Mit Hilfe der semi-quantitativen Endpunkt-RT-PCR können die relativen Gehalte verschiedener Gentranskripte in einzelnen Embryonen untersucht werden (WRENZYCKI et al. 2001b, 2002; LAZZARI et al. 2002). Die Ergebnisse der vergleichenden Studien in der Genexpression in vivo gewonnener präimplantatorischer Rinderembryonen mit der in vitro produzierter Embryonen tragen zum besseren Verständnis der grundlegenden zellulären und molekularen Mechanismen bei der Kontrolle der embryonalen Genexpression bei. Daraus resultierend können verbesserte Kultursysteme entwickelt werden und die Technologien zur in vitro Erstellung von Embryonen verfeinert werden. Zusätzlich liefern diese Studien weitere Hinweise auf die Entstehung des Large Offspring Syndromes (LOS).
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die mRNA-Expression von fünf entwicklungsrelevanten Genen (DNMT1, 3a, 3b, SUV39H1 und G9A) in in vivo und in vitro generierten präimplantatorischen Rinderembryonen von der Zygote bis zur Blastozyste untersucht. Hierbei zeigte sich ein statistisch signifikanter Einfluss der Herkunft (in vivo/in vitro) der Embryonen bei der relativen Häufigkeit der DNMT1-, DNMT3a- und SUV39H1-Transkripte und des Entwicklungsstadiums bei der relativen Häufigkeit der DNMT1-, DNMT3a-, DNMT3b-, SUV39H1- und G9A-Transkripte. Für
alle untersuchten Gene konnte keine statistisch signifikante Interaktion zwischen Herkunft und Entwicklungsstadium der Embryonen nachgewiesen werden.
Die DNA-Methyltransferasen sind in eine Reihe von biologischen Prozessen involviert, indem sie den Transfer einer Methylgruppe vom S-Adenosyl-L-Methionin auf die 5´Position des Cytosins katalysieren. Die DNA-Methylierung resultiert unter anderem in einer Unterdrückung der Transkription. DNMT1 ist dabei meist für die Aufrechterhaltung der Methylierung erforderlich, während DNMT3a und 3b hauptsächlich für die de novo-Methylierung verantwortlich sind. Die Lysin-Methylierung spielt eine Rolle bei der Gen-Stilllegung und wird durch Histon-Methyltransferasen bewältigt. SUV39H1 ist für die Histon-Methylierung von Heterochromatin-Kompartimenten des Nukleus von Bedeutung, und G9A zielt auf euchromatische Regionen. Die DNA- und Histon-Methylierungen spielen während der epigenetischen Reprogrammierung in der frühen Embryonalentwicklung eine bedeutende Rolle (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003).
Für DNMT1 zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen den Morulae und den Blastozysten der beiden Herkünfte. In diesen beiden Stadien war die relative Transkriptmenge in den in vivo gewonnenen Embryonen niedriger als in den in vitro produzierten. Im Verlauf der mRNA-Expression zeigten sowohl die in vivo als auch die in vitro Embryonen jeweils signifikante Unterschiede zwischen den Zygoten bis 4-Zellern einerseits (höhere Expression) und den 8-Zell- bis Blastozysten-Stadien andererseits (niedrigere Expression). Diese Ergebnisse weisen auf eine hohe Aktivität der für die Aufrechterhaltung der Methylierung zuständigen DNA-Methyltransferase1 vor der Aktivierung des embryonalen Genoms, und einen signifikanten Abfall - sowohl bei den in vivo gewonnenen als auch bei den in vitro generierten Embryonen - nach der Aktivierung, hin. Hierbei bleibt jedoch die relative Transkriptmenge der in vitro produzierten Embryonen signifikant über dem Niveau der in vivo Embryonen.
RUSSEL und BETTS (2005) analysierten den Verlauf der DNMT1-Expression in Rinderembryonen in vitro mittels konfokaler Lasermikroskopie und stellten fest, dass wachsende Oozyten DNMT1-Transkripte bis zur 20fachen Menge in MII-Oozyten
akkumulieren. Nach der Fertilisation sinkt der Gehalt, bleibt bis zum 16-Zell-Stadium konstant, fällt dann weiter ab und bleibt bis zur Blastozyste konstant. Dabei wurde auch nachgewiesen, dass DNMT1 im Zytoplasma der Eizelle lokalisiert ist und nur im 16-Zell-Stadium in den Zellkern transloziert. In den expandierten Blastozysten befindet sich diese Methyltransferase dann im Zytoplasma des Trophektoderms und sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern der ICM. Ein annähernd gleicher Verlauf der Expression wurde auch in dieser Arbeit gezeigt. Hier fiel der Transkriptgehalt schon im 8-Zell-Stadium stark ab.
