Tierärztliche Hochschule Hannover
Auswirkung einer temporären In-vivo-Kultur in vitro produzierter Rinderembryonen im bovinen Eileiter auf das mRNA-Expressionsmuster
entwicklungsrelevanter Gene
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin oder eines Doktors der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
Vorgelegt von Karsten Müller
aus Vechta
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. C. Wrenzycki Klinik für Rinder,
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
1. Gutachter: Prof. Dr. Wrenzycki 2. Gutachter: Prof. Dr. Niemann
Tag der mündlichen Prüfung: 09.11.2011
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
i
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Schrifttum ... 5
2.1 Physiologische und anatomische Grundlagen der Fortpflanzung des Rindes ... 5
2.1.1 Zyklus des Rindes ... 5
2.1.2 Eileiter und Uterus des Rindes ... 6
2.1.3 Präimplantatorische Embryonalentwicklung ... 8
2.2 Generierung von Embryonalstadien beim Rind ... 10
2.2.1 In-vitro-Produktion von Rinderembryonen ... 10
2.2.2 Gewinnung uteriner Embryonalstadien ... 15
2.2.3 In-vivo-Kultur in vitro produzierter Embryonen ... 16
2.3 Unterschiede in der Qualität und in der Genexpression bei Rinderembryonen aus verschiedenen Herkünften ... 24
2.4 Epigenetische Genregulation in frühen Embryonalstadien ... 28
2.4.1 DNA-Methylierung ... 28
2.4.2 Histonmethylierung und Histonmethyltransferasen ... 38
2.5 Energiemetabolismus im präimplantatorischen Embryo ... 44
2.5.1 Solute Carrier 2A (SLC2A) / Glukosetransporter (GLUT) ... 45
3 Material und Methoden ... 52
3.1 Gewinnung von Embryonalstadien (Morulae, Blastozysten) aus der temporären In-vivo-Kultur in vitro produzierter Zygoten im Eileiter vom Rind... 52
3.1.1 Verwendete Tiere und deren vorherige und anschließende Nutzung .... 52
3.1.2 Vorbereitung und Synchronisation der Empfängertiere ... 52
3.1.3 Generierung der In-vitro-Zygoten für den tubalen Transfer ... 53
Inhaltsverzeichnis
3.1.4 Medien und Instrumente für den transvaginal-endoskopischen
Embryonentransfer in den Eileiter des Rindes ... 55
3.1.5 Transvaginaler Zugang zur Bauchhöhle und endoskopisch geleiteter Embryonentransfer in den Eileiter des Rindes ... 59
3.1.6 Medien und Instrumente für die kombinierte Eileiter-/Uterusspülung ... 64
3.1.7 Kombinierte Eileiter- und Uterusspülung zur Rückgewinnung der Embryonen ... 65
3.2 Gewinnung in vivo produzierter Embryonalstadien (Morulae, Blastozysten) aus dem Uterus des Rindes ... 66
3.2.1 Vorbereitung der Tiere ... 66
3.2.2 Spülung der Uterushörner ... 67
3.3 In-vitro-Produktion von Rinderembryonen ... 67
3.4 Morphologische Beurteilung der gewonnenen Embryonalstadien ... 68
3.5 RT-qPCR zur quantitativen Analyse der Genexpression ... 70
3.5.1 Isolierung der Messenger RNA ... 70
3.5.2 Reverse Transkription (RT, cDNA Synthese) ... 71
3.5.3 Farbstoff und PCR-Zyklus ... 72
3.5.4 Detektion, Quantifizierung und Auswertung... 75
3.6 Statistische Analyse ... 76
3.7 Allgemeiner Versuchsaufbau ... 76
4 Ergebnisse ... 78
4.1 Erstellung der In-vitro-Embryonen ... 78
4.2 Gewinnung der in vivo produzierten Embryonen ... 78
4.3 Erstellung und Rückgewinnung der Embryonen aus der temporären Eileiterkultur ... 78
4.4 Vergleichende Darstellung der mRNA-Expression aus den Embryonen der drei Versuchsgruppen ... 81
Inhaltsverzeichnis
iii
4.4.1 DNMT1 ... 82
4.4.2 DNMT3a ... 82
4.4.3 SUV39H1... 84
4.4.4 SLC2A3 (GLUT3) ... 84
4.4.5 SLC2A8 (GLUT8) ... 86
5 Diskussion ... 87
5.1 Transvaginale Endoskopie und Eileiterkultur ... 90
5.2 Genexpressionsmuster ... 93
5.2.1 DNMT1 und DNMT3a ... 94
5.2.2 SUV39H1... 97
5.2.3 SLC2A3 und SLC2A8 ... 98
5.3 Schlussbetrachtung ... 100
6 Zusammenfassung... 102
7 Summary ... 105
8 Anhang: Verzeichnisse ... 107
8.1 Verzeichnis der Tabellen ... 107
8.2 Abbildungsverzeichnis ... 107
8.3 Zusammensetzung der Medien ... 109
8.4 Abkürzungsverzeichnis ... 114
9 Literaturverzeichnis ... 119
10 Danksagung ... 150
1 1 Einleitung
Die In-vitro-Produktion (IVP) hat sich einen festen Platz in der Biotechnologie beim Rind gesichert. Sowohl die Gewinnung von Oozyten aus Schlachthofovarien als auch Eizellgewinnung vom lebenden Tier durch ultraschallgeleitete, transvaginale Follikel- punktion (Ovum pick up, OPU) ermöglichen den Zugriff auf eine große Anzahl von weiblichen Keimzellen für die IVP.
Seit der Geburt des ersten Kalbes nach Transfer in vivo gereifter und in vitro fertilisierter Oozyten im Jahre 1981 (BRACKETT et al.1982) wurden die Methoden der IVP ständig verbessert. Durch Verwendung spezieller Kulturmedien gelang es 1988 erstmalig befruchtete Rinderoozyten in vitro zu präimplantatorischen Embryo- nen weiterzuentwickeln und Trächtigkeiten zu etablieren (GOTO et al. 1988; LU et al. 1988). BERG und BREM beschrieben 1991 ein praktisch nutzbares Verfahren zur In-vitro-Reifung (IVM), -Fertilisation (IVF) und -Kultivierung (IVC) von Rinderembryo- nen, was bis in die heutige Zeit ständig optimiert wurde. Die Effizienz der IVM und IVF erreicht heute 70 bis 90 % (WRENZYCKI 2007), das Entwicklungsstadium der Morula oder Blastozyste erreichen 25-40 % der in vitro fertilisierten und -kultivierten Embryonen (HAGEMANN et al. 1998, RIZOS 2003). Die Trächtigkeitsraten, die nach Transfer in vitro produzierter Embryonen erzielt werden, liegen heute etwa bei 50 %.
Die Trächtigkeitsraten bei Rindern nach Transfer in vivo gewonnener Embryonen liegen höher (55-65%). Auch das Abortrisiko fällt bei transferierten In-vivo- Embryonen geringer aus. Nach Transfer von IVP-Embryonen oder Embryonen er- stellt durch somatischen Kerntransfer wurden multiple Abnormalitäten bei den gebo- renen Kälbern beobachtet. Diese sind unter dem Begriff „Large Offspring Syndrome“
(LOS) zusammengefasst (SINCLAIR et al. 2000; LAZZARI et al. 2002; WRENZYCKI et al. 2004).
Die qualitativen Unterschiede der Embryonen, die sich im Tier entwickeln zu denen, die sich in vitro entwickeln, sind nach wie vor sehr deutlich. Signifikante Unterschiede bestehen vor allem in Morphologie, Metabolismus, Zellzahl, Entwicklungsgeschwin- digkeit, Kryokonservierbarkeit und Genexpression der Embryonen (GREVE et al.
1995; VAN SOOM et al. 1997; GUTIERREZ-ADAN et al. 2004; FARIN et al. 2006;
KHURANA et al. 2000a/b; LOPES et al. 2007; WRENZYCKI et al. 2005).
Diese Unterschiede verdeutlichen die Notwendigkeit einer intensiven Forschung zur Steigerung der Effizienz der IVP und zur Verbesserung der Qualität der daraus ent- stehenden Embryonen. Bis heute können In-vitro-Kultursysteme die dynamisch wechselnde Sekretion des Eileiter- und Uterusepithels nicht vollständig ersetzen. Seit Beginn der Entwicklung der In-vitro-Produktion von Rinderembryonen wurden Teil- schritte deshalb einzeln oder in Kombination im Tier vollzogen, um die künstliche Kulturperiode zu verkürzen. Die Zwischenkultur kann in Eileitern der gleichen (homo- logen) bzw. einer heterologen Spezies stattfinden. Arbeiten von GALLI et al. (2003) belegen die erfolgreiche Produktion qualitativ hochwertiger, in vitro produzierter Rin- derembryonen, die temporär im ligierten Schafeileiter zwischenkultiviert wurden. Au- ßer im ovinen Ovidukt wurden in vitro gereifte und -fertilisierte bovine Embryonen auch im Eileiter des Kaninchens erfolgreich zwischenkultiviert (BOLAND et al. 1984;
ELLINGTON et al. 1990a/b; BESENFELDER et al. 1993).
Eine Zwischenkultur von Embryonen im Rindereileiter erforderte einen operativen Zugang zur Bauchhöhle der Empfängertiere. Diese Verfahren belasten die Tiere stark und sind zudem zeitaufwändig und kostenintensiv. Überdies sind sie nicht oder nur eingeschränkt wiederholbar, da die Tiere für die Rückgewinnung früher Embryo- nalstadien geschlachtet werden mussten. Eine neuentwickelte, minimal-invasive Me- thode stellt die transvaginale Endoskopie dar. Diese ermöglicht den Zugang zu den Eileitern über das Scheidendach des Rindes. Der Eingriff ist wiederholbar und birgt keinerlei nachteilige Effekte für die Tiere (BESENFELDER u. BREM et al. 1998).
