Etablierung der transvaginalen Endoskopie zur Gewinnung tubaler Embryonalstadien beim Rind und Vergleich der Expressionsmuster epigenetisch-relevanter Gentranskripte in in vivo und in vitro produzierten präimplantatorischen Rinderembryonen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Katharina Isabell Höffmann aus Bad Zwischenahn
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. med. vet. C. Wrenzycki
1. Gutachter: PD Dr. med. vet. C. Wrenzycki
2. Gutachter: Prof. Dr. S. Meinecke-Tillmann
Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2005
Meinen Eltern
1 Einleitung ...1
2 Schrifttum ...4
2.1 Physiologische Grundlagen ...4
2.1.1 Frühe Embryonalentwicklung des Rindes ...4
2.1.2 Eileiter und Uterus des Rindes ...5
2.2 Generierung früher Embryonalstadien beim Rind...7
2.2.1 Gewinnung tubaler Embryonalstadien...7
2.2.2 Gewinnung uteriner Embryonalstadien...10
2.2.3 In vitro Produktion von Rinderembryonen ...11
2.3 Genexpression in präimplantatorischen Rinderembryonen ...13
2.3.1 Genexpression in Rinderembryonen unterschiedlicher Herkunft...14
2.4 Epigenetische Prozesse während der frühen Embryonalentwicklung ...21
2.4.1 DNA-Methylierung ...21
2.4.1.1 DNA-Methyltransferasen (DNMTs)...24
2.4.1.1.1 DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1)...26
2.4.1.1.2 DNA-Methyltransferasen 3a/3b (DNMT3a/DNMT3b) ...29
2.4.1.1.2.1 DNA-Methyltransferase 3a (DNMT3a)...30
2.4.1.1.2.2 DNA-Methyltransferase 3b (DNMT3b)...31
2.4.2 Histon-Methylierung...32
2.4.2.1 Histon-Methyltransferasen (HMTasen)...34
2.4.2.1.1 SUV39H1 ...35
2.4.2.1.2 G9A ...36
3 Material und Methoden ...38
3.1 Gewinnung früher Embryonalstadien (Tag 1-4 der Entwicklung) aus dem Eileiter beim Rind ...38
3.1.1 Tiermaterial und vorherige bzw. weitere Verwendung der Tiere ...38
3.1.2 Vorbereitung der Tiere...38
3.1.3 Superovulationsbehandlung ...39
3.1.4 Medien zur Embryonengewinnung ...39
3.1.5 Instrumente zur transvaginalen Endoskopie mit Eileiterspülung ...40
3.1.6 Instrumente zur Uterusspülung ...42
3.1.7 Transvaginaler Zugang zu den inneren Geschlechtsorganen ...43
3.1.7.1 Endoskopischer Zugang zur Bauchhöhle ...43
3.1.7.2 Insertion in die Eileiter ...45
3.1.8 Spülung früher tubaler Embryonalstadien (Tag 1-4 der Entwicklung) ...48
3.2 Gewinnung früher Embryonalstadien (Tag 4,5-8 der Entwicklung) aus dem Uterus beim Rind ...49
3.3 In vitro Produktion von Rinderembryonen (IVP)...50
3.3.1 Gewinnung und in vitro Maturation (IVM) von Kumulus-Oozyten- Komplexen (KOKs)...50
3.3.2 In vitro Fertilisation boviner Embryonen (IVF) ...50
3.3.3 In vitro Kultur boviner Embryonen (IVC) ...51
3.4 Morphologische Beurteilung der Embryonen...51
3.5 Semi-quantitative Endpunkt-RT-PCR zur Darstellung spezifischer Gentranskripte in bovinen präimplantatorischen Embryonen...54
3.5.1 Isolierung der mRNA ...54
3.5.2 Reverse Transkription (RT) ...55
3.5.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR)...56
3.5.4 Analyse und Quantifizierung der RT-PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese...59
3.6 Statistische Analyse...59
3.7 Allgemeiner Versuchsaufbau ...60
3.7.1 Versuchsanordnung ...60
3.7.1.1 Etablierung der transvaginalen Endoskopie beim Rind und Produktion der in vitro Embryonen ...60
3.7.1.2 Darstellung der verschiedenen DNA- und Histonmethyltransferasen in in vivo und in vitro gewonnenen Rinderembryonen...60
4 Ergebnisse ...62
4.1 Gewinnung der Embryonen aus dem Eileiter ...62
4.2 Gewinnung der Embryonen aus dem Uterus...64
4.3 Erstellung der in vitro Embryonen...64
4.4 Darstellung der mRNA-Expression der verschiedenen DNA- und Histonmethyltransferasen in in vivo und in vitro gewonnenen präimplantatorischen Rinderembryonen und deren zeitlicher Verlauf ...64
4.4.1 DNMT1 ...65
4.4.2 DNMT3a ...67
4.4.3 DNMT3b ...69
4.4.4 SUV39H1 ...71
4.4.5 G9A ...73
5 Diskussion ...76
5.1 Transvaginale Endoskopie ...77
5.2 Genexpressionsmuster...79
5.3 Schlussfolgerungen ...88
6 Zusammenfassung...91
7 Summary ...95
8 Literaturverzeichnis ...99
10. Anhang: Medienrezepte und Einzeldaten...120
11. Abkürzungsverzeichnis ...126
11 Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen ...129
1 Einleitung
Vergleichende Studien zur mRNA-Expression zwischen in vivo und in vitro produzierten präimplantatorischen Rinderembryonen sind hauptsächlich bei späteren Entwicklungsstadien wie Morulae und Blastozysten, die entweder unblutig per Uterusspülung oder nach in vitro Produktion (IVP) erzeugt werden können, durchgeführt worden. Die Einbeziehung früher tubaler Embryonalstadien scheiterte an der fehlenden Möglichkeit, in vivo Embryonen routinemäßig aus dem Eileiter zu gewinnen.
Die frühen tubalen Embryonalstadien wurden vor allem aus den exenterierten Eileitern geschlachteter Kühe gespült (HAFEZ u. SUGIE 1963). Des Weiteren besteht die Möglichkeit der operativen Gewinnung der Embryonen durch einen ventralen oder lateralen Zugang zur Bauchhöhle mit anschließender Spülung der Eileiter (ROWSON et al. 1969; WOLFE et al. 1990; LAURINCIK et al. 1993; VAN SOOM et al. 1997). Diese Verfahren sind zeitaufwendig, kostenintensiv und stellen eine starke Belastung für die Tiere dar. Überdies sind sie nicht bzw. nur eingeschränkt wiederholbar. Eine neuentwickelte, minimal-invasive Methode stellt der endoskopische Zugang zum Eileiter über das Scheidendach dar, die eine wiederholte Gewinnung tubaler Embryonalstadien ohne nachteilige Effekte für das Spendertier erlaubt (HAVLICEK et al. 1999).
Genexpressionsmuster werden von genetischen und epigenetischen Mechanismen beeinflusst. Epigenetische Modifikationen stellen vererbbare, reversible Änderungen der Genexpression dar, welche nicht auf Veränderungen der DNA-Sequenz zurückzuführen sind (SHI et al. 2003). Sie beeinflussen die lokale Struktur, die Komposition und das „Remodelling“ des Chromatins (WOLFFE u. MATZKE 1999) und sind für eine ungestörte embryonale Entwicklung von herausragender Bedeutung (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003).
Während der präimplantatorischen Embryonalentwicklung sind epigenetische Modifikationen wie die DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen in die Regulation geprägter (imprinted) und nicht geprägter (non-imprinted) Gene, die
X-Chromosom-Inaktivierung und die Aufrechterhaltung der Telomerlänge involviert (WRENZYCKI et al. 2005a).
Die Entwicklung präimplantatorischer Embryonen ist ein komplexer Vorgang, der auf der korrekten Umsetzung des genetischen Programms der Zygote in einem geeigneten Umfeld beruht. Während dieser frühen Phase der Embryonalentwicklung durchläuft der Embryo (1) die ersten Furchungen und Teilungen, (2) die (Haupt-) Aktivierung des embryonalen Genoms im 8- bis 16-Zell-Stadium, (3) die Kompaktierung der Morula und (4) die Ausbildung der Blastozyste, begleitet von der ersten Differenzierung der embryonalen Zellen in den Embryonalknoten (innere Zellmasse, inner cell mass, ICM) und das Trophektoderm (TE). Diese Ereignisse werden von inadäquaten Kulturbedingungen nachteilig beeinflusst und haben somit auch einen Einfluss auf die Blastozystenqualität (LAZZARI et al. 2002; LONERGAN et al. 2003c; WRENZYCKI et al. 2005). Bis heute können die in vitro Konditionen die dynamischen Veränderungen des Eileiters und des Uterus, die auf den variierenden Metabolismus des sich entwickelnden Embryos reagieren, nicht nachahmen. Nur die physiologische Umgebung des präimplantatorischen Embryos bietet optimale Konditionen für die Entwicklung zur Blastozyste bester Qualität (BAVISTER 1995).
Die Expressionsmuster entwicklungsrelevanter Gentranskripte der in vivo gewonnenen Stadien dienen als sog. „Goldener Standard“ im Vergleich mit denen in vitro produzierter und geklonter Embryonen. Damit kann geklärt werden, ob Aberrationen vom regulären Expressionsmuster auch bereits im frühen Embryo auftreten und kausal an der Entstehung des Large Offspring Syndromes (LOS) beteiligt sind.
Es ist gezeigt worden, dass die Expression entwicklungsrelevanter Gene in präimplantatorischen Rinderembryonen im Morula- und Blastozystenstadium aus in vitro Produktion sowie nach somatischem Kerntransfer im Vergleich zu der in vivo generierter Stadien nach Uterusspülung häufig verändert ist (WRENZYCKI et al.
2005b). Auch nach in vivo Kultur boviner Zygoten aus IVM/IVF im ligierten Schafeileiter wiesen die resultierenden Blastozysten ein verändertes mRNA- Expressionsmuster im Vergleich zu vollständig in vivo erzeugten Blastozysten auf.