Ähnliche Ergebnisse konnten in den bislang veröffentlichten Studien über die DNMT1-Expression beim Rind (WRENZYCKI et al. 2001b; WRENZYCKI u.
NIEMANN 2003) erzielt werden. Hier wurde die relative Transkriptmenge von DNMT1 in Blastozysten unterschiedlicher Herkunft (in vivo, IVP- und Kerntransfer-Embryonen), 1-Zell bzw. 8-Zell-Stadien (IVP, parthenogenetische Embryonen und Kerntransfer-Embryonen unterschiedlicher Erstellungsprotokolle) und maturierten Eizellen untersucht. In identisch generierten Embryonen im 8-Zell-Stadium war ein signifikanter Abfall des mRNA-Gehalts im Vergleich mit den 1-Zell-Embryonen nachzuweisen, wohingegen im Blastozystenstadium ein signifikanter Anstieg bei den Embryonen aus dem Kerntransfer und nach in vitro Produktion, im Gegensatz zu den in vivo gewonnenen Embryonen, festgestellt wurde. Als mögliche Ursache für die unterschiedlichen Ergebnisse in den Blastozysten kommen die unterschiedlichen Konditionen der IVP nebst Kerntransfer in Frage. Des Weiteren ist für das Rind nachgewiesen worden (WRENZYCKI et al. 2001b), dass es einen signifikanten Unterschied zwischen Kerntransferblastozysten aus Donorzellen unterschiedlicher Zell-Zyklusstadien sowie in vitro generierten Blastozysten gibt. Bei den letztgenannten war die Expression signifikant erhöht. Auch der Vergleich von in vivo generierten Blastozysten mit in vitro erzeugten Blastozysten aus unterschiedlichen Kultursystemen ergab einen signifikant niedrigeren mRNA-Gehalt in den in vivo Embryonen. Diese Beobachtungen bestärken die Hypothese, dass aberrante DNA-Methylierungsmuster als ein ursächlicher Mechanismus für das Auftreten des LOS beteiligt sein könnten.
KANG et al. (2002) untersuchten Methylierungsmuster bei Rinder-Blastozysten durch Differentialfärbung und PCR-Untersuchungen verschiedener Promotor-Sequenzen, die einer starken Methylierung unterliegen. Hierbei verglichen sie Blastozysten aus sNT und IVP und stellten fest, dass einzelne Sequenzen, anders als Satelliten-Sequenzen, in den präimplantatorischen NT-Embryonen demethyliert sind. Diese Erkenntnis suggeriert eine selektive Demethylierung entwicklungsrelevanter Gene bei den geklonten Embryonen. Die Trophektodermzellen zeigten ebenfalls ein aberrantes Methylierungsmuster, was auf eine Dysregulierung im Bereich der extra-embryonalen Regionen hindeutet und in plazentaren Dysfunktionen resultiert. Auch in Satelliten-Regionen des bovinen Genoms ändern sich die Methylierungsmuster während des Wachstums vom Einzeller zur Blastozyste (KANG et al. 2005). So wurde in IVP-Embryonen im Satelliten I ein Erhalt der Methylierung beobachtet, ein Abfallen in den Alpha-Satelliten und ein Anstieg in den Satellit II-Regionen. Diese Beobachtungen konnten zum Teil (Satellit I und Alpha-Satellit) auch bei geklonten Embryonen dargestellt werden. Das zeigt, dass das Methylierungs-Kontrollsystem auch auf die Satelliten-Regionen in frühen bovinen Embryonen einwirkt.
Die meisten Untersuchungen über die DNA-Methyltransferasen der Säugetiere wurden bislang mit Antikörpern (AK) gegen spezifische DNA-Methyltransferasen oder global gegen 5-Methylcytosin durchgeführt. So stellte MONK (1990) fest, dass bei der Maus sowohl die DNA des paternalen als auch des maternalen Genoms zwischen dem 8-Zell-Stadium und der Blastozyste einen hohen Verlust der Methylierung am 5-Methylcytosin aufweist. Mittels polyclonaler Antikörper untersuchten CARLSON et al. (1992) die DNMT1-Gehalte in Mäuseembryonen verschiedener Stadien. Dabei fanden sie heraus, dass der Gehalt an DNMT1 in Oozyten und 1-Zell-Embryonen der Maus ca. 3000fach höher ist als in Erythroleukämie-Zellen. Bezüglich der Entwicklung in präimplantatorischen Mäuseembryonen stellten sie fest, dass die DNMT1-Gehalte während der frühen Embryonalentwicklung stark abnehmen, so dass in 8-Zell-Embryonen nur noch die Hälfte der Enzymmenge zu finden ist wie in Oozyten und Einzellern. Bei den Blastozysten ist dann nur noch ein Viertel des ursprünglichen Gehalts vorhanden.