Da bislang die Ergebnisse zur Qualität der Embryonen meist auf vergleichenden Studien aus reinen In-vitro-Kulturen bzw. der Embryogewinnung aus dem Tier (In- vivo-Entwicklung) basieren, ist es sinnvoll, in vitro produzierte Embryonen unter an- gepassten, optimalen Bedingungen mit Hilfe der transvaginalen Endoskopie in den Eileiter zyklussynchronisierter Rinder zu übertragen, um hohe Produktionsraten (In- vitro-Produktion) mit optimierten Entwicklungsbedingungen (Eileitermilieu) zu kombi- nieren.
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Versuche, in denen die Überlebensrate nach Kryokonservierung von Blastozysten aus IVP und In-vivo-Produktion und temporärer In-vivo-Kultur verglichen wurden, konnten bereits zeigen, dass sich die Qualität der im Eileiter zwischenkultivierten Embryonen deutlich verbessert hat (RIZOS et al. 2002b).
Auf Ebene der mRNA-Expression wurden vergleichende Studien zwischen in vivo und in vitro produzierten präimplantatorischen Rinderembryonen durchgeführt. Diese zeigten auf, dass die mRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene bei Embryo- nen im Morula- und Blastozystenstadium aus in vitro Produktion sowie nach somati- schem Kerntransfer im Vergleich zu der in vivo generierter Stadien nach Uterusspü- lung häufig verändert ist (LAZZARI et al. 2002; WRENZYCKI et al. 2005b). Das Ex- pressionsmuster entwicklungsrelevanter Gene in vivo produzierter Embryonen dient für solche Analysen als „goldener Standard“. Blastozysten aus einer In-vivo-Kultur boviner in vitro produzierter Zygoten im ligierten Schafeileiter wiesen ebenfalls ein verändertes mRNA-Expressionsmuster im Vergleich zu vollständig in vivo erzeugten Blastozysten auf. Jedoch waren die Unterschiede deutlich geringer als zwischen IVP- und in vivo produzierten Embryonen (LAZZARI et al. 2002).
Bei der Entstehung des LOS und anderen Störungen während der Embryonalent- wicklung werden anhaltende Abweichungen vom normalen mRNA- Expressionsmuster entwicklungsrelevanter Gene, bedingt durch Änderungen epige- netischer Modifikationen während des frühembryonalen Wachstums vermutet (NIE- MANN u. WRENZYCKI 2000). Epigenetische Mechanismen, wie DNA-Methylierung und Histonmodifikationen, sind für die Regulation der embryonalen Gentranskription von herausragender Bedeutung (WRENZYCKI et al. 2005a). Für die DNA- Methyltransferasen 1 und 3a (DNMT1, DNMT3a) sowie für die Histonmethyltransferase SUV39H1 konnten unterschiedliche Transkriptmengen bei Embryonen aus In-vivo- und In-vitro-Produktion festgestellt werden (WRENZYCKI u.
NIEMANN 2003).
Für die korrekte Entwicklung der Embryonen ist ein ungestörter Energiemetabolis- mus eine Voraussetzung. Dabei spielt das Energiesubstrat Glukose eine besondere Rolle. Die Aufnahme und Verfügbarkeit von Glukose ist für den Embryo essentiell.
Der Glukosemetabolismus ist an die Expression spezieller Transmembranproteine, den Glukosetransportern (Solute Carrier 2A) gebunden. Es konnte bereits aufgezeigt werden, dass eine In-vitro-Kultur boviner Embryonen die mRNA-Menge von SLC2A3 und SLC2A8 in Blastozysten im Vergleich zu den Embryonen, die komplett im Tier erzeugt wurden, verändert (KNIJN et al. 2005).
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden bovine Embryonen in vitro produziert.
Ein Teil der erstellten Zygoten wurde in vitro bis zum Stadium der Morula/Blastozyste kultiviert und zur mRNA-Analyse eingefroren, während die anderen Zygoten zyklus- synchronen Färsen für eine temporäre Eileiterkultur in den nicht ligierten Eileiter mit- tels transvaginaler Endoskopie übertragen wurden. Nach 6-8 tägiger Kultur erfolgte eine Rückspülung der Stadien. Diese Morulae und Blastozysten wurden ebenfalls zur mRNA-Analyse eingefroren. Desweiteren wurden In-vivo-Embryonen nach Synchro- nisation, Superovulation und künstlicher Besamung der Spendertiere mittels Uterus- spülung an Tag 7 und Tag 8 gewonnen und eingefroren. Im anschließenden zweiten Teil der Arbeit erfolgte die vergleichende Darstellung der mRNA-Expressionsmuster der entwicklungsrelevanten Gene DNMT1, DNMT3a, SUV39H1, GLUT3 und GLUT8 in den Embryonen der drei verschiedenen Herkünfte mittels RT-qPCR.
5 2 Schrifttum
2.1 Physiologische und anatomische Grundlagen der Fortpflanzung des Rin- des
2.1.1 Zyklus des Rindes
Als Sexualzyklus werden alle morphologischen, hormonellen und biochemische Ver- änderungen bezeichnet, die periodisch beim weiblichen Tier auftreten. Diese Verän- derungen bewirken die Bereitstellung einer oder mehrerer Eizellen, die Paarungswil- ligkeit wird gewährleistet und die Gebärmutterschleimhaut wird auf die Aufnahme des Embryos vorbereitet (SCHNORR 2001, S. 25).
Rinder gehören zu den asaisonal polyöstrischen Tieren. Die Brunst tritt im Abstand von 21 Tagen über den gesamten Jahreszeitraum auf. Eine Zykluslänge beträgt also 21 (17-24) Tage. Im Proöstrus bewirkt Prostaglandin F2α am Ovar die Auflösung des Gelbkörpers. Mit der Luteolyse startet im Follikel die vermehrte Bildung von Östroge- nen. Dadurch beginnen sich die Brunstsymptome, u.a. die vermehrte Ödematisierung der Vulva und das Bespringen anderer Kühe, auszubilden. Durch das Absinken des Progesteronspiegels wird wieder vermehrt GnRH im Hypothala- mus freigesetzt. Dies führt zu einer gesteigerten Ausschüttung von FSH, wodurch das Wachstum des dominanten Follikels stimuliert wird. Auch LH wird vermehrt aus- geschüttet. Der Östrus bzw. der Tag der Brunst ist Tag 0 im Zyklus. Rein äußerlich ist der Östrus durch Aufspringen, Unruhe, Brüllen, Abgang von Brunstschleim und positiven Duldungsreflex gekennzeichnet. Hierfür ist die hohe Konzentration von Öst- rogenen verantwortlich. Durch die weiter steigende GnRH-Ausschüttung erreichen FSH und LH ihre höchsten Werte. Die Brunst hat eine relativ kurze Dauer von durch- schnittlich 18 Stunden. Die Ovulation findet 6-12 Stunden nach Brunstende im Metöstrus statt. In dieser Phase findet die Umwandlung des Corpus haemorrhagicum in das Corpus luteum statt. Zirka 4 Tage nach der Ovulation beginnt die Progesteronkonzentration im Blut auf messbare Werte anzusteigen. Damit wird der
Diöstrus eingeleitet (RÜSSE und SINOWATZ 1998, S. 93-116). Bei ausbleibender Trächtigkeit kündigt sich im darauffolgenden Proöstrus der neue Zyklus durch das Einsetzen der typischen Verhaltensweisen wieder an.
2.1.2 Eileiter und Uterus des Rindes
Der Eileiter des Rindes (Abb. 1), auch Tuba uterina, Ovidukt oder Salpinx genannt, ist ein häutig-muskulöser Schlauch, der dem Auffangen und Weitertransport der ovulierten Eizelle und der Kapazitation der Spermien dient. Er verläuft stark gewun- den und hat beim Rind eine Länge von etwa 25cm (SALOMON 2004, S. 379-389).
Der Ursprung des Ovidukts ist unmittelbar am Ovar. Der Eileiter steht aber nicht in kontinuierlichem Zusammenhang mit dem Eierstock. Kaudal mündet er am uterotubalen Übergang in die Gebärmutter. Die Tubae uterinae sind paarig angelegt.
Sie beginnen mit dem Eileitertrichter, Infundibulum tubae uterinae, mit dem sie die ovulierte Eizelle aufnehmen. Der Trichterrand ist mit feinen Fortsätzen, den Eileiter- fransen (Fimbriae tubae), besetzt. Die Eileiterfransen können teilweise mit dem Ovar verwachsen sein. Der Fimbrientrichter ist beim Rind so groß, dass er das Ovar voll- ständig umfassen kann (LEISER 1999, S. 424-433). In der Mitte des Trichters befin- det sich die Bauchhöhlenöffnung des Eileiters, das Ostium abdominale tubae uterinae. Auf die Bauchhöhlenöffnung folgt ein relativ großkalibriger, gewunden ver- laufender Abschnitt, die Ampulla tubae uterinae. Hier findet für gewöhnlich die Be- fruchtung statt. Die Ampulle geht in einen sehr stark gewundenen, engen Abschnitt, dem Isthmus tubae uterinae über. Mit der Uterusöffung, Ostium uterinae tubae, mün- det er schließlich im gleichseitigen Uterushorn. Der Eileiter hängt an einem eigenen Gekröse, der Mesosalpinx, welches parallel zum Eierstocksgekröse verläuft. Zwi- schen den Gekrösen beider Organe ist ein von kranioventral her zugänglicher Raum, die Eierstockstasche (Bursa ovarica) ausgebildet. Die Blutversorgung des Ovidukts erfolgt über die Arteria und Vena ovarica (SALOMON 2004, S.379-389).