Die Unterschiede waren jedoch weitaus geringer als zwischen IVP- und in vivo
Embryonen (LAZZARI et al. 2002). Unterschiede im mRNA-Expressionsmuster zwischen frühen in vivo und in vitro produzierten Embryonen wurden erstmals von TESFAYE et al. (2004) berichtet. Ein Einfluss auf die Transkription entwicklungsrelevanter Gene während der gesamten in vitro Kultur konnte auch für verschiedenste in vitro Manipulationstechniken nachgewiesen werden (WRENZYCKI et al. 2005b).
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die transvaginale Endoskopie mit Eileiterspülung zur Gewinnung präimplantatorischer tubaler Embryonalstadien beim Rind etabliert. Im sich anschließenden zweiten Teil dieser Arbeit erfolgte die mRNA- Analyse für drei DNA-Methyltransferasen (DNMT1, 3a und 3b) und zwei Histon- Methyltransferasen (SUV39H1 und G9A) mittels semi-quantitativer RT-PCR. Ihre mRNA-Expression wurde während der frühen Embryonalentwicklung von der Zygote bis zur Blastozyste bei Embryonen aus der in vivo und in vitro Produktion untersucht.
2 Schrifttum
2.1 Physiologische Grundlagen
2.1.1 Frühe Embryonalentwicklung des Rindes
Nach der Befruchtung der Eizelle in der Eileiterampulle (SCHNORR 1996) bildet sich 24 Stunden später die Zygote (GELDERMANN 2005b). Die anschließenden ersten drei Furchungen finden im Eileiter statt (RÜSSE 1994), so dass nach 2 bis 2½ Tagen 2-Zeller, nach 2½ Tagen 4-Zeller sowie nach 4 Tagen 8-Zell-Stadien zu finden sind.
Im 8-Zell-Stadium gelangt der Embryo über den Eileiteristhmus in die Uterushornspitze (Abb. 1). Von dort wird er dann zum Ort der Implantation, etwa in die Mitte des mit dem gegenseitigen Horn verbundenen Abschnittes der Gebärmutter, transportiert. Nach 5 bis 6 Tagen erreicht der Embryo im Uterus das Morulastadium und entwickelt sich am 7.-8. Tag zur Blastozyste, welche in Embryoblast (innere Zellmasse, ICM) und Trophoblast differenziert ist (RÜSSE 1994). Aus der inneren Zellmasse entwickelt sich später der Rinderfetus, während das Amnion- und Chorionepithel (Teile der Fruchthülle) aus den Zellen des Trophektoderms hervorgehen. Laut SCHNORR (1996) erreicht erst die frühe Morula mit 16 Blastomeren die Gebärmutter. Die Teilung bzw. Furchung läuft nicht immer synchron ab, so dass vor allem vom 8-Zeller an auch Stadien mit ungeraden Zellzahlen vorkommen können.
Die Blastozyste schlüpft am 9.-10. Tag aus der Zona pellucida, wobei die kugelige Form zunächst beibehalten wird. Ab Tag 13 entsteht durch die Elongation ein länglicher Embryo, der als lang gestrecktes, fadenförmiges Gebilde die Uterushöhle ausfüllt. An Tag 18/19 beginnt die Implantation und die elongierte Blastozyste füllt an Tag 22 auch das nicht gravide Uterushorn ganz aus. Spätestens am 17. Tag erfolgt auch die Erkennung der Gravidität von Seiten des Muttertieres (RÜSSE 1994).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Ovulation, Befruchtung und Furchung beim Säuger (SCHNORR 1996)
2.1.2 Eileiter und Uterus des Rindes
Der Eileiter (Tuba uterina) des Rindes ist 200-280 mm lang und verläuft in Bögen zunächst im medialen Teil der Mesosalpinx, wechselt in kranialem Bogen in die laterale Wand der Bursa ovarica hinüber und findet in kaudalem Verlauf Anschluss an die Spitze des Uterushorns (SCHUMMER u. VOLLMERHAUS 1995). Er besteht in seinem Anfangsabschnitt aus dem Tubentrichter (Infundibulum tubae uterinae), mit dem der Eileiter die Oozyte aufnimmt. Es schließt sich der ampullenartig erweiterte Abschnitt, die Ampulla tubae uterinae an, welcher in den verengten Endabschnitt des
Eileiters (Isthmus tubae uterinae) übergeht (LIEBICH 2004). Die Tuba uterina ist Ort der Befruchtung und sorgt für den Spermientransport und die Kapazitation (SOBIRAJ 1999). An der inneren Wandauskleidung erfolgen zyklusabhängige Umbauvorgänge, um optimale Stoffwechselbedingungen für die frühembryonalen Entwicklungsstadien zu schaffen. Die Wand der Eileiter setzt sich von innen nach außen aus der Tunica mucosa, Tunica muscularis, Tela subserosa und Tunica serosa zusammen. Die Tunica mucosa besteht aus einem einschichtigen, meist hochprismatischen Epithel mit Flimmer- und Drüsenzellen. Letztere sezernieren schwach sauren Schleim und Nährstoffe (Proteine) zur Versorgung der Keimzellen. Gleichzeitig geben sie zur Enddifferenzierung und Endreifung der Gameten Elektrolyte, Enzyme, Albumine, Zucker und Aminosäuren in das Eileiterlumen ab. Die Flimmerzellen sind mit Kinozilien besetzt, welche den aktiven Flüssigkeitsstrom in Richtung Uteruslumen unterstützen. Die Tunica muscularis der einzelnen Eileiterabschnitte ist unterschiedlich stark entwickelt. Im Infundibulum und in der Ampulla sind die glatten Muskelschichten sehr dünn, lediglich im Bereich des Isthmus sind sie verstärkt und durch einen vorherrschend spiraligen Verlauf gekennzeichnet (LIEBICH 2004).
Abbildung 2: Uterus und Eileiter des Rindes, Seitenansicht (SCHUMMER u.
VOLLMERHAUS 1995)
Der Uterus des Rindes (Abb. 2) besteht aus den beiden 350-450 mm langen widderhornartig eingerollten Uterushörnern, welche kaudal in den 30 mm langen Uteruskörper münden (SCHUMMER u. VOLLMERHAUS 1995). Der Uterus fördert
den Transport der Spermien in Richtung Eileiter und ihre Kapazitation und dient der Entwicklung des Keimlings und der Austreibung der Frucht. Um diesen Aufgaben gerecht zu werden, unterliegt die Gebärmutter strukturellen Umbauvorgängen, die unter dem Begriff des uterinen Zyklus zusammengefasst werden und eine optimale Implantation und Plazentation des Keimes ermöglichen (LIEBICH 2004). Die Wand des Uterus besteht - von innen nach außen - aus dem Endometrium, dem Myometrium, der Tela subserosa, dem Perimetrium und der Tunica adventitia. Das Endometrium trägt ein unterschiedlich hohes, zur Sekretion befähigtes, einschichtiges und stellenweise mehrschichtiges Epithel. Auch hier finden sich Flimmerzellen mit Kinozilien und sezernierende Zellen mit Mikrovilli. Die Lamina propria enthält zahlreiche verästelte tubulöse Uterindrüsen, welche ein mukoides Sekret abgeben. Das Myometrium besteht aus glatten Muskelfaserbündeln, die zirkulär angeordnet sind und denen außen eine Gefäßschicht aufliegt. Von dieser Schicht ausgehend ziehen auch Gefäße ins Endometrium und versorgen so die Drüsen und das Epithel.
2.2 Generierung früher Embryonalstadien beim Rind
2.2.1 Gewinnung tubaler Embryonalstadien
Präimplantatorische Embryonalstadien vom Rind können unter Verwendung verschiedener Methoden gewonnen werden. So beschrieben HAFEZ u. SUGIE (1963) die Gewinnung früher Stadien zwischen Tag 3 und 5 mittels Schlachtung der Donortiere. Hier wurden superovulierte und besamte Färsen 3 bis 5 Tage nach rektal diagnostizierter Ovulation geschlachtet und der Uterus mit beiden Eileitern exenteriert und mit warmem autologen Blutserum und einer Kochsalzlösung gespült.
ROWSON et al. (1969) entwickelten den ventromedianen Zugang zum Eileiter beim Rind, ähnlich der 1955 für das Schaf beschriebenen Technik (HUNTER et al.).
Hierzu wurde das Tier unter Allgemeinanästhesie in Rückenlage verbracht und die Gebärmutter einschließlich der Eierstöcke vorverlagert. Dann wurde das Uterushorn mittels einer Klemme verschlossen und ein Glasröhrchen durch die Uteruswand
inseriert. Im Anschluss daran spülten sie zuerst den Eileiter in Richtung Uterushorn und danach über das Corpus uteri in Richtung Glasröhrchen. Das Spülmedium wurde in einer Schale aufgefangen. Später wurde diese Technik von NEWCOMB u.
ROWSON (1975) leicht modifiziert, indem sie einen Ballonkatheter durch die zuvor perforierte Uteruswand in Richtung auf die utero-tubale Verbindung schoben, bis der Ballon vollständig im Lumen des Uterus lag. Dieser wurde dann aufgepumpt, so dass das Uterushorn zum Corpus hin abgedichtet war. Dann wurde durch den Fimbrientrichter ein Nylonröhrchen in den Eileiter verbracht. Anschließend wurde der Uterus mit einer Spritze ca. 4 cm kaudal der utero-tubalen Verbindung punktiert und gespült. Dies geschah zuerst in Richtung auf den Ballonkatheter zu und anschließend auch in Richtung Eileiter, wobei der Uterus mit den Fingern abgedichtet wurde. Wenn nötig wurde der Uterus anschließend noch mit den Fingern ausgestrichen. Die Spülflüssigkeit wurde auf beiden Seiten in einer Glasschale aufgefangen. Nach Beendigung dieser Prozedur wurde das Loch, durch welches der Ballonkatheter in den Uterus inseriert worden war, wieder verschlossen (ELLINGTON 1990a).