Die Oozyten-Isoform DNMT1o ist nur zu Beginn des Oozyten-Wachstums und
während des 8-Zell Stadiums im Nukleus zu finden, vor der Ovulation und in präimplantatorischen Mäuseembryonen befindet sie sich im Zytoplasma (BESTOR 2000). Bei geklonten Mäuseembryonen findet diese Translokation in den Zellkern kaum oder nur eingeschränkt statt. Zusätzlich ist die somatische Form aberrant exprimiert. Diese Defekte in der Regulation der DNMT1-Expression könnten dafür verantwortlich sein, dass die für die weitere Entwicklung des Embryos notwendigen Schritte nicht korrekt ausgeführt werden und somit zu einer abnormalen Entwicklung führen (CHUNG et al. 2003). Die präimplantatorische Embryonalentwicklung der Maus ist gekennzeichnet durch einen enormen Abfall des 5-Methylcytosin-Gehalts der DNA, vor allem zwischen dem 8-Zell- und Blastozystenstadium. Gleichzeitig ist aber genau zu diesem Zeitpunkt der Gehalt der DNA-Methyltransferase sehr hoch.
Diese Tatsache legt die Überlegung nahe, dass die Demethylierung trotz hoher Gehalte an DNMT1 im Zellkern stattfindet, und zwar durch bislang unidentifizierte regulatorische Faktoren, welche die Aktivität der DNA-Methyltransferase1 modifizieren (CARLSON et al. 1992).
Beim Menschen wurden Transkripte von DNMT1 in gereiften Eizellen und frühen Furchungsstadien (2- und 4-Zeller) sowie Blastozysten nachgewiesen (HUNTRISS et al. 2004). Wahrscheinlich handelt es sich hierbei um die Oozytenform (DNMT1o), da ein Transkript der somatischen Form nicht nachzuweisen war. Die in dieser Arbeit verwendeten Primer zur Darstellung der DNMT1-Transkripte in Rinderembryonen lassen keine Unterscheidung zwischen somatischer und oozytenspezifischer Isoform zu, da sie im Bereich des 3´-Endes der cDNA liegen.
Die relative Transkriptmenge von DNMT3a unterschied sich signifikant zwischen den beiden verschiedenen Herkünften bei den 10-16-Zellern, den Morulae und den Blastozysten. Bei den erstgenannten und den Blastozysten war der Gehalt in den in vivo gewonnenen Embryonen niedriger als bei ihren in vitro Gegenspielern, und umgekehrt bei den Morulae. Im Verlauf der mRNA-Expression zeigte sich bei den in vivo Embryonen ein signifikant höherer Transkriptgehalt in den Blastozysten im Vergleich zu den Zygoten, 2-Zellern, 8-Zellern, 10-16-Zellern und Morulae. Bei den in vitro generierten Embryonen unterschieden sich alle untersuchten Stadien in ihrem
DNMT3a-Transkriptgehalt signifikant von dem der Blastozysten. Insgesamt zeigen die in vivo Embryonen einen deutlicheren Abfall der Transkriptmenge bis zum 10-16-Zeller, und danach einen gleichmäßigeren und moderateren Anstieg bis zur Blastozyste als die in vitro generierten Embryonen.
Die DNMT3b-Transkripte zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Expression zwischen den in vivo und in vitro generierten präimplantatorischen Embryonen. Im Verlauf der mRNA-Expression in vivo war zwischen den Zygoten (höhere Transkriptmenge) und Morulae (niedrigere Transkriptmenge) ein signifikanter Unterschied nachweisbar. Bei den in vitro generierten Embryonen war die Transkriptmenge in den Zygoten und 2-Zellern signifikant höher als in den anderen untersuchten Stadien.