Die Wand des Eileiters setzt sich von innen nach außen aus der Tunica mucosa, Tunica muscularis, Tela subserosa und Tunica serosa zusammen. Die Schleimhaut
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des Eileiters zeigt dichte, verzweigte Längsfalten, die zum Isthmus hin abnehmen.
Das Epithel ist einschichtig, iso- bis hochprismatisch und setzt sich aus sekretori- schen Zellen (Drüsenzellen) und Zilien tragenden Zellen (Flimmerzellen) zusammen.
Die Mukosa unterliegt zyklusabhängigen Umbauvorgängen, um optimale Stoffwech- selbedingungen für die Eizelle bzw. die frühembryonalen Entwicklungsstadien zu schaffen. Die Drüsenzellen geben schwach sauren Schleim, Elektrolyte, Enzyme, Albumine, Zucker und Aminosäuren zur Versorgung des frühen Embryos bzw. zur Enddifferenzierung/Endreifung der Gameten in das Eileiterlumen ab. Die Flimmerzel- len sind mit Kinozilien besetzt, welche einen aktiven Flüssigkeitsstrom in Richtung Uteruslumen unterstützen. Die Tunica muscularis der einzelnen Eileiterabschnitte ist unterschiedlich stark entwickelt. Im Eileitertrichter und in der Ampulla sind die glatten Muskelschichten sehr dünn, lediglich im Bereich des Isthmus sind sie verstärkt und durch einen vorherrschend spiraligen Verlauf gekennzeichnet (LIEBICH 1999, S.
295-299).
Die Gebärmutter des Rindes ist ein Hohlorgan, das der Aufnahme des Embryos und dessen Entwicklung bis zur Geburt dient (SALOMON 2004, S. 379-389), desweiteren fördert sie den Transport der Spermien in Richtung Eileiter und deren Kapazitation.
Um diesen Aufgaben gerecht zu werden, unterliegt die Gebärmutter strukturellen Umbauvorgängen, die unter dem Begriff des uterinen Zyklus zusammengefasst wer- den und eine optimale Implantation und Plazentation des Keimes ermöglichen (LIE- BICH 1999, S.295-299). Die Gebärmutter des Rindes (Abb. 1) ist ein Uterus bicornis.
Sie wird in die Abschnitte Gebärmutterhals (Cervix uteri), Gebärmutterkörper (Corpus uteri) und in die paarigen Uterushörner (Cornua uteri) eingeteilt. Die Hörner sind wid- derartig aufgerollt und ca. 35-45cm lang, sie münden in den etwa 3cm langen Kor- pus. Die Cervix uteri liegt zwischen Gebärmutterkörper und Scheide und dient dem Verschluss des Uterus. Sie ist beim Rind 15-20cm lang und ragt zapfenartig (Portio vaginalis) in die Scheide vor. Der Canalis cervicales liegt zwischen äußeren und in- neren Muttermund und ist außer in der Brunst und zur Geburt durch Längs- und kräf- tige Ringfalten verschlossen (SALOMON 2004, S. 379-389).
Histologisch gliedert sich die Wand des Uterus in das Endometrium, das die lumenseitige Schleimhautauskleidung bildet, das Myometrium, welches aus einer zirkulären und longitudinalen Muskelschicht besteht und das Perimetrium, ein außen anliegendes, einschichtiges Epithel. Das Endometrium setzt sich aus dem Oberflä- chenepithel und der Lamina propria mucosae zusammen. Grundsätzlich ist das Oberflächenepithel einschichtig und hochprismatisch, es kann jedoch beim Rind stel- lenweise auch mehrreihig sein. Die Endometriumszellen tragen Kinozilien (Flimmer- zelle) oder Mikrovilli (sezernierende Zelle). Beim Rind besitzt die Schleimhaut große, knollige drüsenfreie Bezirke, die Karunkel (Carunculae), diese vergrößern sich in der Trächtigkeit und dienen der Verbindung zwischen maternaler Schleimhaut und fetaler Fruchthülle (LIEBICH 1999, S. 295-299).
Abbildung 1: Ovar, Eileiter und Uterus des Rindes, Seitenansicht (Nickel, Schummer, Seiferle 1999)
2.1.3 Präimplantatorische Embryonalentwicklung
Die Embryonalentwicklung beginnt mit der Befruchtung der gereiften Oozyte durch ein kapazitiertes Spermium und somit mit der Vereinigung des väterlichen und müt- terlichen Erbgutes bei der Verschmelzung der Vorkerne der beiden Gameten. Der
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Ort der Befruchtung ist die Eileiterampulle (Abb. 2). Durch die Verschmelzung der hapoliden Vorkerne der Keimzellen entsteht eine diploide Zygote, die sich in der Pro- phase der ersten mitotischen Teilung befindet. Die präimplantatorische Embryonal- entwicklung gliedert sich in die ersten Teilungen bis hin zur Morula, die Kompaktierung der Morula, die Differenzierung der Blastomeren in Zellen des Trophektoderms und der inneren Zellmasse, die Blastulation mit Kavitation und Blastozoelexpansion und schließlich dem Schlupf der expandierten Blastozyste aus der Zona pellucida (SCHNORR 2001, S. 33-74).
Nach der Befruchtung der Eizelle finden die ersten Teilungen während der Wande- rung des frühen Embryos im Eileiter tierartspezifisch statt, so dass beim Rind nach 2 bis 2½ Tagen (p.i.) 2-Zeller, nach 2½ Tagen (p.i.) 4-Zeller sowie nach 4 Tagen (p.i.) 8-Zell-Stadien entstanden sind. Als 16-Zellstadium erreicht der Embryo über das Ostium uterinae tubae die Uterushornspitze (SCHNORR, 2001, S. 33-74). Nach 5-6 Tagen (p.i.) entwickelt sich im Uterus das Morulastadium. Sechs bis 8 Tage nach der Befruchtung entwickelt sich beim Rind das Blastozystenstadium. In diesem Stadium differenziert sich der Embryo in zwei Zelllinien, die Embryoblastzellen (inner cell mass, ICM) und die Trophoblastzellen (Trophektoderm). Aus den Zellen der inneren Zellmasse entwickelt sich später der Rinderfetus, aus den Zellen des Trophektoderms gehen Chorion und Ammnion (Fruchthüllen) hervor. Am Tag 9 (p.i.) schlüpft die expandierte Blastozyste aus der Zona pellucida, darauf folgt eine Phase des Längenwachstums (Elongation) des Embryos. An Tag 18 - 19 beginnt die Im- plantation. An Tag 22 füllt die elongierte Blastozyste den Uterus ganz aus. Die Er- kennung und Aufrechterhaltung der Gravidität von Seiten des Muttertieres erfolgt spätestens an Tag 17/18 (RÜSSE und SINOWATZ 1998, S. 93-116).
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Ovulation, Befruchtung und Furchung beim Säugetier (Schnorr 2001)
2.2 Generierung von Embryonalstadien beim Rind 2.2.1 In-vitro-Produktion von Rinderembryonen
Die In-vitro-Produktion boviner Embryonen basiert nach der Gewinnung der Eizellen im Wesentlichen auf drei Schritten: der In-vitro-Reifung (IVM), In-vitro-Fertilisation (IVF) und In-vitro-Kultur (IVC) der befruchteten Eizelle (NIEMANN u. MEINECKE 1993).
Die für die In-vitro-Produktion benötigten Eizellen können durch ultraschallgeleitete Follikelpunktion (Ovum pick-up, OPU), erstmalig beschrieben durch PIETERSE et al.
(1988), durch Laparoskopie (RATH, 1993) oder aus Ovarien von Schlachttieren ge- wonnen werden. Die am häufigsten angewandten Techniken zur Oozytengewinnung aus Schlachthofovarien sind die Aspirations- und die Slicingmethode (ECKERT u.
NIEMANN 1995). Aus den gewonnenen Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) wer- den solche für die IVP ausgewählt, die von mindestens 3-6 Zelllagen Kumulus um- schlossen sind und ein homogenes Ooplasma aufweisen (NIEMANN u. MEINECKE
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1993). Die unreifen Eizellen müssen vor ihrer Befruchtung in Medien, denen entspre- chende Reifungshormone zugesetzt werden, in vitro gereift werden. Die Reifung der Oozyten (Maturation) ist die Voraussetzung für eine erfolgreiche Fertilisation und gliedert sich in die Kernreifung (nukleäre Maturation) und in die Reifungsvorgänge im Ooplasma (zytoplasmatische Reifung). Die Eizellen setzen in den Reifungsmedien die Meiose fort, die zuvor arretiert war (SIRARD u. COENEN 2006). Je nach Morpho- logie der KOK und der Kulturbedingungen können Maturationsraten (Kernreifung) von 85-95% erreicht werden (ADONA et al. 2008). Die Angaben zur optimalen Rei- fungszeit variieren zwischen 14 und 26 Stunden. Einerseits sollen die Oozyten so- lange reifen, bis möglichst viele Eizellen die Metaphase II erreicht haben, anderer- seits soll das Auftreten von Degenerationserscheinungen durch eine Überreifung, welche die Weiterentwicklungsfähigkeit der Eizellen negativ beeinflusst, so gering wie möglich gehalten werden. Die IVM wird in komplexen Medien durchgeführt, die Puffer, Aminosäuren, organische Verbindungen, Serum oder Serumersatzstoffe (BSA, PVA), Hormone und Wachstumsfaktoren sowie Antibiotika enthalten (SAGIRKAYA et al. 2007). Trotzdem weisen in vitro gereifte Oozyten häufig eine verminderte Entwicklungskompetenz im Vergleich zu in vivo gereiften Eizellen auf (MOOR et al. 1998; WATSON et al. 2000; LIM et al. 2008). Zur Kontrolle der In-vitro- Reifung kann ein Teil der maturierten Eizellen enzymatisch entkumuliert und lichtmik- roskopisch auf den Reifungsstatus und die Qualität beurteilt werden. Das Vorhan- densein eines Polkörpers sowie Farbe und Homogenität des Ooplasmas werden als Parameter zur Beurteilung verwendet (HASHIMOTO et al. 1998).