Ein anderer Zugang zum Eileiter beim Rind ist der Weg über die Flanke (WOLFE et al. 1990). Auch hier wurde das Tier in Allgemeinanästhesie abgelegt, jedoch auf die rechte Seite. Dann erfolgte ein 20 cm langer Schnitt in der linken Flanke, durch den die linke Uterushornspitze, Eileiter und Arterie vorgelagert werden konnten. Die Spülung erfolgte wie bei ROWSON et al. (1969) zuvor beschrieben, jedoch ohne das Uterushorn abzuklemmen. Nach erfolgter Spülung musste das Tier umgelagert werden, so dass auch die andere Seite gespült werden konnte. LAURINCIK et al.
(1993) und VAN SOOM et al. (1997) gewannen tubale Embryonalstadien auch durch einen Zugang über die Flanke. Sie exzisierten jedoch am lebenden Tier den Eileiter samt Uterushorn und spülten diesen dann im Labor.
ROMMEL et al. (1988) erreichten den Eileiter, indem sie die Vagina dorsal der Portio vaginalis uteri mit einem Perforator durchstießen und stumpf mit der Hand eröffneten. Dann wurden beide Uterushörner mit Eileitern und Ovarien nahe am Corpus uteri mittels Ovariotom abgesetzt und im Labor gespült.
Bereits 1998 beschrieben BESENFELDER und BREM den transvaginalen Zugang zum Eileiter. 1999 wurde erstmals für das Rind über die transvaginale Endoskopie zur Gewinnung früher Embryonalstadien berichtet (HAVLICEK et al. 1999;
BESENFELDER et al. 2001; HAVLICEK 2002; MOSSLACHER et al. 2001, 2003).
Hierbei erhielten superovulierte Färsen (meist Simmentaler) eine Epiduralanästhesie.
Es erfolgte zunächst die Platzierung eines Uterusspülkatheters im linken Uterushorn.
Danach wurde das Endoskop transvaginal eingeführt und durch eine in den Eileiter eingeführte Spülkanüle mit wenigen Millilitern Spülmedium zunächst der Inhalt des Eileiters in das Uterushorn gespült. Von dort gewannen sie die Embryonen dann über den Uterusspülkatheter. Danach wurde der Uterusspülkatheter auf die rechte Seite gelegt und der Vorgang wiederholt.
Ein Überblick über die Spülergebnisse der verschiedenen Methoden ist in Tabelle 1 gegeben.
Tabelle 1: Ergebnisse der Eileiterspülungen bei lebenden Tieren
Autoren Wiederfindungsrate (%) Intakte Embryonen (%)
BRACKETT et al. 1980 71 -
ELLINGTON et al. 1990a 83 (Kühe)/110 (Färsen) 89 (Kühe)/98 (Färsen)
ELLINGTON et al. 1990b 74 89
WOLFE et al. 1990 80 69
LAURINCIK et al. 1993 75 71
HAVLICEK et al.1999 31 Embryonen von 4 Tieren 100 BESENFELDER et al. 2001
Unilaterale Spülung, keine SO 72 92
Unilaterale Spülung, SO (FSH) 100 97,5
Bilaterale Spülung, SO (FSH) 105 96,5
MOSSLACHER et al. 2001 89 85
(SO=Superovulation)
2.2.2 Gewinnung uteriner Embryonalstadien
In den 70iger Jahren wurde von TESTART u. GODARD-SIOUR (1975) eine Methode zur Gewinnung uteriner Embryonalstadien beim Rind vorgestellt, bei der sie zuerst durch eine Inzision im Scheidendach die Bauchhöhle eröffneten. Anschließend wurde durch dieses Loch eine Metallkanüle mit daran befestigtem Foley-Katheter mit Ballon in das Uterushorn nahe der Zervix inseriert. Dort erfolgte die Insufflation des Ballons mit Luft, wodurch dieser im Horn fixiert und gleichzeitig ein Verschluss des Uterushorns gegenüber dem Uteruskörper erreicht wurde. Über diesen Katheter erfolgte dann die Spülung des Uterushorns.
Mittlerweile werden uterine Embryonalstadien beim Rind unblutig durch Spülung am stehenden Tier gewonnen (HAHN 1978; GÖRLACH 1997). Für die Spülung wird ein flexibler Ballonkatheter mit einem Mandrin versteift und durch die Scheide, den Gebärmutterhals und -körper in eines der beiden Gebärmutterhörner geschoben.
Dies geschieht unter manueller rektaler Kontrolle. Sobald die Katheterspitze die große Kurvatur des entsprechenden Hornes erreicht hat, wird der Mandrin 8 bis 10 cm zurückgezogen. Die flexible Katheterspitze wird dann vorsichtig weiter nach kranial vorgeschoben. Sobald der Katheter im vorderen Drittel des Uterushorns positioniert ist, wird er durch Aufblasen des Ballons dort fixiert (NIEMANN u.
MEINECKE 1993a). Damit ist das Uterushorn zum Uterus hin abgedichtet und kann ohne Flüssigkeitsverlust gespült werden. Als Spülmedium dient meist körperwarme phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit einem Zusatz von 1-2 % hitzeinaktiviertem Serum. Die Spülung wird fraktioniert vorgenommen und die rückgewonnene Flüssigkeit in einem Glasgefäß aufgefangen. Nach der Spülung eines Hornes muss der Katheter in das andere Horn umgesetzt werden, damit auch dieses gespült werden kann. Eine andere Möglichkeit uterine Embryonalstadien mit Hilfe eines Ballonkatheters zu gewinnen ist, diesen direkt hinter der Zervix zu fixieren (SEIDEL u. SEIDEL 1991). So kann der gesamte Uterus gespült werden, ohne dass der Katheter umgesetzt werden muß. Nachteil dieser Variante ist, dass der aufgeblasene Ballon gelegentlich eines der Hörner verschließt und somit eine komplette Spülung verhindert.
Pro Spenderkuh werden durchschnittlich fünf bis acht transfertaugliche Embryonen gewonnen, die ca. 50-80 % der Gewinnungsrate (Anzahl gewonnener Embryonen pro Anzahl an Gelbkörpern) ausmachen (GELDERMANN 2005c). CAMP stellte 1989 fest, dass der Anteil transfertauglicher Embryonen bei Donorkühen bis zum achten Lebensjahr bei 62 % liegt und danach auf 53 % sinkt, gefolgt von 32 % nach dem neunten Lebensjahr. Im Schnitt wurden bei Uterusspülungen im Jahr 2003 weltweit 6.0 transfertaugliche Embryonen pro Spülung gewonnen (Tab. 2; THIBIER 2004).
Die Rate der Nachkommen nach Transfer der erspülten Embryonen liegt zwischen 50-60 % (GELDERMANN 2005c).
Einflussfaktoren auf die Embryonenausbeute sind der Ernährungsstatus, das Alter, die Rasse, und die reproduktive Vergangenheit des Donors sowie die Auswirkungen wiederholter Superovulationsbehandlungen (MAPLETOFT et al. 2002). Das größte Problem beim Embryotransfer liegt in der hohen Variabilität der Ovarreaktionen (ADAMS 1994).
Tabelle 2: Durch Uterusspülungen gewonnene bovine in vivo Embryonen 2003 (THIBIER 2004)
Anzahl transferierter Embryonen Land/
Kontinent Spülungen Transfertaugliche
Embryonen frisch eingefroren total
Deutschland 2 687 - - - 9 955
Europa 17 503 104 726 41 289 53 328 94 617
(19,8 %) Weltweit 108 166 646 853 256 523 222 019 478 542
2.2.3 In vitro Produktion von Rinderembryonen
Die in vitro Produktion von Embryonen umfasst drei wesentliche methodische Schritte: die in vitro Reifung (IVM), in vitro Fertilisation (IVF) und in vitro Kultur (IVC) der befruchteten Eizelle (NIEMANN u. MEINECKE 1993b; Abb. 3).
Unbefruchtete Eizellen
Spermien
In vitro-Befruchtung 6-24 Stunden In vitro-Reifung
22-26 Stunden
In vitro-Kultivierung 6-8 Tage
Morulae/Blastozysten
In vitro-Kapazitation
Abbildung 3: Schematische Darstellung der in vitro Produktion (NIEMANN u.
MEINECKE 1993b, modifiziert)
Bovine Eizellen können aus Ovarien von Schlachttieren oder durch „Ovum Pick Up“
(OPU) von lebenden Tieren gewonnen werden (GELDERMANN 2005d). Die am häufigsten angewandten Techniken zur Oozytengewinnung von Schlachthofovarien sind die Aspiration und die Schneidemethode (slicing; ECKERT u. NIEMANN 1995).
Aus den so gewonnenen Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOKs) werden nur solche ausgewählt, die von mindestens 3-6 Zelllagen Kumulus umschlossen sind und ein homogenes Ooplasma aufweisen (NIEMANN u. MEINECKE 1993b). Nach Waschen der KOKs werden diese für 22-26 Stunden in ein Reifungsmedium verbracht (NIEMANN u. MEINECKE 1993b; LANE u. GARDNER 2004). Hier wird die Meiose fortgesetzt, in der die Eizellen vorher arretiert waren (RÜSSE u. SINOWATZ 1994).
Anschließend werden zu den gereiften Eizellen motile Spermien gegeben und diese für 6-24 Stunden in einem Fertilisierungsmedium koinkubiert. Danach werden die vermeintlichen Zygoten in Kulturmedium umgesetzt (LANE u. GARDNER 2004).
Cirka 6-8 Tage post inseminationem erreichen die Embryonen das Morula- bzw.
Blastozystenstadium (NIEMANN u. MEINECKE 1993b).
Als Grundmedien für die in vitro Kultur dienen einfache und komplexe Medien.
