem Abstand erfolgte. Unter natürlichen Ge- gebenheiten herrscht diese Vibration konstant über die Dauer der ersten fünf bis sechs Tage, bis der Embryo im Uterus angelangt ist³¹. Hochgerechnet haben die Embryonen in der Studie jedoch nur 360 Sekunden bei Tag 3 Transfers oder 600 Sekunden bei Tag 5 Transfers diese Art der Stimulation erhalten, was nach Meinung der Autorin, eine verhält- nismäßig kurze Dauer ist. Bei derart niedriger Frequenz wäre eine andauernde Vibration während der gesamten in-vitro Kultur anzudenken um sich der Physiologie der in-vivo Situation deutlicher zu nähern.

Aus diesem Grund wurden die Embryonen in dieser Studie für hochgerechnet circa sechs Stunden der Beschallung und der dadurch provozierten Vibration ausgesetzt. Auch hier wurde auf eine andauernde Stimulation verzichtet, da mit einer deutlich höheren Frequenz gearbeitet wurde, als es in der Tuba uterina vorkommt. Diese Auswahl wird durch die Studie von Pabst (2010) gestützt. Der Frequenzbereich, der durch die darin verwendete Klangschale generiert wurde, lag zwischen 455 und 3472 Hz. Gefunden wurde eine deutlich erhöhte Zellzahl und eine höhere Anzahl an vitalen Zellen vergleichend zur Kontroll- gruppe.³² Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass zumindest theoretisch ein positiver Effekt durch die Stimulation von Zellen durch Klang beziehungsweise Schallwellen in höheren Frequenzbereichen möglich und eventuell sogar von Vorteil sein kann.

Wesentliche Unterschiede zur vorliegenden Studie sind jedoch die Lautstärke und die Frequenz, in der die Schallwellen auf das Kulturgefäß einwirkten. Das Anschlagen einer Klangschale erzeugt einen Ton, der aus weiterer Entfernung hörbar und in näherer Um- gebung oder bei direktem Kontakt, wie beispielsweise bei Klangschalen-Massagen, spür- bar ist. Der Ton, der innerhalb der vorliegenden Studie über das Wiedergabesystem Mp3- Player und Lautsprecher abgespielt wurde, war hingegen ebenso deutlich aber nur in nä- herer Umgebung hörbar. Aufgrund der Kombination aus Mp3-Player und Lautsprecher war eine Berechnung der Dezibel nicht möglich, da der Lautsprecher zwar eine maximale Dezibelangabe aufwies, der Hersteller des Mp3-Players diesbezüglich jedoch keine An- gaben machte. Eine Messung der Lautstärke direkt im Inkubator wurde aufgrund der hohen Anschaffungskosten eines adäquaten Messgeräts nicht durchgeführt. Somit könnte ein möglicher Hintergrund der gleichwertigen Entwicklung der Embryonen in Studien- und Kontrollgruppe in einer zu geringen Lautstärke liegen. Obwohl der Ton zwar deutlich hör-

31 Vgl. Paltieli, Y. et al. (1995), S. 1641

32 Vgl. Pabst, M.A. (2010), S. 25ff

(34)

29 bar war, könnten durch physikalische Phänomene wie Streuung und Brechung die Schwallwellen an ihrem Vordringen bis hin zum Embryo gehindert worden sein.

In der Studie von Pabst (2010) wurde die Klangschale direkt auf dem Kulturgefäß platziert, wodurch die Vibrationen direkt in vertikaler Ausrichtung auf die Zellen in Kultur einwirkten.³³ Hingegen könnte das Platzieren des Lautsprechers in der benachbarten Positi- on im Inkubator hinderlich für die Schallausbreitung gewesen sein. Eine Möglichkeit diesen Faktor zu umgehen wäre beispielsweise das Abspielen des Tons oder der Musik au- ßerhalb des Inkubators. Lautsprecher mit größeren Membranen und höherer Leistung sind auch in der Lage die Wand des Inkubators zu durchdringen, vorausgesetzt es wird im höheren Dezibelbereich gearbeitet. Aufgrund des Routinebetriebs in einem IVF-Labor müsste jedoch auf die Verwendung von Mausembryonen zurück gegriffen werden, da diese Konditionen eine konzentrierte Arbeitsatmosphäre stark beeinträchtigen und für das Personal nicht zumutbar wären. Ein großer Vorteil wäre jedoch, dass eine Weiterleitung der Schallwellen bis hin zum Embryo garantiert werden könnte. Ebenso kann mit höheren Anzahlen an Eizellen und Embryonen gearbeitet werden, was die Aussagekraft deutlich bestärken würde. Eine alternative Variante mit aktuellem Studiensetting wäre auch die Inkubation in einem Standard-Großrauminkubator unter Verwendung eines Lautsprechers mit größerer Membran und demnach höherer Leistung. Auch hier gilt obiger Vorteil, dass durch geradlinige Schallexposition ein Vordringen der Schallwellen bis hin zum Embryo garantiert werden könnte.