Bei der In-vitro-Fertilisation erfolgt die Befruchtung gereifter Eizellen unter definierten Bedingungen außerhalb des weiblichen Genitaltraktes (HEYNER und TUCKER, 2000; PARRISH et al., 1988). Rinderspermien haben im Gegensatz zu Eizellen ihre Reifeteilungen zum Zeitpunkt der Befruchtung bereits beendet. Es müssen jedoch noch zwei wesentliche Vorgänge (Kapazitation und Akrosomreaktion) durchlaufen werden, bis sie ihre endgültige Befruchtungsfähigkeit erlangen. Zur Befruchtung der in vitro gereiften Eizellen wird meistens tiefgefrorenes und aufgetautes Bullensperma verwendet. Die Spermien werden vor ihrer Verwendung einer Selektionsprozedur unterzogen (PARRISH et al., 1995). Um Spermien zu erhalten, die eine ausreichen-
de Motilität besitzen und kapazitiert sind, wird häufig eine Dichtegradientenzentrifugation mit dem aufgetauten Bullensperma durchgeführt.
Früher wurde für diesen Vorgang häufig Isopercoll genutzt. Dieses ist jedoch auf- grund fehlender klinischer Prüfung weder für den human- noch den veterinärmedizi- nischen Bereich zugelassen. Stattdessen werden heute zugelassene, kommerziell erhältliche Silikate verwandt (Spermfilter®, Cryo Bio System; Pure Sperm® und Bovi Pure®, Nidacon).
Durch Inkubation in speziellen Medien (HHE = Heparin, Hypotaurin, Epinephrin, wo- bei Heparin die Akrosomenreaktion auslöst) werden die Spermien kapazitiert (NIE- MANN u. MEINECKE 1993). Die Kapazitation ist die Voraussetzung für den Ablauf der Akrosomreaktion und damit für die Verschmelzung von Spermium und Eizelle (ESTEVES et al. 2000). Die maturierten Oozyten und motile, kapazitierte Spermien werden in speziellen Fertilisationsmedien unter definierten Bedingungen für 6-24h koinkubiert (HEYNER und TUCKER, 2000). Ein häufig eingesetztes Medium für die In-vitro-Fertilisation ist das TALP- (Tyrode‟s Albumin Lactate Pyruvate) Medium (BAVISTER und YANAGIMACHI 1977; SAEKI et al. 1995), welches in Verbindung mit Kapazitierungs- bzw. Motilitätsfaktoren wie Heparin (PARRISH et al. 1988), Penicillamin (ANDREWS und BAVISTER, 1989), Hypotaurin und Epinephrin (LEIBFRIED und BAVISTER, 1982) eingesetzt wird.
Nach etwa 18-20h Kokultur von Eizellen und Spermien werden die Kumuluszellen von den Oozyten entfernt (Hyaluronidase-Behandlung, Vortexen oder Pipettieren).
Nach diesem Vorgang werden sie bis zum Morulae- bzw. Blastozystenstadium kulti- viert, wobei unterschiedliche Kulturmedien und -techniken zum Einsatz kommen. Die Kulturmedien waren meist sehr komplex zusammengesetzt und unterschieden sich im Wesentlichen im Gehalt an Energiesubstraten, Aminosäuren und Nukleinsäurevorstufen. Das am häufigsten verwendete Medium war lange Zeit das Tissue Culture Medium-199 (TCM-199, FUNAHASHI et al. 1991; PEUCKMANN 2000). Serum (undefiniert), Serumbestandteile (semidefiniert, z.B. Bovines Serumal- bumin / BSA) oder Serumersatzstoffe (definiert, z.B. Polyvinylalkohol/ PVA) werden dem Kulturmedium zugesetzt, um den Embryonen wichtige Substrate für ihre Ent-
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wicklung zur Verfügung zu stellen, sowie das Handling zu verbessern (z.B. kein Auf- schwemmen der Embryonen). Trotz erfolgreicher Embryonenproduktion und Etablie- rung von Trächtigkeiten nach dem Transfer von Embryonen aus diesen IVC- Systemen wurden weitere Kultursysteme entwickelt, um die Entwicklungsraten zu erhöhen (FARIN et al. 2001) und die Vergleichbarkeit der Systeme untereinander zu verbessern. Es erfolgte die Entwicklung definierter und standardisierbarer Kultursys- teme. Hierzu zählt z.B. das Chatot-Ziomek-Bavister-Medium (CZBM, CHATOT et al.
1989). KAJIHARA et al. (1999) verwendeten erfolgreich das Charles Rosenkrans 1 Medium (CR1 Medium). Das Medium „Synthetic Oviductal Fluid “ (SOF) gewann für die IVC zunehmend an Bedeutung (TERVIT et al. 1972; MATSUYAMA et al. 1993;
HOLM et al. 1999), heute ist es das Standardmedium in der IVC. Beim SOF- Protokoll ist der wesentliche Unterschied die auf 5 % reduzierte Sauerstoffkonzentra- tion in der Gasatmosphäre. Im SOF-Medium wurde auch zum Beispiel bovines Se- rumalbumin (BSA) durch Makromoleküle wie das PVP (Polyvinylpyrrolidon) oder PVA (Polyvinylalkohol) ersetzt und somit ein definiertes Medium geschaffen (KESKINTEPE u. BRACKETT 1996). Unter Verwendung dieser Kulturmedien (TCM- 199, SOF, HECM) können Entwicklungsraten bis zur Blastozyste von über 40 % er- zielt werden (KESKINTEPE u. BRACKETT 1996; KRISHER et al. 1999). In definier- ten Medien sind die Entwicklungsraten meistens niedriger als in semi-definierten (BSA) oder undefinierten (Serum) Kulturmedien (ECKERT u. NIEMANN 1995;
KESKINTEPE u. BRACKETT 1996; WRENZYCKI et al. 1999, 2001).
Da komplexe Zusätze wie Serum oder Serumproteine (z.B. BSA) potentiell kontami- niert sein können oder wachstumsinhibierende Faktoren beinhalten können, wurden Studien über die Entwicklungsfähigkeit von bovinen Embryonen in proteinfreien Me- dien getätigt. HECM (hamster embryo culture medium), mKSOM und andere Basis- medien wurden mit verschiedenen Aminosäuren, Glucose, Pyruvat, Lactat und Phosphat versetzt und der osmotische Druck in den Medien wurde verändert (BAVISTER 1995). Der osmotische Druck hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Entwicklungsfähigkeit der Embryonen. Die Entwicklungsfähigkeit unter Zusatz von Aminosäuren hängt jedoch von der Zusammensetzung des Basismediums ab. Es konnte gezeigt werden, dass sich Embryonen in Medien mit Glukosesupplementation
schneller entwickelten als Embryonen in Medien, denen Puruvat und/oder Phosphat zugesetzt waren (WIRTU et al. 2003).
Studien über den Einfluss verschiedener Proteinzusätze oder Makromolekülsupple- mentationen in Reifungsmedien auf die Menge an Transkripten von Genen (cell survival genes) in in vitro erzeugten Blastozysten zeigten, dass diese Zusätze einen signifikanten Effekt auf die untersuchte Transkriptmenge in den Blastozysten hatten.
Genutzt wurden folgende Reifungsmedien: TCM199+ 10% FBS, TCM199 + 6% fett- freies BSA und TCM199 + 4% PVP. So erhöhten sich zum Beispiel die Transkriptmengen für die Growth Factor kodierenden Gene (IGF1R, IGF2, IGF2R) in Embryonen, die in TCM199+fafBSA kultiviert wurden (WARZYCH et al. 2007). In ei- ner Studie überprüften WRENZYCKI et al. (2000) den Einfluss von SOF-Medium und TCM-199 sowie verschiedener Proteinquellen auf die relative Häufigkeit von 10 ent- wicklungsspezifischen Gentranskripten. Das Kulturmedium hatte einen starken Effekt auf die Transkriptionsaktivität der Embryonen, der Effekt der Proteinquelle war gerin- ger. WRENZYCKI et al. (2000) stellten fest, dass die Entwicklung in SOF-Medium der In-vivo-Entwicklung ähnlicher war als die Entwicklung in TCM-199. Unterschiede in der Expression entwicklungsrelevanter Gene zwischen IVP- und In-vivo- Embryonen bestanden allerdings trotz der Verwendung von SOF-Medium.
Glukoseaufnahme und Entwicklungsfähigkeit von Rinderblastozyten scheinen positiv zu korrelieren (DORLAND et al. 1992). In dem definierten Kulturmedium SOF wirken sich geringe Glukosekonzentrationen von 1,5mM positiv auf die Blastozystenentwicklung aus (BRACKETT et al. 1997; IWATA et al. 1998). Eine Kul- tur von Zygoten ohne Glukose für 24h und das anschließende Wachstum in einem Medium mit 1,5mM bzw. 3,0mM Glukose erhöhte die Blastozystenrate (FURNUS et al.1997), während hohe Konzentrationen von 4,5mM bzw. 5mM die Entwicklung hemmten (FURNUS et al. 1997; IWATA et al. 1998).
15 2.2.2 Gewinnung uteriner Embryonalstadien
Die Gewinnung uteriner Embryonalstadien wird beim Rind im Rahmen des Embryo- transfers seit den 1970er Jahren routinemäßig durchgeführt. Damals erfolgte die Gewinnung blutig, durch einen Einschnitt ins Scheidendach (TESTART u. GO- DARD-SIOUR , 1975). Durch den so entstandenen Zugang wurde eine an einen Bal- lonkatheter befestigste Spülkanüle in die Bauchhöhle vorgeschoben und ins Gebär- mutterhorn inseriert. Den Katheter fixierte der Operateur, indem der Ballon aufgebla- sen wurde. Im Anschluss folgte die Spülung des Uterushorns.