Zunächst wurden komplexe Medien mit Ko-Kultur von Zellen eingesetzt. Am gebräuchlichsten war das Tissue Culture Medium-199 (TCM-199; EYESTONE u.
FIRST 1989). Zusätzlich wurden dem Medium Serum (undefinierte Komponente) oder Serumersatzstoffe (Bovines Serumalbumin – BSA – semi-definiert;
Polyvinylalkohol – PVA – definiert) zugesetzt. Trotz erfolgreicher Embryonen- produktion und Etablierung von Trächtigkeiten nach dem Transfer solcher Embryonen wurden weitere Kultursysteme entwickelt, um die Entwicklungsraten zu verbessern (FARIN et al. 2001). Hierzu zählen eine Reihe von einfachen Medien, die größtenteils auf Modifikationen des SOF-Mediums (Synthetic Oviductal Fluid) basieren (TERVIT et al. 1972; KESKINTEPE et al. 1995). So wurden zum Beispiel definierte Medien entwickelt, indem bovines Serumalbumin (BSA) im SOF durch andere Makromoleküle wie das PVP (Polyvinylpyrrolidon) oder PVA (Polyvinylalkohol) ersetzt wurde (KESKINTEPE u. BRACKETT 1996). In diese Gruppe der einfachen Medien fällt auch das HECM (Hamster Embryo Culture Medium; KRISHER et al. 1999). Unter Verwendung dieser Medien (TCM-199, SOF, HECM) können Entwicklungsraten bis zur Blastozyste von über 40 % erzielt werden (KESKINTEPE u. BRACKETT 1996; KRISHER et al. 1999). Die Entwicklungsraten in definierten Medien sind meistens niedriger als in semi-definierten (BSA) oder undefinierten (Serum) Medien (ECKERT u. NIEMANN 1995; KESKINTEPE u.
BRACKETT 1996; WRENZYCKI et al. 1999, 2001a).
2.3 Genexpression in präimplantatorischen Rinderembryonen
Die präimplantatorische Embryonalentwicklung ist ein komplexer Vorgang, der auf der korrekten Umsetzung des genetischen Programms der Zygote in einem geeigneten Umfeld beruht. Während dieser frühen Phase der Embryonalentwicklung durchläuft der Embryo (1) die ersten Furchungen und Teilungen, (2) die (Haupt-) Aktivierung des embryonalen Genoms im 8- bis 16-Zell Stadium, (3) die Kompaktierung der Morula und (4) die Ausbildung der Blastozyste, begleitet von der ersten Differenzierung der embryonalen Zellen in die innere Zellmasse (inner cell
mass, ICM) und das Trophektoderm (TE). Diese Ereignisse werden von inadäquaten Kulturbedingungen nachteilig beeinflusst und haben somit einen Einfluss auf die Blastozystenqualität (LAZZARI et al. 2002; LONERGAN et al. 2003c; WRENZYCKI et al. 2005). Die in vitro Konditionen können bis heute die dynamischen Veränderungen des Eileiters und des Uterus, die auf den variierenden Metabolismus des sich entwickelnden Embryos reagieren, nicht nachahmen, und nur die physiologische Umgebung des präimplantatorischen Embryos bietet optimale Konditionen für die Entwicklung zur Blastozyste bester Qualität (BAVISTER 1995).
2.3.1 Genexpression in Rinderembryonen unterschiedlicher Herkunft
Trotz der enormen Verbesserungen der bovinen IVP zeigen in vitro generierte Embryonen und Embryonen aus somatischem Kerntransfer (sNT) noch immer eine Reihe merklicher Unterschiede verglichen mit in vivo generierten Embryonen. Dies zeigt sich zum Beispiel in ihrer Morphologie (Farbe, Größe, Zellzahl), der zeitlichen Entwicklung, dem Metabolismus, anhand biochemischer Merkmale wie Zonastabilität und Widerstandsfähigkeit bei der Kryokonservierung sowie den mRNA- Expressionsmustern entwicklungsrelevanter Gene (WRENZYCKI et al. 2005a). In der Vergangenheit wurde gezeigt, dass selbst kleinste Veränderungen der mRNA- Expression biologische Auswirkungen haben können, wie zum Beispiel die Prädisposition zur Ausbildung von Tumoren (YAN et al. 2002).
Die präimplantatorische Embryonalentwicklung erfordert eine Reihe von Änderungen in der Genexpression im Verlauf der ersten Furchungen, der Aktivierung des embryonalen Genoms und der Kompaktierung und Blastozystenbildung mit Ausbildung der inneren Zellmasse (ICM) und des Trophektoderms (TE;
KIDDER 1992). Hierbei spielen sowohl maternale mRNA und Proteine eine Rolle, welche während des Oozytenwachstums synthetisiert und akkumuliert wurden und zur frühen Entwicklung beitragen (TELFORD et al. 1990), als auch paternale mRNA, welche während der Fertilisation in die Eizelle gelangt (OSTERMEIER et al. 2004). In der Phase des Übergangs von der maternalen auf die embryonale Expression (MET) ist der Embryo besonders anfällig gegenüber externen Faktoren (DEAN et al. 2001).
Die major activation (Hauptaktivierung) des bovinen embryonalen Genoms erfolgt im
8- bis 16-Zell-Stadium (TELFORD et al. 1990), wohingegen die minor activation („kleine“ Aktivierung) schon in der Zygote beobachtet werden kann (MEMILI u.
FIRST 2000). Die meisten Gene werden zeit- und stadienabhängig, dem allgemeinen maternalen und/oder embryonalen Expressionsmuster folgend, transkribiert (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000). Die in vitro Umgebung und die Kerntransferprozedur an sich haben einen großen Einfluss auf die mRNA- Expressionsmuster in präimplantatorischen Rinderembryonen (NIEMANN u.
WRENZYCKI 2000; LONERGAN et al. 2001; NIEMANN et al. 2002; WRENZYCKI et al. 2004) und sind korreliert mit signifikanter Hoch- oder Herunterregulierung, de novo-Induktion oder Stilllegung von Genen, die für die ungestörte Embryonal-, Fetal- und Neonatalentwicklung verantwortlich sind (Tab. 3; WRENZYCKI et al.
2005b).
Tabelle 3: Nachgewiesene Genexpressionsmuster (mRNA-Expression) während des bovinen Oozytenwachstums, der Oozyten- Maturation und der präimplantatorischen Embryonal- entwicklung
Oozytenwachstum (wachsende, unreife Eizelle) Exprimierte Transkripte UBF, Hsp Abfall der Transkriptmenge RNA pol1 Anstieg der Transkriptmenge (BARAN et
al. 2004) PolyA
Oozyten-Maturation (ausgewachsene unreife Eizelle – maturierte Eizelle)
Exprimierte Transkripte nach in vivo Maturation
RNA pol1, UBF, PolyA, GDF-9, G6PD, Mn- SOD, GDF-9, cyclin A2, cyclin B1, Glut-1, -8, GCS, GPX, SOX, CU/Zn-SOD
Abfall der Transkriptmenge (HUMBLOT et
al. 2005) Hsp
Exprimierte Transkripte nach in vitro Maturation
Cx43, Plako, Glut-1, -3, -8, SGLT, Igf1r; Igf2, Igf2r, PolyA, Hsp, EP2, EP4, p300, CREB,
YAP65, HMGN1, ATF-1, HMGB1, NFAR, Oct-4, TEAD2, HDAC1-3, HDAC7, HAT1, GCN5, H2A, GH, pit-1, GDF-9, Cyclin A2, Cyclin B1, G6PD, GCS, SOX, Mn-SOD, CU/Zn-SOD, ZO-1, ZO-2, Occludin, JAM, LR-β, gp130, β-actin, GPI, HK, LDH, ZFX, HPRT, Lamin B, U2snRNA, 18S, DNMT1, DNMT3a, DNMT3b
Abfall der Transkriptmenge (EINSPANIER et al. 2002; VIGNEAULT et al. 2004;
ROBERT et al. 2002)
VEGF, YY1, HMGA1, RY-1, HMGN2, MSY2, TBP, Ubiquitin, Tubulin
Anstieg der Transkriptmenge (BIESER et al. 1998; CALDER et al. 2001; LONERGAN et al. 2003b)
TIMP1, TGFβ1, EP3, GPX,
Anstieg, gefolgt von einem Abfallen der Transkriptmenge (BIESER et al. 1998;
EINSPANIER et al. 2002; CALDER et al.
2001)
PAI1, uPA, MMP1, bFGF, FGFR, flk, flt, COX-2
Änderungen aufgrund des Maturations- protokolls (WRENZYCKI et al. 1999;
WATSON et al. 2000; WEKSBURG et al.
2002)
PolyA, Hsp, Na/K-ATPase α1, Cyclin A
Änderungen aufgrund unterschiedlicher
KOK-Qualität (CALDER et al. 2001) EP3
Erste Furchungen und Minor activation des embryonalen Genoms (Zygote – 8-Zeller) Exprimierte Transkripte nach in vitro
Fertilisation
Cx43, Plako, PolyA, Glut-1, -3, -8, SGLT, Hsp, DcII und DcIII (ab dem 2-Zell-Stadium), Igf1r, Igf2, Igf2r, YY1, HMGA1, RY-1, p300, CREB, YAP65, HMGN1, NFAR, Oct-4, TEAD2, ATF-1, HMGN2, MSY2, TBP, β- actin, G6PD, Ubiquitin, Lamin B, Tubulin, H2A, U2snRNA, 18S, Sry (ab dem 4-Zell
Stadium), ZFX, HPRT, GPI, HK, SOX, Mn- SOD, CS, GDF-9, Cyclin B1, H3A, LIF, LR- β, gp 130, bFGF, TGF, PDGF, HDAC1-3, HDAC7, HAT1, GCN5, GH, pit-1, Na/K- ATPase, DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, PAIP1, PSCD2, NADH-dehydrogenase subunit2, KIAA1764, NAPL1, TCF7L2, Alivin1, NY-REN-58 antigen, Cytokin-like nuclear factor
Änderungen aufgrund des Kultivierungs- protokolls (WRENZYCKI et al. 1999;
LONERGAN et al. 2003a; TESFAYE et al.