In Anbetracht der Tatsache, dass unter physiologischen Bedingungen niemals nur eine singuläre Frequenz zum Tragen kommt könnte eine mögliche Ursache der Ergebnisse dieser Studie in der Verwundung von Schallwellen einer Frequenz begründet sein. Be- trachtet man den natürlichen Weg der Eizelle durch den Eileiter bis hin zum Uterus, ist nicht nur der Zilienschlag der Flimmerzellen für das dynamische Element in dieser frühen Phase der Embryonalentwicklung verantwortlich, sondern auch die peristaltische Bewe- gung der Tubenmuskulatur und auch die Bewegungen der Frau in ihrem Alltag. Demnach ist eine Grundfrequenz von circa 20 Hz durch das Flimmerepithel vorherrschend, wozu in unterschiedlichen Intervallen additive Vibrationen und Kompressionen verschiedenster Intensitäten hinzukommen. Ein möglicher Ansatz, dies methodisch innerhalb der in-vitro Kultur von Embryonen umzusetzen, wäre der Einsatz eines Musikstückes. Ein Musikstück an sich umfasst nicht nur eine Abfolge verschiedener Töne, sondern auch dynamische und rhythmische Veränderungen. Ebenso treten Änderungen der Lautstärke auf. Musik ist also ein multifaktorielles Geschehen, was das Grundprinzip der physiologischen Bewe- gung im Mutterleib treffender simulieren würde, als das Abspielen eines einzelnen Tons.

33 Vgl. Pabst, M.A. (2010), S. 25

(35)

30 Für die vorliegende Studie wurde jedoch bewusst auf Musik verzichtet, da in der Literatur kein Beweis dafür gefunden werden konnte, dass dies in der in-vitro Kultur humaner Emb- ryonen keine toxische Wirkung zeigen. In einem neuen Setting könnte also eine Folgestu- die mit beispielsweise klassischer Musik oder einer in „random“ abgespielten Kombinati- onsfolge von Einzeltönen verschiedener Frequenzen eventuell andere Ergebnisse liefern.

Auf die Auswertung von Schwangerschafts- und Implantationsrate wurde bewusst verzichtet, da das Kollektiv an Studienteilnehmerinnen und Studienteilnehmern zu gering war, um eine genaue Aussage treffen zu können. Die zustande gekommenen Embryo- transfers bildeten drei Gruppen, da je entweder nur Embryonen aus Studien- oder Kon- trollgruppe oder aus beiden transferiert wurden. Auch die Anzahl der transferierten Emb- ryonen wechselte zwischen einem oder zwei. Es bleibt demnach fraglich, ob die Expositi- on der Schallwellen zwar keinen Effekt auf die Embryonalentwicklung der ersten fünf Ta- ge mit sich brachte, oder zumindest keinen optisch erkennbaren, oder ob nicht doch ein positiver Effekt hinsichtlich des Einnistungspotentials erzeugt werden konnte. In einer Fol- gestudie könnte beispielsweis ein größeres Patientenkollektiv rekrutiert werden und mithil- fe desselben Settings der Fokus der Auswertung auf die Schwangerschaftsrate gelegt werden.

Der Versuch mit Hilfe von Schallwellen Bewegung innerhalb der bisher statischen Kultur von humanen Embryonen, mit dem Ziel dieses System möglichst physiologisch zu gestalten, ist bislang weitgehend unerforscht. Aufgrund der kostengünstigen und einfach an- wendbaren Methodik entsteht jedoch der Bedarf diese Thematik weiter zu erforschen.

Eine Abänderung der Einschlusskriterien für diese eventuelle Folgestudie wäre jedoch trotzdem ratsam. So sollten Stimulationsprotokolle angeglichen und das Alter der Patien- tinnen sowie deren reproduktive Vergangenheit mit berücksichtigt werden. Ein homogene- res Studienkollektiv könnte nicht nur in einem Unterschied der Schwangerschaftsrate re- sultieren, auch ein divergierendes Ergebnis hinsichtlich aktueller Resultate wäre denkbar.