Heutzutage wird eine unblutige, transzervikale Spülmethode angewandt (BAKER u.
JILLELLA 1978; BOUTERS et al. 1978; HAHN 1978; GÖRLACH 1997). Die Spülung erfolgt am stehenden, meist superovuliertem Tier. Ein flexibler Ballonkatheter wird mit Hilfe eines Mandrin versteift und unter rektaler Kontrolle durch die Vagina, Zervix und das Corpus uteri in eines der beiden Gebärmutterhörner eingeführt. Wenn die Spitze des Ballonkatheters die große Kurvatur des entsprechenden Hornes erreicht hat, wird der Mandrin ca. 10cm zurückgezogen. Die flexible Katheterspitze wird vor- sichtig weiter nach kranial vorgeschoben. Sobald der Katheter im vorderen Drittel des Uterushorns positioniert ist, wird er durch Aufblasen des Ballons dort fixiert (NIEMANN u. MEINECKE 1993a). Die Spülung des abgedichteten Uterushorns kann nun ohne Flüssigkeitsverluste erfolgen. Als Spülmedium wird in den meisten Fällen 37°C warme, phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit einem Zusatz von 1-2 % hit- zeinaktiviertem Serum verwendet. Die Spülung erfolgt in Etappen und die rückge- wonnene Flüssigkeit wird in einem Glasgefäß aufgefangen. Nach der Spülung des ersten Uterushornes wird die Spülung des zweiten Hornes auf die gleiche Weise vorbereitet und vorgenommen.
Eine andere Möglichkeit uterine Embryonalstadien unblutig zu gewinnen ist, einen Ballonkatheter direkt hinter der Zervix zu fixieren. Es wird so die gesamte Gebärmut- ter gespült, ohne den Katheter umlegen zu müssen. Der aufgeblasene Ballon kann allerdings eines der Uterushörner verlegen und somit eine vollständige Spülung ver- hindern (SEIDEL u. SEIDEL 1991).
Durchschnittlich werden pro Spenderkuh fünf bis acht transfertaugliche Embryonen durch transzervikale Uterusspülung gewonnen, die ca. 60-80 % Gewinnungsrate (Anzahl gewonnener Embryonen im Verhältnis zu der Anzahl an Gelbkörpern) aus- machen. Die Nachkommenrate der durch Spülung gewonnenen und anschließend transferierten Embryonen liegt zwischen 50-60 % (GELDERMANN 2005, S. 351- 359). Eines der größten Probleme bei der In-vivo-Gewinnung liegt in der hohen Vari- abilität der Ovarreaktionen (ADAMS 1994). Neben der Auswirkungen wiederholter Superovulationsbehandlungen haben auch der Ernährungsstatus, das Alter, die Rasse, und die reproduktive Vergangenheit des Spendertieres Einfluss auf die Emb- ryonenausbeute bei der unblutigen Uterusspülung (MAPLETOFT et al. 2002;
MAPLETOFT et al. 2006).
2.2.3 In-vivo-Kultur in vitro produzierter Embryonen
Gerade um neue Wege zum Verständnis der embryo-maternalen Kommunikation aufzeigen zu können, ist es unumgänglich, In-vitro-Methoden mit den physiologi- schen Abläufen im Eileiter zu kombinieren. Im Gegensatz zur vollständigen Embryo- nalentwicklung im Tier bietet die In-vitro-Produktion von Embryonen einen guten Ein- blick für wissenschaftliche Fragestellungen, da eine große Anzahl weiblicher Keim- zellen genutzt werden kann. Dennoch liegen IVP-Embryonen durch ihre geringere Qualität hinter den Embryonen zurück, deren Entwicklung vollständig im Tier abläuft.
In vivo gewonnene Embryonen besitzen gute qualitative Eigenschaften, dennoch ist deren Gewinnung erheblich eingeschränkt. So reagieren nur 1/3 aller synchronisier- ten und superovulierten Tiere adäquat auf die Hormonstimulation. Unterschiede zwi- schen in vitro produzierten Embryonen und in vivo gewonnenen Embryonen (Tabelle 1) sind also nach wie vor deutlich (FARIN und FARIN, 1995; THOMPSON 1997;
HOLM et al., 2002).
Da sich diese markanten Unterschiede meist auf Vergleichsstudien von Embryonen aus reiner In-vitro-Produktion mit denen, die sich vollständig im Tier entwickelt ha- ben, beziehen, wurden in vitro produzierte Embryonen in Eileiter von Zwischenemp- fängern übertragen und dort kultiviert, um das Entwicklungspotential des Ovidukts zu
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nutzen und die Zeitspanne in einer künstlichen Umgebung und damit den möglichen negativen Einfluss der In-vitro-Kultur auf die Embryonalentwicklung so gering wie möglich zu halten.
Tabelle 1: Unterschiede zwischen in vitro und in vivo erzeugten Embryonen In vivo
produzierte Embryonen
In vitro
produzierte Embryonen Morphologie
Farbe
Perivitelliner Raum
Kompaktierung
Gesamtzellzahl (expand. Blastozyste)
hell
groß
stark ausgeprägt
140–160
dunkel
(insbesondere nach Kultur in serumhaltigen Medien)
klein
schwach ausgeprägt
höher, ähnlich, geringer
ICM-Zellen (Blastozyste) 40 weniger
Gefriertauglichkeit gut geringer
Temperaturempfindlichkeit gering hoch
Trächtigkeitsraten 55-65% 40-60%
höhere fetale Verluste im letz- ten Drittel der
Trächtigkeit nach Transfer von IVP-Embryonen
Metabolismus ATP-, O2-, Glukose- und Pyruvataufnahme
ungestört niedrigere Aufnahmen in IVP- Embryonen
Chromosomale Abberationen (Tag-5-Embryonen)
31 % 42 %
Expressionsmuster entwicklungsrel.
Gentranskripte
ungestört erhöht, ähnlich, erniedrigt
Als Zwischenempfänger sind sowohl heterologe als auch homologe Spezies verwen- det worden. Im Jahr 1955 wurde in einer Studie erstmalig aufgezeigt, dass sich be- fruchtete Schafeizellen in den Eileitern von pseudograviden Kaninchen normal entwi- ckeln können (AVERILL et al. 1955). Seit dieser Zeit gab es Reihe von Veröffentli- chungen über die Entwicklungsfähigkeit verschiedener fertilisierter Säugtiereizellen zu präimplantatorischen Embryonen im Ovidukt des Kaninchens (BOLAND 1984).
Der Zugang zu den Eileitern der Tiere erfolgte chirurgisch durch einen Einschnitt in der Linea alba (SIRARD u. LAMBERT 1986) oder laparoskopisch (BESENFELDER et al. 1998). Über den Eileitertrichter wurden die Embryonen in die Eileiterampulle transferiert. Die In-vivo-Kultur im Kaninchen fand im ligierten Ovidukt statt, um Emb- ryoverluste via Uterus und Cervix zu vermeiden. In einer Arbeit im Jahr 1986 wurde aufgezeigt, dass die In-vivo-Kultur im Kanincheneileiter bovinen Embryonen bessere physiologische Konditionen bietet als die reine In-vitro-Kultur der Embryonen (SIRARD u. LAMBERT 1986). Es konnten Trächtigkeiten mit Geburten gesunder Kälber nach Embryotransfer der im Kanincheneileiter zwischenkultivierten Embryo- nen erzeugt werden.
Eine weitere Möglichkeit, eine temporäre In-vivo-Kultur bei einer heterologen Spezies durchzuführen, bietet der Eileiter des Schafes. LU et al. konnten in ihrer 1988 veröf- fentlichen Arbeit Entwicklungsraten (zur Morula/Blastozyste) von 60 % für Embryo- nen, die in vitro gereift, in vitro fertilisiert und anschließend im Schafeileiter zwi- schenkultiviert wurden, aufzeigen. In einer weiteren Studie wurden 668 befruchtete bovinen Eizellen in ligierte Schafeileiter transferiert. Der Zeitpunkt des Transfers der befruchteten Oozyten war auf den Ovulationszeitpunkt der Tiere terminiert. Nach 6- tägiger Eileiterkultur konnten 63% der übertragenen Stadien wiedergefunden wer- den, 46% erreichten das Morula bzw. Blastozystenstadium (LU et al. 1988). Die Verwendung von IVF-generierten Embryonen, die im ligierten Schafeileiter zwi- schenkultiviert wurden, ist mittlerweile als Standardmethode etabliert und sowohl in wissenschaftlichen (LAZZARI et al. 2002; LONERGAN et al. 2003b) als auch in um- fangreichen praktischen Bereichen (GALLI et al. 2003) angewendet worden. Der ho- he Aufwand dieser Produktionsmethode wird in Kauf genommen, da die Embryonen aus der Zwischenkultur im Schafovidukt ein höheres Entwicklungspotential besitzen.
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Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass in vitro produzierte Zygoten nach einer In- vivo-Kultur im Schafeileiter eine deutlich verbesserte Qualität aufwiesen. Qualitäts- merkmale waren Kryotoleranz und Genexpressionsmuster der Embryonen. Die Er- gebnisse für die Eileiterkultur-Blastozysten waren vergleichbar mit denen von Blastozysten aus reiner In-vivo-Kultur. Blastozysten aus der IVP wiesen eine niedrige Kryotoleranz im Gegensatz zu denen aus den anderen Gruppen auf (ENRIGHT et al.
2000; RIZOS et al. 2002a; LONERGAN et al. 2003a). Desweiteren wurde auf Gen- expressionsebene (Tabelle 2) festgestellt, dass Blastozysten aus der temporären In- vivo-Kultur in vitro produzierter Embryonen, die aus dem Tier gewonnen wurden, ei- ne niedrigere Expression zum Beispiel für Gene wie BAX (Apoptose) oder SOX (Stress) zeigten als Blastozysten aus einer reinen In-vitro-Kultur (LAZZARI et al.