2004)
Hsp (Zygote – 4-Zeller), G6PD (4-Zeller), SOX (2-und 4-Zeller), PAIP1 und NY-REN- 58 antigen (2-Zeller), NAPL1 (4-Zeller), KIAA1764 u. TCF7L2 u. Alivin1 u. Cytokin- like nuclear factor (2- und 4-Zeller)
Änderungen aufgrund des Auftretens der ersten Furchung (GUTIÉRREZ-ADÁN et al.
2004; FAIR et al. 2004a, b)
SOX (2-und 4-Zeller), G6PD und Mn-SOD (4-Zeller), Ped und H3A (2-Zeller)
Änderungen aufgrund der Herkunft der
Eizellen (OROPEZA et al. 2004) Glut-1 (2 – 4-Zeller) Stadien vom 8-16-Zeller bis zur geschlüpften Blastozyste
Exprimierte Transkripte nach der MET Cx43, Plako, DcII, DcIII, PolyA, Glut-1, -3, - 8, Glut-5 u. Bax u. DNMT1/3a/3b (ab dem 8- Zell Stadium), SGLT, Hsp, Igf1r, Igf2, Igf2r, G6PD, PGK, Xist, HPRT, Cu/Zn-SOD, Mn- SOD, SOX, bFGF, β-actin, Ubiquitin, Lamin B, Tubulin, H2A, U2snRNA, 18S, Sry, ZFX, ZFY (in männlichen Blastozysten), GPI, HK, CS, LDH, PFK, LIF, LRβ, gp 130, TGF, PDGF, GH, GHr, pit-1, HDAC 1-3, HDAC 7, HAT1, GCN5, Na/K-ATPase, YY1, HMGA1, RY-1, p300, CREB, YAP65, HMGN1, HMGB1, NFAR, Oct-4, TEAD2, ATF-1,
HMGN2, MSY2, TBP, PAIP1, PSCD2, NADH-dehydrogenase subunit2, KIAA1764, NAPL1, TCF7L2, Alivin1, NY-REN-58 antigen, Cytokin-like nuclear factor Exprimierte Transkripte ab dem
Blastozystenstadium IF τ, Glut-4 Anstieg der Transkriptmenge in der
Morula Bax, Igf1r, IGF2, Cx43, SOX, Alivin1
Anstieg der Transkriptmenge in der Blastozyste
Glut-1, -5, Plako, PolyA, DcII, Igf1r, Igf2, Igf2r, β-actin, G6PD, Ubiquitin, Lamin B, Tubulin, U2-snRNA, Bax, Cx43, SOX, HDAC 1-3, Hat1, YY1
Transkripte, die nur in Blastozysten analysiert wurden
H4.1, Mash2, gadd153, bcl-xl, galectin-1, fibronectin, filaminA
8-16-Zeller (Major activation des embryonalen Genoms (MET) Änderungen aufgrund des Kultivierungs-
protokolls (GUTIÉRREZ-ADÁN et al. 2004;
WRENZYCKI et al. 1999; LONERGAN et al.
2003a; TESFAYE et al. 2004)
Cx43, Glut-1, -5, PolyA, DcIII, Hsp, Bax, Mn- SOD, Igf1r, Igf2, SOX, G6PD,Xist, NADH- dehydrogenase subunit2, TCF7L2, Cytokin- like nuclear factor
Änderungen aufgrund der Herkunft der Eizellen (OROPEZA et al. 2004)
Glut-1, eIF1A (nur in diesem Stadium exprimiert)
Kompaktierte Morula
Änderungen aufgrund des Kultivierungs- protokolls (WRENZYCKI et al. 1999, 2001a, LONERGAN et al. 2003a, TESFAYE et al. 2004)
Cx43, Hsp, DcII, DcIII, Plako, Glut-1, -5, E- cad, G6PD, Bax, Igf1r, Igf2, SOX, IF τ, TCF7L2, Alivin1
Änderungen aufgrund des Kerntransfer-
protokolls (WRENZYCKI et al. 2002) G6PD, Xist Änderungen aufgrund des Geschlechts
(WRENZYCKI et al. 2002) G6PD, PGK, Xist
Blastozyste
Änderungen aufgrund des Kultivierungs- protokolls (ECKERT u. NIEMANN 1998;
WRENZYCKI et al. 1999; 2001a, b, 2002;
LEQUARRÉ et al. 2001; YASEEN et al.
2001; BERTOLINI et al. 2002; KNIJN et al.
2002; LAZZARI et al. 2002; RIEF et al. 2002;
RIZOS et al. 2002, 2003; LONERGAN et al 2003a; WRENZYCKI u. NIEMANN 2003;
FAIR et al. 2004a; HARVEY et al. 2004;
MOHAN et al. 2004; TESFAYE et al. 2004)
Cx43, PolyA, DcII, Igf1r, Igf2, Igf2r, Plako, Glut-1, -3, -4, -5, G6PD, PGK, Hsp, Cu/Zn- SOD, bFGF, Dnmt1, Mash2, Xist, Bax, Mn- SOD, SOX, LIF, LRβ, Cx31, IF τ, Galectin-1, Fibronectin, Filamin A, Ped, Alivin1
Änderungen aufgrund des Kerntransfer- protokolls (WRENZYCKI et al. 2001b, 2002; WRENZYCKI u. NIEMANN 2003;
DANIELS et al. 2000, 2001; HAN et al.
2003)
G6PD, PGK, Xist, Dnmt1, Dnmt3a, Mash2, IF τ, Hsp, FGF4, FGFr2, Igf2
Änderungen aufgrund des Geschlechts (GUTIÉRREZ-ADÁN et al. 1997, 2000;
WRENZYCKI et al. 2002; PEIPPO et al.
2002; LARSON et al 2001; JIMENEZ et al.
2003)
G6PD, Xist, Sry, ZFY, HPRT, Xiap, IF τ
Änderungen aufgrund der Kompak-
tierungsperiode (MILLER et al. 2003) ZO-1, ZO-2 Änderungen aufgrund des Auftretens der
Expandierung (WRENZYCKI et al. 2002) Na/K, E-cad, DcII, Plako, ZO-1
Die auffälligen Hoch- oder Herunterregulierungen, de novo-Induktionen oder Stilllegungen von Genen, die für die ungestörte embryonale, fetale und neonatale Entwicklung von Bedeutung sind, können zu abnormalen Entwicklungen führen, die unter dem Begriff des Large Offspring Syndromes (LOS) zusammengefasst werden (WRENZYCKI et al. 2005a; Abb. 4). Dazu werden Symptome wie der signifikante
Anstieg des Geburtsgewichtes, Polyhydramnion, Hydrops fetalis, ein verändertes Organwachstum, verschiedene Defekte der Plazenta, des Skeletts und des Immunsystems sowie eine erhöhte perinatale Sterblichkeit gezählt (WALKER et al.
1996; KRUIP u. DEN DAAS 1997; YOUNG et al. 1998; RENARD et al. 1999;
NIEMANN u. WRENZYCKI 2000; SINCLAIR et al. 2000).
Abbildung 4: Hypothese für die Induktion des Large Offspring Syndromes (LOS; WRENZYCKI et al. 2004, modifiziert; oben) und Symptome des LOS: Übergroßes Kalb (unten links), vergrößerte Leber (unten Mitte) und vergrößerte Niere (unten rechts)
Optimal Suboptimal Defizient
In vitro-Produktion und/oder somatischer Kerntransfer
Normale Entwicklung Entwicklungsstillstand
Verändertes Wachstum und gestörte Entwicklung
Herunterregulierung/
Genstilllegung
Hochregulierung/
Induktion der Genexpression
2.4 Epigenetische Prozesse während der frühen Embryonalentwicklung Genexpressionsmuster werden von genetischen und epigenetischen Mechanismen beeinflusst. Epigenetische Modifikationen sind vererbbare, reversible Änderungen der Genexpression, welche nicht auf Veränderungen der DNA-Sequenz beruhen (SHI et al. 2003). Sie beeinflussen die lokale Struktur, die Komposition und das
„Remodelling“ des Chromatins (WOLFFE u. MATZKE 1999).
Während der präimplantatorischen Entwicklung sind epigenetische Modifikationen wie die DNA-Methylierung und die Histon-Modifikationen in die Regulation geprägter (imprinted) und nicht geprägter (non-imprinted) Genen, die X-Chromosom- Inaktivierung und die Aufrechterhaltung der Telomerlänge involviert (WRENZYCKI et al. 2005a).
2.4.1 DNA-Methylierung
Die DNA-Methylierung findet sich bei diversen Organismen vom Bakterium über die Pflanze bis hin zum Säugetier (KLIMASAUSKAS et al. 1994). Die Methylierung findet dabei an der 5´-Position des Cytosinrings innerhalb der CpG-Dinukleotide (Cytosin- phosphatidyl-Guanin-Dinukleotid) statt (ROBERTSON et al. 1999). Diese CpG- Islands befinden sich zum Teil (60 %) in der Umgebung von Promotoren der Haushaltsgene, sind aber auch mit gewebespezifischen Genen assoziiert (ANTEQUERA 2003). Das Säugetiergenom enthält ~ 3x107 Domänen 5- Methylcytosin (m5C), wovon die meisten in 5´-m5CG-3´-Dinucleotiden vorliegen (BESTOR 2000). Insgesamt sind ca. 70 % der CpG-Domänen methyliert (ROBERTSON et al. 1999). Die DNA-Methyltransferasen sind in eine Reihe von biologischen Prozessen involviert, indem sie den Transfer einer Methylgruppe vom S-Adenosyl-L-Methionin auf die 5´Position des Cytosins katalysieren. Die DNA- Methylierung ist an der Kontrolle vieler zellulärer Prozesse bei den Eukaryonten beteiligt: u. a. der Transkription, dem genomischen Imprinting, der X-Chromosom- Inaktivierung, der Regulation der Entwicklung, der Mutagenese, der Transposition, der DNA-Reparatur und der Chromatin-Organisation (KLIMASAUSKAS et al. 1994).