In einer Studie (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003) wurde die Expression von DNMT3a und 3b in verschiedenen bovinen präimplantatorischen Embryonalstadien (Blastozysten in vivo, aus IVP und nach verschiedenen Kerntransfer-Protokollen), 1-Zell bzw. 8-Zell Stadien (IVP, parthenogenetische Embryonen und verschiedene Kerntransfer-Protokolle) und maturierten Eizellen untersucht. Hier zeigte sich nur bei den sNT-Blastozysten eine signifikant höhere Expression von DNMT3a als bei den Blastozysten der anderen Gruppen. Der Gesamtverlauf der DNMT3a- und DNMT3b-Expression in den jeweiligen Gruppen entsprach den Beobachtungen der vorliegenden Arbeit. In einer anderen Studie untersuchten CAMARGO et al. (2005) die mRNA-Expression von DNMT3a und 3b in bovinen in vivo Blastozysten und solchen aus IVF- und sNT-Produktion. Hierbei stellten sie bei beiden Genen einen signifikanten Unterschied zwischen den in vivo generierten Embryonen und den zwei anderen Gruppen fest. Die in vivo Blastozysten zeigten jeweils eine niedrigere Expression des entsprechenden Gentranskripts. Diese Beobachtung für DNMT3a deckt sich mit der der vorliegenden Arbeit.
Bei der Maus ist von OKANO et al. (1999) beschrieben worden, dass DNMT3a am Tag 7.5 der embryonalen Entwicklung im Ektoderm mäßig exprimiert war und schwach in den Zellen des Mesoderms. An Tag 8.5 und 9.5 wurde diese Expression ubiquitär. DNMT3b auf der anderen Seite war am Tag 7.5 im Ektoderm,
Neuralektoderm und Chorionektoderm hoch exprimiert. Über die Exprimierung dieser zwei Gene zu einem früheren Zeitpunkt liegen keine Informationen vor.
Beim Menschen wurde die Expression von DNMT3a in ovariellen Follikeln, maturierten Eizellen, 2- und 4-Zell-Embryonen und Blastozysten nachgewiesen.
Zusätzlich wurde auch die DNMT3b-Expression in maturierten Eizellen, 2- und 4-Zellern und Blastozysten belegt. Weiterhin wurden die Isoformen DNMT3b1 und DNMT3b4 in Primärfollikeln nachgewiesen, und DNMT3b1 zusätzlich noch in Oozyten im GV-Stadium, maturierten Eizellen, 2- und 4-Zellern und Blastozysten (HUNTRISS et al. 2004).
Die Aktivierung des embryonalen Genoms erfolgt beim Rind im 8- 16-Zell-Stadium (TELFORD et al. 1990; KANKA 2003), genauso wie die de novo-Methylierung (DEAN et al. 2001). Diese Tatsache suggeriert, dass zu diesem Zeitpunkt DNMT3a und 3b schon aktiviert sein müssen. Der deutliche Anstieg dieser beiden Transkriptmengen erfolgt bei beiden Genen im Blastozystenstadium. Auch die Theorie, dass das DNA-Methylierungsmuster der Säugetiere in der frühen Embryonalentwicklung durch die de novo-Methyltransferasen DNMT3a und 3b hergestellt wird und anschließend durch die Erhaltungs-Methyltransferase DNMT1 in somatische Zellen kopiert wird (BIRD 2002), kann durch die vorliegenden Ergebnisse weder bestätigt noch widerlegt werden.
Signifikante Unterschiede in der relativen Transkriptmenge zwischen in vivo und in vitro generierten Embryonen lassen darauf schließen, dass sowohl der Erhalt als auch die de novo-DNA-Methylierung von der in vitro Kultur (und den Kerntransferprotokollen) beeinflusst werden (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003;
WRENZYCKI et al. 2005a). Ein Vergleich der Genexpression der DNA-Methyltransferasen in den frühen tubalen präimplantatorischen in vivo Stadien beim Rind ist bislang noch nicht beschrieben worden.
Die relative Transkriptmenge von SUV39H1 (einer H3-K9 Histon-Methyltransferase) in den untersuchten Stadien unterschied sich mit Ausnahme der 4-Zeller signifikant in den Embryonen der zwei verschiedenen Herkünfte (in vivo/in vitro). Hierbei lag die
Transkriptmenge der in vitro generierten Embryonen immer über der der in vivo Embryonen. Innerhalb der beiden Herkunftsgruppen war kein signifikanter Unterschied nachweisbar.