2002; RIZOS et al. 2002b; LONERGAN et al. 2003b; GUTIERREZ-ADAN et al.
2004).
Tabelle 2: MessengerRNA-Expressionsmuster in Blastozysten unterschiedlicher Her- kunft und in Relation zu anderen Qualitätsparametern (Wrenzycki 2007, modifiziert) Qualitätsmarker/Herkunft Transkripthäufigkeit
(Anstieg↑ oder Abfall↓) Referenzen
Respiration SLC2A1↑, G6PD↑ LOPES et al. 2007
Qualität der sNT-Blastozysten GAPDH↓, Tubulin↓, DNMT↓, GATA6↓,
IFITM3↓ SMITH et al. 2007
Geburtsgewicht (indirekt) SLC2A3↑ LAZZARI et al.
2002
Kryokonservierung Survivin↑, FAS↑, Kaspase-3↑, HSP↑ PARK et al. 2006
Trächtigkeitsrate nach Transfer COX2↑, CDX2↑, ALOX15↑, BMP15↑ , PLAU↑, PLAC8↑
EL-SAYED et al.
2006
Spenderzelleffizienz (lebende Nach- kommen)
HDAC1↓↑, HDAC2↑, DNMT3a↓, Oct4↓ BEYHAN et al.
2007
In vivo- vs. IVP- vs. sNT- Blastozysten
ACOX1↓, CD81↓, DNAJC10↑, HRH1↑,
TFAP2A↓ SMITH et al. 2005
In vivo- vs.
in vitro-kultivierte Blastozysten SCL2A3↓, SLC2A4↓, SLC2A8↓ KNIJN et al. 2005
SOF supplementiert mit Hyaluronan BAX↓, SOX↓, IGF2↑, Ecad↓ PALASZ et al.
2008
Verwendung gesexten Spermas
in der IVF SLC2A3↓, G6PD↓ , Xist MORTON et al.
2007
Sauerstoffbedingungen während
der Post-Kompaktierungskultur Myotrophin↓, APC1↓ HARVEY et al.
2007
In vivo- vs. IVP- vs. in vivo-kultivierte
Blastozysten FOXO3a↓, REA↓, HMG2↓, GNBL2↓,
EEF1G↓
CORCORAN et al.
2007
Kultur im isolierten Mäuseeileiter
SLC2A1↓↑, Na/K↓, Cx43↓↑, Oct4↑
,SOX↓↑, Sur↓↑ RIZOS et al. 2007
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Aufgrund der Notwendigkeit, präimplantative Entwicklungsstudien auch beim Rind durchführen zu können, wurden bei dieser Spezies bislang die verschiedensten ope- rativen Eingriffe beschrieben, um IVP-Rinderembryonen in den Eileiter der homolo- gen Spezies transferieren zu können. Die Operationen fanden teils sogar in Vollnar- kose statt. Es wurde durch einen ventralen Schnitt die Bauchhöhle eröffnet und ein Katheter in der Eileiterampulle verankert. Das andere Ende des Schlauches wurde via Uterus und Vagina nach außen gelegt und am Schwanz fixiert. Zygoten und Embryonen im 2-Zell-Stadium wurden über den Katheter in das Ovidukt übertragen.
Nach fünftägiger Kultur erfolgte die Rückgewinnung der Stadien durch eine nichtchi- rurgische Spülung bzw. nach Schlachtung der Tiere mit anschließender Spülung der entnommenen Reproduktionsorgane. Die Wiederfindung- und Entwicklungsraten bei dieser Methode waren allerdings sehr gering. Lediglich ein Embryo hatte sich bis zum Morulastadium weiterentwickelt. Jedoch glich diese Morula in Färbung, Größe und Kompaktierung den In-vivo-Morulae (SCHMIDT et al. 1997).
FAYRER-HOSKEN et al. transferierten im Jahr 1989 in vitro gereifte und befruchtete Rinderembryonen laparoskopisch in die Eileiter von fünf Färsen. Die Tiere waren zyklussynchron zu den zu übertragenden Stadien. Der endoskopische Zugang zur Bauchhöhle erfolgte über die rechte Flanke der Rinder. Ein Teflonschlauch mit ange- schlossenem Tomcat-Katheter wurde in die Bauchhöhle vorgeschoben. Der Katheter war mit 2-5 Embyonen im Zweizellstadium beladen und wurde unter endoskopischer Kontrolle 2,5-5cm in die Eileiterampulle eingeführt, dort erfolgte das Absetzen der Embryonen. Eines der Empfängertiere brachte ein gesundes Kalb auf die Welt (FAYRER-HOSKEN et al. 1989).
Im Jahr 1993 wurde erstmalig beim Kaninchen ein Routineeingriff für den Transfer von Embryonen in den Eileiter unter laparoskopischen Bedingungen beschrieben (BESENFELDER u. BREM 1993). Aufgrund dieser Ergebnisse wurde dieser Zugang ebenfalls beim Rind dargestellt, um einen tubalen Anschluss der Embryonalentwick- lung sowohl für wissenschaftliche als auch praktische Ansätze zu schaffen (BESEN- FELDER u. BREM 1998). Bei dieser Methode wurde der Zugang zu den inneren Ge- schlechtsorganen mittels transvaginaler Endoskopie geschaffen. Ein Universalschaft
mit eingelegtem, stumpfen Obturator wurde vaginal eingeführt, bis vor die Cervix ge- schoben und dorsal in der Fornix vaginae fixiert. Im Anschluss erfolgte die Durchsto- ßung des Vaginaldachs mittels eines perforierenden Trokars. Ein Arbeitsschaft mit eingelegtem Endoskop wurde anschließend in den Universalschaft eingeführt. Im Arbeitskanal befindet sich ein Schlauch mit angeschlossener Embryotransferkapillare aus Glas. Diese hirtenstabartig gebogene, mit IVP-Embryonen befüllte Kapillare wur- de dann unter endoskopischer Kontrolle in den Eileitertrichter eingefädelt und bis in die Ampulle vorgeschoben. In der Eileiterampulle sind die Embryonen abgesetzt worden (BESENFELDER u. BREM 1998; HAVLICEK et al. 2005a/b; BESENFELDER et al. 2009). Die Rückgewinnung der Embryonen erfolgte entweder durch eine unblu- tige Uterusspülung (wie in Kapitel 2.2.2 beschrieben) oder durch eine kombinierte, endoskopische Eileiter-/Uterusspülung. Die Wiederfindungsrate wird durch die Rückgewinnungsmethode stark beeinflusst. Eine endoskopische, kombinierte Spü- lung von Uterus und Eileiter führte zu einer Steigerung der Wiederfindungsrate um das doppelte (HAVLICEK et al. 2005a/b; BESENFELDER et al. 2010).
Es wurden in diesen Studien sowohl verschiedene Embryonalstadien (auch Game- ten) übertragen als auch verschiedene Einbettungsmedien verwendet, um die Wiederfindungs- und Entwicklungsraten zu steigern (WETSCHER et al. 2005a/b).
Die Einbettungsmedien (Alginat, Hyaluronsäure) sollten einen zu schnellen Abtrans- port bzw. Rückfluss der in den Eileiter übertragenen Stadien verhindern.
Wie erfolgreich gezeigt werden konnte, ermöglicht dieser minimal-invasive, endosko- pische Zugang durch das Scheidendach zum Rinderovidukt den frühzeitigen Trans- fer von Embryonen in den Eileiter, um sowohl Trächtigkeiten zu erzeugen als auch den Rindereileiter zur In-vivo-Kultur von Embryonen zu nutzen. Mit dieser Methode konnte ebenfalls erstmals gezeigt werden, dass durch Spülung der bovinen Eileiter nach Superovulation und künstlicher Besamung (KB) frühe Embryonalstadien (Zygo- ten bis 16 Zeller) beim Rind mit anderen Methoden als durch Schlachtung oder chi- rurgische Maßnahmen gewonnen werden können (BESENFELDER et al. 2001;
HAVLICEK et al. 2009; BESENFELDER et al. 2010).
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Studien von RIZOS et al. befassten sich mit einer Organkultur boviner, in vitro er- zeugter Zygoten im isolierten Eileiter von Mäusen (isolated mouse oviduct, IMO). Bei diesen Untersuchungen sollte besonders die Entwicklungsfähigkeit der Embryonen im IMO und die Qualität der daraus entstandenen Blastozysten untersucht werden.
Wie bereits oben beschrieben, kann das Entwicklungspotential des Eileiters (sowohl im Trans-Spezies-Transfer als auch beim Transfer bei der homologen Spezies) dazu beitragen, qualitativ hochwertige Blastozysten zu erzeugen. Trotzdem gibt es einige Nachteile, lebende Tiere als Zwischenempfänger zu nutzen. Zu erwähnen wären die Tieranschaffungs- und Tierhaltungskosten, Tierschutzaspekte und der hohe techni- sche und personelle Aufwand für die Transfers.
In vitro produzierte, bovine Zygoten wurden in die Ampullen von vorher frisch ent- nommenen Mäuseeileitern transferiert und diese dann in zwei verschiedenen Medien (SOF, KSOM) kultiviert. Gleichzeitig fand eine IVC einer Kontrollgruppe in den bei- den Medien statt. Die Kultur der Zygoten im IMO brachte im Vergleich zur Kontroll- gruppe keine höheren Entwicklungsraten hervor. Qualitativ unterschieden sich die gewonnenen Blastozysten jedoch. Es konnte mittels RT-qPCR aufgezeigt werden, dass Genexpressionsmuster qualitätsassozierter Transkripte aus Embryonen dieser Organkultur denen ähneln die rein in vivo generiert bzw. im Schafeileiter zwischen- kultiviert wurden. Die Blastozysten aus der In-vitro-Kultur-Vergleichsgruppe wiesen hingegen ein verändertes Expressionsmuster auf (RIZOS et al. 2007).