Einer anderen Theorie zu Folge ist die primäre Funktion der Cytosin-Methylierung die
der Suppression parasitischer Sequenzelemente (endogene Retroviren und Transposons; YODER et al. 1997).
Beim Imprinting (Prägung) wird in Abhängigkeit von der elterlichen Herkunft nur ein Allel eines Gens exprimiert (mono-allelische Expression). Die Markierung des aktiven und inaktiven Allels wird durch eine unterschiedliche DNA-Methylierung in den entsprechenden regulatorischen Regionen erreicht. Diese unterschiedlich methylierten Regionen (differentially methylated regions; DMRs) sind essentiell für die Expression oder Unterdrückung eines Gens. Eine unproportional hohe Anzahl geprägter Gene ist auf dem maternalen Allel methyliert (REIK u. WALTER 2001).
Einige Methylierungsmuster werden von den Eltern an die Nachkommen vererbt, der größte Teil jedoch wird durch de novo-Methylierung kurz nach der Implantation des Embryos erstellt (YODER u. BESTOR 1998).
Störungen des genomischen Methylierungsmusters können schwerwiegende Auswirkungen auf den Phänotyp haben (BESTOR 2000) bzw. sind letal für Säugetiere (LI et al. 1992). Bis jetzt ist nicht vollständig geklärt, ob die DNA- Methylierung die Folge oder die Ursache transkriptionaler Repression ist (PARK u.
PFEIFER 2003).
Beim Menschen können epigenetische Fehler, welche die Chromatinstruktur oder die DNA-Methylierung verändern, ohne jedoch den genetischen Code zu ändern, zu verschiedenen Krankheiten führen. So stehen sie im Zusammenhang mit dem Beckwith-Wiedemann Syndrom (BWS), Angelman Syndrom (AS), Retinoblastomen (RB), Rett Syndrom, ATR-X Syndrom (Alpha Thalassemia/Mental Retardation Syndrome, X-linked), ICF Syndrom (Immunodeficiency, Centromere instability and Facial abnomalies) und verschiedenen Krebsformen (DEAN et al. 2005).
Bei der Maus findet die Reprogrammierung des DNA-Methylierungsmusters während der zwei Schlüsselperioden der Entwicklung statt (DEAN et al. 2005). Die erste ist mit der Entwicklung der Primordialkeimzellen während der Gametogenese assoziiert (GINSBURG et al. 1990). Zwischen Tag 7,5 und Tag 12,5 der Embryonalentwicklung
und der frühesten Phase der Differenzierung scheinen die Primordialkeimzellen methyliert zu werden (SEKI et al. 2005). Dabei behalten geprägte Gene ihre Methylierung bis zum Tag 11,5 und unterliegen dann innerhalb von 24 Stunden einer raschen Demethylierung. Diese Periode der Entfernung der Methylierung ist mit dem essentiellen Zurücksetzen der parent-of-origin spezifischen Methylierung der geprägten DMRs assoziiert, welche später mit dem Geschlecht des sich entwickelnden Embryos zusammenpassen müssen. Am Tag 12,5 sind die meisten Sequenzen maximal demethyliert und bleiben danach in ihrer Entwicklung stehen (die weiblichen in der meiotischen Prophase und die männlichen in der Mitose;
HAJKOVA et al. 2002). Während der postnatalen Wachstumsphase in der Oogenese wird die geprägte Methylierung der weiblichen Keimzellen wiederhergestellt (BOURC´HIS et al. 2001b). Bei den männlichen Tieren beginnt die Erstellung der DNA-Methylierungsmuster vor der Geburt in den Prospermatogonien und wird in mehreren Sequenzen nach der Geburt vollendet (DAVIS et al. 2000).
Die zweite Phase der Reprogrammierung des DNA-Methylierungsmusters wird während der Fertilisation initiiert (DEAN et al. 2005). Hierbei erfährt der paternale Spermien-Kern direkt nach der Dekondensierung und dem Austausch von Nukleoprotaminen durch Histone eine paternal-spezifische Demethylierung (SANTOS et al. 2002). Dieser Prozess initiiert die präimplantatorische Phase der Reprogrammierung der DNA-Methylierung bei der Maus und findet in Abwesenheit von DNA-Replikation statt weshalb sie auch aktive Demethylierung genannt wird (MAYER et al. 2000). Zwischen dem 2-Zell- und dem Morulastadium findet die schrittweise Demethylierung des maternalen Genoms statt. Diese Demethylierung erfolgt vermutlich durch aktiven Ausschluss von DNMT1 aus dem Zellkern und ist replikationsabhängig. Sie wird daher als passive Demethylierung bezeichnet (SANTOS et al. 2002; SHI et al. 2003). Geprägte Gene sind von dieser Demethylierung ausgenommen und bleiben methyliert. Die de novo-Methylierung erfolgt im späten Morula- bis Blastozystenstadium und resultiert bei allen Spezies in einer asymmetrischen Methylierung der inneren Zellmasse (ICM) und des Trophektoderms, wobei die innere Zellmasse im Vergleich zum Trophektoderm hypermethyliert wird (SANTOS et al. 2002; DEAN et al. 2005).
Abbildung 5: Zeitlicher Verlauf der DNA-Methylierung bei der Maus (DEAN et al. 2005, modifiziert)
Beim Rind ist die passive Demethylierungsphase zeitlich eingeschränkter. Hier erfolgt die Remethylierung durch de novo-Methylierung schon ab dem 8- bis 16-Zell- Stadium (BOURC´HIS et al. 2001a; DEAN et al. 2001; SHI et al. 2003; Abb. 5). Die DNA-Methylierung wird auch dort sowohl in den Zellen der inneren Zellmasse (ICM, Hypermethylierung) als auch in den Trophektodermzellen (TE, Hypomethylierung) nachgewiesen. Eine Hypermethylierung der ICM und des Trophektoderms wie sie bei geklonten bovinen Blastozysten nachgewiesen wurde, könnte im Zusammenhang mit plazentaren Dysfunktionen stehen, die bei Nachkommen aus sNT-Embryonen auftreten (KANG et al. 2002; SANTOS et al. 2003). Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass in bovinen Blastozysten sowohl die Aufrechterhaltung als auch die de novo-Methylierung durch die Kulturbedingungen in vitro beeinflusst werden (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003).
2.4.1.1 DNA-Methyltransferasen (DNMTs)
Bei Säugetieren wird die genetische Information mittels post-replikativer Methylierung von Cytosin-Domänen durch die DNA-Methyltransferasen DNMT1, 3a und 3b erstellt und aufrechterhalten (Abb. 6). DNMT1 ist dabei hauptsächlich für die Aufrechterhaltung der Methylierung erforderlich, während DNMT3a und 3b meist für die de novo-Methylierung verantwortlich sind (MARGOT et al. 2003). Die DNA- niedrig
hoch
Keimzellen Zygote Embryo
Primordial Gereift
Fertilisation
Methylierung
Methyltransferasen bestehen aus zwei funktionellen Domänen: der N-terminalen Domäne mit regulatorischen Funktionen, und der C-terminalen katalytischen Domäne (BESTOR 2000; ROBERTSON 2002). Im Gegensatz zu DNMT3a und 3b ist die C-terminale Region von DNMT1 trotz der Präsenz eines Sequenzmotivs, welches typisch ist für aktive DNA-Methyltransferasen, katalytisch inaktiv. Eine Deletion in dieser Region hat gezeigt, dass ein großer Teil der N-terminalen Region für die enzymatische Aktivität benötigt wird (MARGOT et al. 2003).
Auch laut OKANO et al. (1999) werden die Aufrechterhaltung der Methylierung und die de novo-Methylierung von verschiedenen Enzymen ausgeführt. Hierbei agieren sequenz-spezifische de novo-Methyltransferasen in verschiedenen Stadien der Gametogenese und der frühen Embryonalentwicklung, um Methylierungsmuster zu erstellen, welche dann während der Zellteilung von sequenz-unspezifischen DNA- Methyltransferasen aufrechterhalten werden, die nur hemimethylierte Substrate methylieren können. In diesem Modell werden DNMT3a und DNMT3b die Aufgaben der de novo-Methylierung zugeteilt, und DNMT1 die der Aufrechterhaltung der Methylierung. Bislang konnte jedoch keiner Säugetier-DNA-Methyltransferase nachgewiesen werden sequenz-spezifisch zu sein, und die spezifische Aktivität von DNMT1 auf unmethylierte DNA-Substrate ist wesentlich höher als die von DNMT3a oder 3b. Des Weiteren ist DNMT1 wesentlich aktiver als eines der beiden anderen Enzyme (YODER et al. 1997).
Eine durch gezielte DNMT1-Mutationen verursachte globale Genom-Demethylierung hat gezeigt, dass die Cytosin-Methylierung eine essentielle Rolle bei der X- Chromosom-Inaktivierung, dem genomischen Imprinting und der Genom- Stabilisierung spielt; ebenso wie bei der irreversiblen Promotoren-Stilllegung von Transposons und endogenen Retroviren (YODER et al. 1997).
Die genaue Rolle der DNMT2-Familie ist noch nicht geklärt. Es scheint aber, dass ein Zusammenhang mit der Aufrechterhaltung zentromerer Strukturen besteht (BESTOR 2000). DNMT2 wurde sowohl in Organismen, die Methylierung aufweisen gefunden, als auch bei solchen ohne feststellbare DNA-Methylierung. Homozygote Mäuse-DNMT2-Null-Mutanten sind lebensfähig und zeigen normale Methylierungs- level an endogenen Sequenzen (OKANO et al. 1998).