(36)

31

Literaturverzeichnis

Besenfelder, U./Havlicek, V./Brem, G. (2012), Role oft he Oviduct in Early Embryo Devel- opment, Reproduction in Domestic Animals, 47, 4, S. 156-163

Elder, K./Dale, B. (2011): In-vitro Fertilization, 3. Aufl., Cambridge University Press, New York.

Gardner, D. K./Lane, M. (2004): Culture systems for the human embryo, in: Gardner, D.K.

et al. (Hrsg.): Textbook of Assisted Reproductive Techniques. Laboratory and Clinical Perspectives, 2. Auflage, Taylor & Francis Verlag, London, S. 211-234

Hartmann, M./Pabst, M.A./Dohr, G. (2011): Zytologie, Histologie und Mikroskopische Ana- tomie. Licht- und elektronenmikroskopischer Bildatlas, 5. Auflage, Facultas Verlag, Graz.

Heo, Y.S. et al. (2010), Dynamic microfunnel culture enhances mouse embryo development and pregnancy rates, Human Reproduction, 25, 3, S. 613-622

Hickman, D.L. et al. (2002), Comparison of static and dynamic medium environments for culturing of pre-implantation mouse embryos, Comparative Medicine, 52, 2, S. 122-126

Isachenko, E. et al. (2010), Mechanical agitation during the in vitro culture of human preimplantation embryos drastically increases the pregnancy rate, Clinical Laboratory, 56, S.

569-576

Koike, T. et al. (2010), In-vitro culture with a tilting device in chemically defined media during meiotic maturation and early development improves the quality of blastocysts derived from in-vitro matured and fertilized porcine oocytes, Journal of Reproduction and Devel- opment, 56, 5, S. 552-557

Kölle, S./Reese, S./Kummer, W. (2010), New aspects of gamete transport, fertilization, and embryonic development in the oviduct gained by means of live cell imaging, Therio- genology, 73, S. 786-795

(37)

32 Kraus, W. (2011): Die Heilkraft der Musik. Einführung in die Musiktherapie, 3. Auflage, Verlag C.H.Beck, München.

Matsuura, K. et al. (2010), Improved development of mouse and human embryos using a tilting embryo culture system, Reproductive BioMedicine Online, 20, 3, S. 358-364

Mercader, A./Valbuena, D./Simón C. (2006), Human embryo culture, Methods in Enzy- mology, 420, 3-18

Minseok, S.K. et al. (2009), A microfluidic in vitro cultivation system for mechanical stimulation of bovine embryos, Electrophoresis, 30, S. 3276-3282

Pabst, M.A. (2010): Zellen und Klang, in: Klang-Massage-Therapie, Entwicklung und For- schung rund um die Peter Hess-Klangmethode, Sonderausgabe 7/2010, S. 25-29

Paltieli, Y. et al. (1995), Laser scattering instrument for real time in-vivo measurement of ciliary activity in human fallopian tubes, Human Reproduction, 10, S. 1638-1641

Steer, C.V. et al. (1992), The cumulative embryo score: a predictive embryo scoring tech- nique to select the optimal number of embryos to transfer in an in-vitro fertilization and embryo transfer programme, Human Reproduction, 7, 1, S. 117-119

Tews, G. et al. (2007), Empfehlungen für die maximale Anzahl der zu transferierender Embryonen – Empfehlungen der ÖGRM, Speculum – Zeitschrift für Gynäkologie und Ge- burtshilfe, 25, 2, S. 17-19

Urman, B. et al. (2008), Effect of hyaluronan-enriched transfer medium on implantation and pregnancy rates after day 3 and day 5 embryo transfers: a prospective randomized study, Fertility and Serility, 90, 3, S. 604-612

Xie, Y. et al. (2006), Shear stress induces preimplantation embryo death that is delayed by the zona pellucida and associated with stress-activated protein kinase-mediated apop- tosis, Biology of Reproduction, 75, S. 45-55

(38)

33

Internetquellen

http://physics.info/sound/ [Stand: 17.10.2012]

http://www.medizinfo.de/kopfundseele/epilepsie/eeg.shtml [Stand: 19.10.2012]

http://www.omega432.com/concertpitch432.html [Stand: 19.10.2012]

http://www.cookartlab.com/products.html [Stand: 05.11.2012]