Da in verschiedenen Tiermodellen eine bessere Embyronenqualität nach In-vivo- Kultur im Eileiter nachgewiesen werden konnte, vergleichbare Studien für den hu- manmedizinischen Bereich allerdings nicht existieren, entwickelten Wissenschaftler 2009 erstmals ein In-vivo-Kultursystem für den Menschen. Für dieses In-Uteri- Culture-System (IUCS) wurde eine perforierte Siliconröhre mit Zygoten/Embryonen, erstellt durch ICSI (intracytoplasmic sperm injection), beladen und via Scheide in den Uterus von Frauen eingeführt, für einige Tage kultiviert. Die daraus gewonnenen Embryonen wurden dann mit Embryonen aus einer In-vitro-Produktion verglichen.
Die Mikroperforation der Siliconröhre erlaubt eine Kommunikation zwischen Embryo- nen und Endometrium bzw. zwischen Embryonen und den Uterussekreten. Es konn-
ten Embryonen guter Qualität gewonnen werden. Ein signifikanter Unterschied stellte sich in der Anzahl der euploiden Embryonen dar, die Anzahl war im Vergleich zur In- vitro-Kontrollgruppe bei der IUCS-Gruppe erhöht. Diese Ergebnisse werfen erneut die Frage auf, in wie weit die In-vitro-Kulturbedingungen einen negativen Einfluss auf epigenetische Modifikationen und Genexpression haben (BLOCKEEL et al. 2009).
2.3 Unterschiede in der Qualität und in der Genexpression bei Rinderembryo- nen aus verschiedenen Herkünften
Die Entwicklung boviner IVP-Embryonen wird stark durch die Bedingungen während der Oozytenreifung, Fertilisation und Embryonenkultur beeinflusst. Es konnte gezeigt werden, dass die Oozytenqualität den Hauptfaktor für die Entwicklung der ungereiften Eizelle zur Blastozyste darstellt (RIZOS et al. 2002b). Dagegen wird die Qualität der resultierenden Embryonen, gemessen an der Kryotoleranz und der rela- tiven Menge spezifischer Gentranskripte, hauptsächlich durch die Kulturbedingungen nach der Fertilisation bestimmt (RIZOS et al. 2002b, 2003, Tabelle 1). Obwohl die Medien zur In-vitro-Kultur immer weiter verbessert wurden, zeigen in vitro produzierte Embryonen nach wie vor Abweichungen im Vergleich zu in vivo gewonnenen Emb- ryonen. Das zeigt sich sowohl auf morphologischer und biochemischer, aber auch auf molekularer Ebene. IVP-Embryonen zeigen eine erhöhte Sensitivität gegenüber der Kryokonservierung (POLLARD u. LEIBO 1994) und besitzen ein dunkleres und erhöhtes Zytoplasmavolumen, sowie einen erhöhten Lipidgehalt (CROSIER et al.
2000). Zudem können bei einem Vergleich mit präimplantatorischen In-vivo- Embryonen Unterschiede im Energiemetabolismus nachgewiesen werden (KHURANA u. NIEMANN 2000b). Ebenso wird über ein erhöhtes Auftreten von chromosomalen Aberrationen berichtet (VIUFF et al. 1999). Darüber hinaus gibt es Abweichungen im mRNA-Expressionsmuster entwicklungsrelevanter Gene (NIE- MANN u. WRENZYCKI 2000; RIZOS et al. 2002a, 2003; WRENZYCKI et al. 2005b).
Wie bereits vorher erwähnt, beschrieben LONERGAN et al. 2001 den positiven Ein- fluss der In-vivo-Kultur im ligierten Schafeileiter auf die Blastozystenqualität von Embryonen aus In-vitro-Reifung und In-vitro-Fertilisation. Sie konnten zeigen, dass
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die Embryonen aus dem Schafeileiter eine signifikant höhere Kryotoleranz, gemes- sen an der Überlebens- und Schlupfrate nach dem Auftauen, als die Embryonen aus der In-vitro-Kultur besaßen (LONERGAN et al. 2001).
Unterschiede zeigten sich aber auch bei den aus IVP-Embryonen resultierenden Kälbern im Vergleich zu Kälbern aus in vivo gewonnenen Embryonen. Diese Auffäl- ligkeiten werden unter dem Begriff „Phänomen der übergroßen Kälber“ („large offspring syndrome“, LOS) zusammengefasst (WALKER et al. 1996; YOUNG et al.
1998; FARIN et al. 2006). Neben der charakteristischen Übergröße und den vergrö- ßerten Organen treten Abweichungen in Form von erhöhten pränatalen Verlusten, Schwergeburten, verlängerten Trächtigkeiten, Atemproblemen, Saugschwierigkeiten, Eihautwassersucht sowie plötzlichem perinatalen Tod auf. Die Kälber weisen außer- dem häufiger einen veränderten Energiestoffwechsel auf (LAZZARI et al. 2002;
WRENZYCKI et al. 2004, 2005a).
All die oben aufgeführten Qualitätskriterien lassen allerdings keine wirklich objektive Beurteilung der Embryonenqualität zu. Somit könnte mit Hilfe des Expressionsmus- ters entwicklungsrelevanter Gene die Qualität von Embryonen aus IVP objektiver und besser evaluiert werden. Unterschiede in den mRNA-Expressionsmustern diverser Gene zwischen IVP und in vivo erzeugten Embryonen sind in zahlreichen Studien bereits aufgeführt worden, wobei das Expressionsmuster der in vivo erzeugten Emb- ryonen als physiologischer Standard gilt (NIEMANN et al. 2002; LONERGAN et al.
2003a/b; GUTIERREZ-ADAN et al. 2004; WRENZYCKI et al. 2005a; CORCORAN et al. 2006; TVEDEN-NYBORG et al. 2007). Änderungen in diesem physiologischen Genexpressionsmuster können als ein Versuch des Embryos angesehen werden, suboptimale Kulturbedingungen zu kompensieren (LAZZARI et al. 2002).
Untersuchungen auf der Transkriptionsebene präimplantatorischer Säugetieremb- ryonen können ebenfalls wertvolle Hinweise auf den physiologischen Status und da- mit die Überlebensfähigkeit und Entwicklungskompetenz der untersuchten Embryo- nen liefern. Weiterhin ist es auf diese Weise möglich, einen wissenschaftlichen Ein- blick in die Regulation der Expression zahlreicher Gene während der frühen Embry- onalentwicklung zu erhalten. Zu diesem Zwecke wurden Gendatenbanken erschaf-
fen. Die Genexpressionen von 60 Genen in bovinen IVP-Blastozysten, Blastozysten aus sNT (somatic nuclear transfer) und in vivo gewonnenen Blastozysten wurde un- tersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sich sowohl Blastozysten aus der IVP wie auch Blastozysten aus sNT im Expressionsmuster verschiedenen Genen zu denen reiner in vivo Blastozysten unterschieden (LONG et al. 2007, MC HUGHES et al.
2009). KUES et al. analysierten 2008 erstmals beim Rind das gesamteTranskriptom in der frühen Entwicklungsphase von der Oozyte bis zur Blastozyste mit Hilfe des Affymetrix GeneChip Bovine Genomic Array. Dieser Chip analysiert etwa 23.000 Transkripte. Diese Studie zeigt erstmals eine zusammenfassende Analyse des Gen- expressionsprofils und der transkriptionellen Dynamik in der In-vivo- Präimplantationsphase und kann damit als eine Basis zur Verbesserung assistierter Reproduktionstechniken dienen (KUES et al. 2008).
Während der präimplantatorischen Embryonalentwicklung geschehen eine Reihe von Änderungen in der Genexpression, zum Beispiel im Verlauf der ersten Teilungen, der Aktivierung des embryonalen Genoms, der Kompaktierung zur Morula und Blastozystenbildung mit Ausbildung der inneren Zellmasse (ICM) und des Trophektoderms (TE; KIDDER 1992). Sowohl mütterliche mRNA und Proteine, wel- che während der Oogenese synthetisiert und akkumuliert wurden und zur frühen Entwicklung beitragen (TELFORD et al. 1990), als auch väterliche mRNA, welche während der Befruchtung in die Eizelle gelangen, spielen dabei eine wichtige Rolle (OSTERMEIER et al. 2004). Der präimplantatorische Rinderembryo ist zunächst un- ter der Kontrolle maternaler genomischer Informationen. Anschließend ist die Ent- wicklung von neuen Genprodukten abhängig, die vom embryonalen Genom nach dessen Aktivierung produziert werden (WRENZYCKI et al. 2007, Abb. 3). In der Pha- se des Übergangs von der maternalen auf die embryonale Expression (MET, siehe Abb. 3) ist der Embryo besonders anfällig gegenüber externen Faktoren (DEAN et al.
2001). Die Hauptaktivierung (major activation) des bovinen embryonalen Genoms erfolgt im 8- bis 16-Zell-Stadium (TELFORD et al. 1990), wohingegen die minor activation („kleine“ Aktivierung) schon in der Zygote beobachtet werden kann (MEMILI u. FIRST 2000). Die meisten Gene werden zeit- und stadienabhängig, dem
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allgemeinen maternalen und/oder embryonalen Expressionsmuster folgend, transkri- biert (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000).
Abbildung 3: Transkriptionsverläufe während der frühen Embryonalentwicklung beim Rind (Wrenzycki et al. 2007)
Die In-vitro-Umgebung hat einen großen Einfluss auf die mRNA-Expressionsmuster in präimplantatorischen Rinderembryonen. Inadäquate Kulturbedingungen beeinflus- sen nachteilig die Embryonenqualität (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000; LAZZARI et al. 2002; LONERGAN et al. 2003; WRENZYCKI et al. 2005; CORCORAN et al.