Zur Familie der DNMT3-Enzyme gehört auch DNMT3L. Diese DNA- Methyltransferase ist katalytisch inaktiv und wird zusammen mit DNMT3a und 3b während der Gametogenese und Embryogenese exprimiert (Untersuchungen an Mäusen; BOURC´HIS et al. 2001b; HATA et al. 2002). DNMT3a und 3L sind essentiell für die Ausbildung der geprägten Regionen in Oozyten (HATA et al. 2002).
Der genaue Mechanismus dieses Prozesses ist noch nicht geklärt, aber es scheint, dass DNMT3L die Funktion eines Aktivator-Proteins für die Methylierung einzelner Gene hat (DEAN et al. 2005). Laut GOWHER et al. (2005) kann DNMT3L die katalytische Aktivität von DNMT3a und 3b um das 15fache verstärken.
Abbildung 6: Die drei DNMT-Familien der Säugetiere (MARGOT et al. 2003) PBD=proteinbindende Domäne; TS=Zielsequenz;
C=cysteinreiche Region; PBHD=Polybromo-homologe Domäne;
PWWP=tryptophanreiche Region
2.4.1.1.1 DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1)
Die DNA-Methyltransferase1 (DNMT1) besteht aus 1620 Aminosäuren und hat eine Präferenz für hemimethylierte DNA. Sie ist in erster Linie für die Aufrechterhaltung der Methylierung und die Methylierung hemimethylierter CpG-Dinukleotide zuständig (OKANO et al. 1999). Außerdem ist sie in die de novo-Methylierung involviert und
übernimmt die Mehrheit der de novo-Methylierungsaktivitäten in Embryo-Lysaten (YODER et al. 1997). Das DNMT1-Protein enthält eine DNA-Doppelbindungsstelle, durch welche sich die Präferenz für hemimethylierte DNA erklären ließe. Während der C-Terminus eine Präferenz für unmethylierte DNA zeigt, wird methylierte DNA durch die N-terminale Domäne gebunden (BACOLLA et al. 1999, 2001). Die Inaktivierung von DNMT1 verursacht eine globale Demethylierung des Genoms (LI et al. 1992) und führt so zu einer prämaturen Aktivierung vieler Gene (JAENISCH u.
BIRD 2003). Homologe der DNMT1 sind in fast allen Eukaryonten mit m5C (5-Methylcytosin)-Domänen in der DNA zu finden, jedoch nicht in DNA ohne solche Domänen (BESTOR 2000). Die C-terminale Domäne der DNA-Methyltransferase1 ist den Restriktions-Methyltransferasen von Bakterien sehr ähnlich (BESTOR et al.
1988). Tatsächlich ist diese Domäne enger verwandt mit der von bakteriellen Enzymen als mit den Säugetier-DNA-Methyltransferasen der DNMT2- und DNMT3- Familien (BESTOR 2000). Die große N-terminale Domäne beinhaltet kleinere Domänen, die typische Eukaryonten-Funktionen besitzen wie den Import in Nuklei, die Koordination der Methylierung und Replikation während der S-Phase und die partielle Unterdrückung der de novo-Methylierung (BESTOR u. VERDINE 1994). Die katalytische C-Domäne muß von der N-terminalen Domäne aktiviert werden (MARGOT et al. 2003).
Bei Mäusen sind gezielte DNMT1-Mutationen rezessive Letalfaktoren, die eine Reihe einzigartiger Phänotypen verursachen: (1) homozygot mutante embryonale Stammzellen wachsen mit stark demethyliertem Genom normal, unterliegen jedoch bei Einleitung der Differenzierung zell-autonomer Apoptose (LI et al. 1992);
(2) homozygot mutante Embryonen zeigen eine biallele Expression einiger, wenn auch nicht aller, geprägter Gene (LI et al. 1993); (3) homozygote DNMT1-null- Embryonen zeigen Anhaltspunkte dafür, dass alle X-Chromosomen zumindest vorübergehend inaktiviert sind (BEARD et al. 1995).
Abbildung 7: Geschlechts-spezifische Exons und mRNAs von DNMT1 (BESTOR 2000)
Es wurden geschlechtsspezifische Isoformen von DNMT1 identifiziert, welche sich in der Anzahl an Aminosäuren unterscheiden (BESTOR et al. 1988; Abb. 7). Die Oozyten-Isoform von DNMT1 beinhaltet ein spezifisches 5´Exon (Exon 1o), welches verursacht, dass die Translation erst am ATG-Codon 4 beginnt. Daraus resultiert ein um 118 Aminosäuren kürzeres Protein. Im Gegensatz zu der somatischen Form von DNMT1 (DNMT1s), welche vorrangig im Nukleus lokalisiert ist, ist DNMT1o nur zu Beginn des Oozyten-Wachstums und während des 8-Zell Stadiums im Nukleus zu finden (BESTOR 2000). Vor der Ovulation und in präimplantatorischen Mäuseembryonen befindet sich DNMT1o im Zytoplasma und ist erst nach der Implantation im Zellkern lokalisiert, wo es von der längeren somatischen Form ersetzt wird (CARLSON et al. 1992). Ein spermienspezifischer Promotor (1p) ist in der dritten Isoform von DNMT1 zu finden, welcher nur in pachytänen Spermatozyten auftaucht. DNMT1-Protein ist zum Zeitpunkt der meiotischen Rekombination nicht in Spermatozyten und Oozyten nachzuweisen.
Oocyte-specific: High levels of truncated protein with full activity
Somatic cell-specific: Full-length Dnmt1
Pachytene spermatocyte-specific: No detectable Dnmt1
Oocyte Somatic
Oocyte
Die Beziehung zwischen DNMT1-Protein und mRNA-Gehalten in Keimzellen ist ungewöhnlich: Während hohe Protein-Gehalte in gereiften Eizellen und präimplantatorischen Embryonen kombiniert mit niedrigen mRNA-Gehalten zu diesem Zeitpunkt zu finden sind, ist die Situation in pachytänen Spermatozyten genau umgekehrt (MERTINEIT et al. 1998).
Beim Rind konnte die mRNA-Expression von DNMT1 in maturierten Eizellen und in Zygoten verschiedener Herkünfte (parthenogenetisch und in vitro produzierte Embryonen sowie Embryonen aus verschiedenen sNT-Protokollen) belegt werden (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003). In identisch generierten Embryonen im 8-Zell- Stadium war ein signifikanter Abfall des mRNA-Gehalts im Vergleich mit den Zygoten nachzuweisen, wohingegen im Blastozystenstadium ein signifikanter Anstieg bei den Embryonen aus dem Kerntransfer und nach in vitro Produktion im Gegensatz zu den in vivo gewonnenen Embryonen festgestellt wurde.
Bereits vorher (WRENZYCKI et al. 2001b) konnte nachgewiesen werden, dass es einen signifikanten Unterschied zwischen Kerntransferblastozysten aus Donorzellen unterschiedlicher Zellzyklus-Stadien sowie in vitro generierter Blastozysten gibt. Bei den letztgenannten war die Expression signifikant höher. Auch der Vergleich von in vivo generierten Blastozysten mit in vitro erzeugten Blastozysten aus unterschiedlichen Kultursystemen ergab einen signifikant niedrigeren mRNA-Gehalt in den in vivo Embryonen (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003).
2.4.1.1.2 DNA-Methyltransferasen 3a/3b (DNMT3a/DNMT3b)
DNMT3a und DNMT3b sind essentiell für die de novo-Methylierung von embryonalen Stammzellen (OKANO et al. 1999), die de novo-Methylierung während der frühembryonalen Entwicklung und sind an der Ausbildung des maternalen und paternalen Imprinting beteiligt (Untersuchungen an Mäusen; KANEDA et al. 2004).
DNMT3b spielt eine bedeutende Rolle während der frühen Embryonalentwicklung und methyliert ein breites Spektrum an DNA-Sequenzen, wohingegen DNMT3a eine Reihe an Genen oder Sequenzen zu methylieren scheint, die während der späteren Embryonalentwicklung und/oder nach der Geburt von Bedeutung sind (OKANO et al.
1999). Weiterhin methyliert DNMT3b eher GC-reiche Regionen des Genoms
(HERMANN et al. 2004) und DNMT3a ist für die de novo-Methylierung einzelner Gen-Loci zuständig (HATA et al. 2002). DNMT3a und 3b bestehen aus einer großen N-terminalen Domäne und einer kleineren katalytischen C-terminalen Domäne. Es wurden (bei der Hefe) jedoch keine intramolekularen Interaktionen zwischen den zwei Domänen, wie sie für DNMT1 beschrieben worden sind, festgestellt (MARGOT et al. 2003).
Störungen der DNMT3a-Expression sind letal für Mäuse, und auch von der DNMT3a/DNMT3b Doppelmutante wurde berichtet, dass sie unfähig ist, neu- integrierte retrovirale DNA zu methylieren. Bei den Einzelmutanten jedoch bleibt diese Fähigkeit erhalten (OKANO et al. 1999).
In bovinen in vitro und in vivo generierten sowie geklonten Embryonen konnte kein Unterschied in der DNMT3b-Expression nachgewiesen werden, es zeigte sich jedoch eine signifikant höhere Transkriptmenge von DNMT3a in den geklonten Embryonen (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003).
CAMARGO et al. (2005) stellten bei der Expression von DNMT3a und 3b in bovinen in vivo Blastozysten und solchen aus IVF- und sNT-Produktion einen signifikanten Unterschied zwischen den in vivo generierten Embryonen und den beiden anderen Gruppen fest. Die in vivo Blastozysten zeigten jeweils eine niedrigere Expression des entsprechenden Gens.
2.4.1.1.2.1 DNA-Methyltransferase 3a (DNMT3a)
Mutationen des DNMT3a-Gens sowohl auf dem paternalen als auch auf dem maternalen Allel führen zu Störungen der Reproduktion, der Embryonalentwicklung und des Imprintings. DNMT3a spielt auch bei der Spermatogenese eine große Rolle.