Die signifikanten Unterschiede in der relativen Transkriptmenge zwischen fast allen Stadien der in vivo und in vitro generierten Embryonen lassen darauf schließen, dass die H3-K9-Methylierung stark von der in vitro Kultur beeinflusst wird. Der Verlauf in den in vivo und in vitro generierten Stadien ist jedoch sehr ähnlich. Bei beiden sinkt der relative Transkriptgehalt um den Zeitpunkt der Aktivierung des embryonalen Genoms leicht ab, um im Anschluss daran wieder anzusteigen. Dieser Anstieg ist bei den in vitro produzierten Embryonen deutlicher als bei den in vivo Embryonen.
Die Histon-Methyltransferase G9A zeigte keinen signifikanten Unterschied in der relativen Transkriptmenge zwischen in vivo und in vitro generierten Embryonen. Im Verlauf der mRNA-Expression in vivo unterschieden sich – mit einer Ausnahme - sowohl die Zygoten als auch die 2-Zeller signifikant von den anderen Stadien. Die Ausnahme bildete der Vergleich der mRNA-Expression der 2-Zeller mit der der 4-Zeller. Die 4-Zeller bis Blastozysten zeigten eine niedrigere Expression. Auch in vitro waren die Expressionen in den Zygoten und 2-Zellern signifikant höher als in den folgenden Stadien. Zusätzlich unterschied sich die relative Transkriptmenge in den 4-Zellern (höher exprimierend) signifikant von der in den Morulae (niedriger exprimierend).
Bei Mäusen stellten LEPIKHOV u. WALTER (2004) fest, dass die H3-K9-Methylierung im männlichen Vorkern nur schwach oder gar nicht ausgeprägt ist. In den weiblichen Vorkernen jedoch konnte ein deutliches Methylierungs-Signal ermittelt werden. Diese Asymmetrie in den parentalen Genomen bleibt bis zum 2-Zell-Stadium bestehen. Erst während des 4-Zell-Stadiums findet die de novo-Methylierung von H3-K9 statt und die Asymmetrie geht verloren (LEPIKHOV u.
WALTER 2004; LIU et al. 2004). Es konnte gezeigt werden, dass die Aufrechterhaltung der asymmetrischen H3-K9-Methylierung ein aktiver Prozess ist, welcher von der Proteinsynthese und der embryonalen Transkription abhängt (LIU et al. 2004).
Beim Rind wurde anhand von geklonten und IVP-Embryonen gezeigt, dass die H3-K9-Methylierung parallel mit der DNA-Methylierung reprogrammiert wird (SANTOS et al. 2003). Die Mehrheit der Embryonen aus somatischem Kerntransfer zeigte eine H3-K9-Hypermethylierung einhergehend mit einer DNA-Hypermethylierung. Diese Tatsache legt die Vermutung nahe, dass die Reprogrammierung genomweit beeinflusst ist.
Diese Ergebnisse weisen auf eine mechanistische Verbindung zwischen der DNA- und der Histon-Methylierung im Säugetierembryo hin und enthüllen eine Beziehung zwischen epigenetischen Merkmalen und dem Entwicklungspotential geklonter Embryonen. So wurde für den Pilz Neurospora crassa bereits die Möglichkeit aufgezeigt, dass das genomische Methylierungsmuster durch den Methylierungs-Status der Histone kontrolliert wird (TAMARU u. SELKER 2001).
HAN et al. (2003) folgerten aus der Tatsache, dass in geklonten Embryonen der gesamte Methylierungs-Status im Vergleich zu in vivo und in vitro Embryonen verändert ist, dass diese aufgrund einer inkompletten Reprogrammierung des DNA-Methylierungsmusters fehlerhaft reprogrammiert werden.
Ein Vergleich der Genexpression der Histon-Methyltransferasen in den frühen präimplantatorischen in vivo Stadien beim Rind ist bislang noch nicht beschrieben worden. Die ausgeprägten Änderungen im Expressionsmuster von SUV39H1 vor und nach der Aktivierung des embryonalen Genoms in den in vitro produzierten präimplantatorischen Rinderembryonen könnten jedoch ein Indiz dafür sein, dass die Histon-Methyltransferasen stärker durch die nicht physiologischen Konditionen der in vitro Kultur beeinflusst werden als die DNA-Methyltransferasen. Hier zeigten sich Unterschiede zwischen in vivo und in vitro produzierten Embryonen erst nach der Aktivierung der embryonalen Genexpression. Diese Theorie muß jedoch durch weiterführende Untersuchungen bestätigt werden.