2007; TVEDEN-NYBORG et al. 2008) und sind korreliert mit signifikanter Hoch- oder Herunterregulierung, De-novo-Induktion oder Stilllegung von Genen, die für die un- gestörte Embryonal-, Fetal- und Neonatalentwicklung verantwortlich sein können (siehe Tabelle 2). Auffällige Abweichungen können zu abnormalen Entwicklungen, die wie bereits weiter oben beschrieben, unter dem Begriff des LOS zusammenge- fasst werden und zum embryonalen oder fetalen Tod führen (WRENZYCKI et al.
2005a, FARIN et al. 2006).
2.4 Epigenetische Genregulation in frühen Embryonalstadien
Entwicklungsprozesse in Organismen gehen immer mit einer zeitlichen und räumli- chen Genexpression einher. Die Genetik fasst alle Funktionen der DNA zusammen, die eine direkte Folge ihrer Struktur bzw. Sequenz sind. Unter anderem gehören da- zu die Organisation der DNA zu Genen oder Veränderungen der DNA aufgrund von Modifikationen wie z.B. Mutationen, also Veränderungen in der Basenabfolge. Die Epigenetik umfasst hingegen die vererbbaren, reversiblen chromosomalen Modifika- tionen, die den regulatorischen Zustand der Gene und die Genexpression aufrecht- halten oder unterdrücken, wobei die Nukleotidabfolge der Gene unverändert bleibt (LI 1993; SHI et al. 2003). Die epigenetischen Modifikationen bleiben über die Zelltei- lung hinweg erhalten und werden an die nächste Generation weitergegeben.
Genexpressionsmuster werden von genetischen und epigenetischen Mechanismen beeinflusst. Für die korrekte Entwicklung eines Organismus ist die epigenetische Kontrolle der Genexpression von ausschlaggebender Bedeutung, da viele Gene nur zu bestimmten Zeitpunkten der Entwicklung in einem spezifischen Zelltyp aktiviert sein dürfen. Bei der präimplantatorischen Entwicklung von Embryonen sind epigene- tische Mechanismen wie DNA-Methylierung/Demethylierung und Histon- Modifikationen in die Regulation geprägter (imprinted) und nicht geprägter (non- imprinted) Gene, in die X-Chromosom-Inaktivierung und in die Aufrechterhaltung der Telomerlänge involviert (WRENZYCKI et al. 2005a).
2.4.1 DNA-Methylierung
Die DNA-Methylierung beschreibt den Transfer einer Methylgruppe (CH₃-Gruppe) auf die Nukleinbasen Cytosin der DNA durch spezielle Enzyme. Die DNA-Methylierung ist die am besten untersuchte DNA-Modifikation. Sie wird vererbt und kommt sowohl bei Prokaryoten als auch bei Eukaryoten vor (JOHNSON et al. 2002). Die DNA- Methylierung ist meist mit einer Transkriptionshemmung assoziiert und spielt bei vie- len regulatorischen Prozessen wie der X-Chromosom-Inaktivierung, beim genomischen Imprinting, der Regulation der Entwicklung, der Mutagenese, der DNA- Reparatur und der Chromatin-Organisation eine große Rolle (KLIMASAUSKAS et al.
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1994; JAENISCH u. BIRD 2003). In Säugetierzellen findet die DNA-Methylierung ausschließlich an Position 5` des Cytosins eines CpG-Dinukleotids statt, wobei etwa 70% aller CpGs methyliert sind.
DNA-Methylierungen sind bei Wirbeltieren hauptsächlich in CpG-Inseln anzutreffen (OKANO et al. 1998). Diese Inseln sind Regionen der DNA, die reich an den aufei- nander folgenden Basen Cytosin und Guanin sind. In den CpG-Islands liegt das Dinukleotid Cytosin-Guanin (5 -CpG-3 ) im Vergleich zum restlichen Genom mit 10- bis 20-mal erhöhter Frequenz vor. Im Allgemeinen ist die Sequenzfolge Cytosin – Phosphat – Guanin im Genom im Vergleich zur statistischen Wahrscheinlichkeit ihres Auftretens unterrepräsentiert. Die DNA-Methylierung wird durch DNA- Methyltransferasen (DNMTs) durchgeführt (Abb. 4). Diese Enzyme (siehe Kapitel 2.4.1.1) katalysieren den Transfer einer Methylgruppe vom S-Adenosyl-L-Methionin an das Kohlenstoffatom C-5 der Base Cytosin (ROBERTSON et al. 1999).
Abbildung 4: DNA-Methyltransferasen katalysieren den Transfer einer Methylgruppe auf das C-Atom im Cytosinring (HAAF 2006)
Epigenetische Fehler, welche die Chromatinstruktur oder die DNA-Methylierung ver- ändern, können beim Menschen zu Erbkrankheiten und Tumorerkrankungen führen (TILGHMAN 1999; FALLS et al. 1999). Das Auftreten einer abweichenden Expressi- on von „imprinted“ Genen steht im Zusammenhang mit dem Beckwith-Wiedemann- Syndrom (BWS), Angelman Syndrom (AS), Retinoblastomen (RB), Rett-Syndrom, ATR-X-Syndrom (Alpha Thalassemia/Mental Retardation-Syndrome, X-linked), ICF- Syndrom (Immunodeficiency, Centromere instability and Facial abnomalies) und ver- schiedenen Krebsformen (DEAN et al. 2005). Ein erhöhtes Risiko für Imprintingstörungen und Imprintingkrankheiten, wie die zum Teil oben aufgeführten
Syndrome wurde bei Kindern nach In-vitro-Fertilisierung (IVF) und intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) beobachtet (COX et al. 2002;
DEBAUN et al. 2003; LAWRENCE et al. 2010). Außerdem werden Gene, die dem Imprinting unterliegen, als mögliche ursächliche Kandidaten für die Entstehung des LOS bei Tieren angesehen (WRENZYCKI et al. 2006).
Geschlechtsspezifische Methylierungen (siehe Abb. 5) im Genom von Oozyte und Spermium werden nach der Befruchtung durch Demethylierung entfernt. Geprägte Gene sind von dieser Demethylierung ausgenommen und bleiben methyliert. Das paternale Genom wird (siehe Abb. 5) innerhalb weniger Stunden nach der Befruch- tung aktiv demethyliert (Maus, Schwein, Rind, Mensch), Ausnahmen davon zeigen nur das Kaninchen und das Schaf (SHI et al. 2004, YOUNG u. BEAUJEAN 2004) Beim maternalen Genom findet eine passive Demethylierung während der ersten Teilungen statt (MAYER et al. 2000; DEAN et al. 2001; HAAF 2006; LEPIKHOV et al.
2008). Die Demethylierung erfolgt aktiv, d.h. in Abwesenheit von DNA-Replikation und unterliegt speziesspezifischen Variationen.
Bislang war zwar bekannt, dass 5„-Methylcytosine in der väterlichen und mütterlichen DNA der Zygote demethyliert werden, doch die molekularen Mechanismen, die den Vorgang vermitteln, waren bis dato unerforscht. Eine Forschergruppe hat nun erst- mals nachgewiesen, dass die Abnahme von 5„-Methylcytosin (5-mC) in väterlichen Vorkernen von Maus-, Kaninchen- und Rinder-Zygoten mit der Zunahme an 5- Hydroxymethylcytosin (5-hmC) korreliert und die Oxidase Tet3 durch Knock-out- Experimente als Katalysator der Modifikation identifiziert. Zugleich entdeckten die Forscher durch Ausschalten des entsprechenden Gens, dass ein Schutzprotein die Konversion von 5-mc in 5-hmc in weiblichen Vorkernen verhindert. Die neuen Er- kenntnisse unterstreichen, dass 5-hmc und Tet3 eine wichtige Rolle bei der Reprogrammierung in frühen Embryonen spielen (WOSSIDLO et al. 2011; IQBAL et al. 2010).
Später findet eine De-novo-Methylierung der DNA statt. Dieser Vorgang beginnt beim Rind zwischen dem 8- bis 16-Zellstadium (BOURC´HIS et al. 2001a; DEAN et al.
2001; SHI et al. 2003) und bei der Maus sowie beim Menschen ab der Morula (DEAN
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et al. 2001). Dabei kommt es bei der Maus zu einer deutlich asymmetrischen Methylierung, wobei die DNA der Blastomeren der inneren Zellmasse (ICM) hypermethyliert wird, wohingegen die DNA der Zellen des Trophektoderms (TE) eine Hypomethylierung aufweist (DEAN et al. 2001; SANTOS et al. 2002). Diese Asym- metrie ist beim Rind schwächer ausgeprägt (Abb. 5) und beim Menschen liegt eine stärkere Methylierung der DNA der Zellen des Trophektoderms gegenüber der DNA der Blastomeren der inneren Zellmasse vor (FULKA et al. 2004). Auch beim Schaf kann eine asymmetrische Verteilung der Methylierung in voll expandierten Blastozysten beobachtet werden. Im Gegensatz zur Maus beruht diese Asymmetrie jedoch nicht auf einer verstärkten Remethylierung in den Kernen der ICM, sondern auf einer selektiven Demethylierung der DNA im TE (YOUNG u. BEAUJEAN 2004).
Die korrekte Reprogrammierung der Methylierung der beiden elterlichen Genome in der frühen Embryonalentwicklung hat große Bedeutung für die ungestörte weitere Entwicklung (LEPIKHOV et al. 2008). Veränderungen im Methylierungsmuster der DNA wurden beim Rind sowie bei der Maus nach Kerntransfer nachgewiesen (HUMPHERYS et al. 2001; ENRIGHT et al. 2005). Bei Kerntransferembryonen kommt es zu einer inkompletten, sowie auch variablen Demethylierung des diploiden Spendergenoms (DEAN et al. 2001; LIU et al. 2008).