So war es z. B. nicht möglich, eine Trächtigkeit bei Mäusen des Wildtyps zu etablieren, welche mit DNMT3a mutanten männlichen Mäusen gekreuzt wurden (KANEDA et al. 2004). Zusätzlich war bei diesen Mäusen auch das Gewicht der Hoden herabgesetzt.
In kerntransferierten bovinen Embryonen konnte ein signifikanter Anstieg der DNMT3a-Expression im Vergleich zu in vivo generierten, parthenogenetischen und IVP-Blastozysten gezeigt werden (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003).
2.4.1.1.2.2 DNA-Methyltransferase 3b (DNMT3b)
Ähnlich wie bei DNMT1 sind auch bei DNMT3b verschiedene Varianten gefunden worden. So wurden vier Varianten mit gewebespezifischer Genexpression (DNMT3b1-4; Abb. 8) entdeckt, wovon zwei dieser Varianten veränderte katalytische Aktivitäten aufgrund des Fehlens zweier Methyltransferase-Motive aufweisen (ROBERTSON et al. 1999).
Abbildung 8: Die vier Varianten der humanen DNA-Methyltransferase 3b (ROBERTSON et al. 1999)
Bei einem humanen Gendefekt (ICF Syndrom; Immunodeficiency, Centromere instability and Facial abnomalies) wurde festgestellt, dass er durch Mutationen des DNA-Methyltransferase3b-Gens (DNMT3b) verursacht wird (BESTOR 2000).
Außerdem wurde eine Überexpression von DNMT3b in Tumorzellen beobachtet (ROBERTSON et al. 1999).
DNMT3b scheint auf die Methylierung bestimmter Kompartimente des Genoms spezialisiert zu sein. So führt ein Fehlen der DNMT3b-Aktivität zu Demethylierungen spezifischer Familien wiederholter Sequenzen und CpG-Islands auf dem inaktiven X- Chromosom (BESTOR 2000).
DNMT3b1
DNMT3b3
DNMT3b4
DNMT3b5
2.4.2 Histon-Methylierung
Nukleosome bestehen aus einem Kern von vier Proteinen, den sog. Histonen (H2A, H2B, H3 und H4 mit jeweils 102-135 Aminosäuren; GELDERMANN 2005a). Histone sind in die Modulation der Transkription während der Entwicklung, die X- Chromosom-Inaktivierung bei weiblichen Säugetieren und die Genom-Stabilität sowie die meiotische Chromosomendynamik involviert. Sie können durch Azetylierung, Phosphorylierung, Methylierung, ADP-Ribosylierung und Ubiquitylierung modifiziert werden (GOLL u. BESTOR 2002). Diese Änderungen werden nicht an den Histonen selber vorgenommen, sondern betreffen die N-termini (sog. Histon-tails; LACHNER et al. 2003; Abb. 9). Es gibt zwei Typen der Histon- Methylierung: die Methylierung an Arginin- oder Lysin-Residuen. Die Histon-Arginin- Methylierung ist in die Genaktivierung involviert und methyliert als Coaktivator Promotoren. Zu ihnen zählen die CARM1/PRMT1-Familien der Histon- Methyltransferasen, die überwiegend auf Histon 3 (H3) und Histon 4 (H4) abzielen (CHEN et al. 1999). Die Histon-Lysin-Methylierung spielt eine Rolle bei der Gen- Stilllegung von heterochromatischen Genen und wird durch Histon- Methyltransferasen der Familie der SET-Domäne tragenden Lysin- Methyltransferasen bewältigt (REA et al. 2000).
Die Lysin-Methylierung tritt an fünf Positionen innerhalb des N-Terminus von H3 auf:
K4, K9, K27, K36 und K79 (FENG et al. 2002) und wird durch Histon-Lysin- Methyltransferasen (HMTasen), wie beim Säugetier SUV39H katalysiert (REA et al.
2000). Die Methylierung an Lysin K4 und K9 bewirkt Entgegengesetztes: die K4- Methylierung wird mit transkriptionell aktivem Chromatin assoziiert und die K9- Methylierung mit inaktivem Chromatin (LACHNER u. JENUWEIN 2002).
Die H3-K9-Methylierung tritt auch bei fakultativem Heterochromatin des inaktiven X- Chromosoms weiblicher Säugetiere auf und wird hier auch während der Mitose aufrechterhalten (PETERS et al. 2002).
Die Kombination von Histon- und DNA-Methylierung stabilisiert möglicherweise die stillgelegten Chromatindomänen, schützt die Genexpressions-Programme und bewahrt die genomische Integrität (FUKS et al. 2003).
Abbildung 9: Überblick über einen Teil der Histon-Schwänze und mögliche Modifikationen (PETERSON u. LANIEL 2004)
Ac=Acetylierung; Me=Methylierung; P=Phosphorylierung;
Ub=Ubiquitylierung
Die Mehrheit der durch Kerntransfer erstellten Embryonen weist eine H3-K9- Hypermethylierung einhergehend mit einer DNA-Hypermethylierung auf, was ein genomweites Scheitern der Reprogrammierung nahe legt (SANTOS et al. 2003).
Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, dass zwischen der DNA- und Histon- Methylierung in Säugetierembryonen eine Verbindung besteht und enthüllen eine Beziehung zwischen epigenetischen Merkmalen und dem Entwicklungspotential geklonter Embryonen. Zwei denkbare Modelle bezüglich der Histon-Modifizierungen bestehen zurzeit: Zum einen können Histon-Modifizierungen die Chromatinstruktur direkt beeinflussen, und zum anderen werden durch die Modifizierungen spezielle Oberflächenstrukturen für Interaktionen mit anderen Proteinen gebildet (BERGER 2002).
Abbildung 10: Molekulare Struktur von mono-, di-, und tri-Methyl-Lysin (ZHANG u. REINBERG 2001)
2.4.2.1 Histon-Methyltransferasen (HMTasen)
HMTasen katalysieren die Mono-, Di- oder Tri-Methylierung der Lysin-Residuen (WATERBORG 1993; Abb. 10). Es wird vermutet, dass die Di- und Tri-Methylierung zu einer höheren Stabilität der Histon-Lysin-Methylierung beiträgt (LACHNER et al.
2003). Die Tri-Methylierung von H3-K4 wurde in komplett aktivierten Promotern gefunden, während die Di-Methylierung nur mit basaler Transkription assoziiert ist (SANTOS-ROSA et al. 2002). Im Gegensatz dazu induziert die H3-K9-Methylierung generell ein transkriptionell inaktives Chromatin (LACHNER u. JENUWEIN 2002).
Im Jahr 2000 stellten REA et al. fest, dass viele (jedoch nicht alle) Säugetierproteine, die eine SET-(Suppressor of Variegation, Enhancer of Zeste, and Trithorax) Domäne beinhalten, Histon-Lysin-Methyltransferasen sind. An die SET-Domäne grenzen zwei cysteinreiche Regionen. Es wird angenommen, dass nur in Kombination mit diesen zwei Regionen die Histon-Methyltransferase-Aktivität vorhanden ist. G9A und SUV39h besitzen beide die von den Cystein-Regionen flankierte SET-Domäne, unterscheiden sich jedoch in den anderen Regionen (TACHIBANA et al. 2001;
Abb. 12). Es wurde gezeigt, dass die eng verwandten SET-Domänen-Proteine Suv39h1 und Suv39h2 der Maus für die normale Histon-Methylierung innerhalb des Heterochromatins essentiell sind (REA et al. 2000).
Ein Fehlen der Histon-Methyltransferase G9A reduziert den Gehalt von methyliertem H3-K9 auf ca. ein Achtel des ursprünglichen Wildtyps. Wohingegen ein Fehlen der SUV39H-Methyltransferase diesen nur um die Hälfte verringert (TACHIBANA et al.
2002).
2.4.2.1.1 SUV39H1
SUV39H1 ist für die Histon-Methylierung von Heterochromatin-Kompartimenten des Nukleus von Bedeutung (PETERS et al. 2001).
Bei der Hefe S. pombe zeigten BANNISTER et al. (2001), dass SUV39H1 in Kooperation mit Heterochromatin-Protein1 (HP1) an der Gen-Stilllegung beteiligt ist (Abb. 11). Hierbei wird HP1 an Heterochromatin gebunden, wodurch es die Gen- Stilllegung herbeiführt. HP1 kann mit hoher Affinität an Histon H3 binden, aber nur wenn dieses an Lysin 9 methyliert ist; nicht jedoch an Lysin 4. Dabei wurde die Chromo-Domäne von HP1 als Methyl-Lysin-Bindungsdomäne identifiziert. Die Stilllegung der Transkription wird durch zwei Schritte erreicht: Zuerst platziert SUV39H1 einen „Methyl-Marker“ an Histon H3 und dieser wird dann von HP1 durch die Chromo-Domäne erkannt. Dieses Modell könnte auch die stabile Vererbbarkeit des heterochromatischen Zustandes erklären. Ein Versuch, HP1 durch G9A an Chromatin zu binden, schlug fehl (STEWART et al. 2005). Hierzu wird die direkte Protein-Protein-Interaktion zwischen SUV39H1 und HP1 benötigt. In vivo scheiterte die Heterochromatin-Assoziation von HP1-Proteinen an doppel-null-SUV39H1- Mäusefibroblasten. Sie konnte jedoch durch Wiedereinführung katalytisch-aktiver SUV39H1-HMTase wieder hergestellt werden (LACHNER et al. 2001). Störungen der zwei murinen Suv39h-HMTasen führten zu einer Abschaltung der H3-K9-Methylierung des konstitutiven Heterochromatins, nicht jedoch bei dem inaktivierten X-Chromosom (Xi). HP1 bindet jedoch nicht an Xi. Diese Beobachtungen veranlassten PETERS et al. (2002) zu der Vermutung, dass es noch einen Suv39h-HP1 unabhängigen Regulationsmechanismus für die Methylierung von H3-K9 bei fakultativem Heterochromatin geben muß.
