2.3 Genexpression in präimplantatorischen Rinderembryonen
2.3.1 Genexpression in Rinderembryonen unterschiedlicher Herkunft
Trotz der enormen Verbesserungen der bovinen IVP zeigen in vitro generierte Embryonen und Embryonen aus somatischem Kerntransfer (sNT) noch immer eine Reihe merklicher Unterschiede verglichen mit in vivo generierten Embryonen. Dies zeigt sich zum Beispiel in ihrer Morphologie (Farbe, Größe, Zellzahl), der zeitlichen Entwicklung, dem Metabolismus, anhand biochemischer Merkmale wie Zonastabilität und Widerstandsfähigkeit bei der Kryokonservierung sowie den mRNA-Expressionsmustern entwicklungsrelevanter Gene (WRENZYCKI et al. 2005a). In der Vergangenheit wurde gezeigt, dass selbst kleinste Veränderungen der mRNA-Expression biologische Auswirkungen haben können, wie zum Beispiel die Prädisposition zur Ausbildung von Tumoren (YAN et al. 2002).
Die präimplantatorische Embryonalentwicklung erfordert eine Reihe von Änderungen in der Genexpression im Verlauf der ersten Furchungen, der Aktivierung des embryonalen Genoms und der Kompaktierung und Blastozystenbildung mit Ausbildung der inneren Zellmasse (ICM) und des Trophektoderms (TE;
KIDDER 1992). Hierbei spielen sowohl maternale mRNA und Proteine eine Rolle, welche während des Oozytenwachstums synthetisiert und akkumuliert wurden und zur frühen Entwicklung beitragen (TELFORD et al. 1990), als auch paternale mRNA, welche während der Fertilisation in die Eizelle gelangt (OSTERMEIER et al. 2004). In der Phase des Übergangs von der maternalen auf die embryonale Expression (MET) ist der Embryo besonders anfällig gegenüber externen Faktoren (DEAN et al. 2001).
Die major activation (Hauptaktivierung) des bovinen embryonalen Genoms erfolgt im
8- bis 16-Zell-Stadium (TELFORD et al. 1990), wohingegen die minor activation („kleine“ Aktivierung) schon in der Zygote beobachtet werden kann (MEMILI u.
FIRST 2000). Die meisten Gene werden zeit- und stadienabhängig, dem allgemeinen maternalen und/oder embryonalen Expressionsmuster folgend, transkribiert (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000). Die in vitro Umgebung und die Kerntransferprozedur an sich haben einen großen Einfluss auf die mRNA-Expressionsmuster in präimplantatorischen Rinderembryonen (NIEMANN u.
WRENZYCKI 2000; LONERGAN et al. 2001; NIEMANN et al. 2002; WRENZYCKI et al. 2004) und sind korreliert mit signifikanter Hoch- oder Herunterregulierung, de novo-Induktion oder Stilllegung von Genen, die für die ungestörte Embryonal-, Fetal- und Neonatalentwicklung verantwortlich sind (Tab. 3; WRENZYCKI et al.
2005b).
Tabelle 3: Nachgewiesene Genexpressionsmuster (mRNA-Expression) während des bovinen Oozytenwachstums, der Oozyten-Maturation und der präimplantatorischen Embryonal-entwicklung
Oozytenwachstum (wachsende, unreife Eizelle) Exprimierte Transkripte UBF, Hsp Abfall der Transkriptmenge RNA pol1 Anstieg der Transkriptmenge (BARAN et
al. 2004) PolyA
Oozyten-Maturation (ausgewachsene unreife Eizelle – maturierte Eizelle)
Exprimierte Transkripte nach in vivo Maturation
RNA pol1, UBF, PolyA, GDF-9, G6PD, Mn-SOD, GDF-9, cyclin A2, cyclin B1, Glut-1, -8, GCS, GPX, SOX, CU/Zn-SOD
Abfall der Transkriptmenge (HUMBLOT et
al. 2005) Hsp
Exprimierte Transkripte nach in vitro Maturation
Cx43, Plako, Glut-1, -3, -8, SGLT, Igf1r; Igf2, Igf2r, PolyA, Hsp, EP2, EP4, p300, CREB,
YAP65, HMGN1, ATF-1, HMGB1, NFAR, Oct-4, TEAD2, HDAC1-3, HDAC7, HAT1, GCN5, H2A, GH, pit-1, GDF-9, Cyclin A2, Cyclin B1, G6PD, GCS, SOX, Mn-SOD, CU/Zn-SOD, ZO-1, ZO-2, Occludin, JAM, LR-β, gp130, β-actin, GPI, HK, LDH, ZFX, HPRT, Lamin B, U2snRNA, 18S, DNMT1, DNMT3a, DNMT3b
Abfall der Transkriptmenge (EINSPANIER et al. 2002; VIGNEAULT et al. 2004;
ROBERT et al. 2002)
VEGF, YY1, HMGA1, RY-1, HMGN2, MSY2, TBP, Ubiquitin, Tubulin
Anstieg der Transkriptmenge (BIESER et al. 1998; CALDER et al. 2001; LONERGAN et al. 2003b)
TIMP1, TGFβ1, EP3, GPX,
Anstieg, gefolgt von einem Abfallen der Transkriptmenge (BIESER et al. 1998;
EINSPANIER et al. 2002; CALDER et al.
2001)
PAI1, uPA, MMP1, bFGF, FGFR, flk, flt, COX-2
Änderungen aufgrund des Maturations-protokolls (WRENZYCKI et al. 1999;
WATSON et al. 2000; WEKSBURG et al.
2002)
PolyA, Hsp, Na/K-ATPase α1, Cyclin A
Änderungen aufgrund unterschiedlicher
KOK-Qualität (CALDER et al. 2001) EP3
Erste Furchungen und Minor activation des embryonalen Genoms (Zygote – 8-Zeller) Exprimierte Transkripte nach in vitro
Fertilisation
Cx43, Plako, PolyA, Glut-1, -3, -8, SGLT, Hsp, DcII und DcIII (ab dem 2-Zell-Stadium), Igf1r, Igf2, Igf2r, YY1, HMGA1, RY-1, p300, CREB, YAP65, HMGN1, NFAR, Oct-4, TEAD2, ATF-1, HMGN2, MSY2, TBP, β-actin, G6PD, Ubiquitin, Lamin B, Tubulin, H2A, U2snRNA, 18S, Sry (ab dem 4-Zell
Stadium), ZFX, HPRT, GPI, HK, SOX, Mn-SOD, CS, GDF-9, Cyclin B1, H3A, LIF, LR-β, gp 130, bFGF, TGF, PDGF, HDAC1-3, HDAC7, HAT1, GCN5, GH, pit-1, Na/K-ATPase, DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, Kultivierungs-protokolls (WRENZYCKI et al. 1999;
LONERGAN et al. 2003a; TESFAYE et al.
2004)
Hsp (Zygote – 4-Zeller), G6PD (4-Zeller), SOX (2-und 4-Zeller), PAIP1 und NY-REN-58 antigen (2-Zeller), NAPL1 (4-Zeller), KIAA1764 u. TCF7L2 u. Alivin1 u. Cytokin-like nuclear factor (2- und 4-Zeller)
Änderungen aufgrund des Auftretens der ersten Furchung (GUTIÉRREZ-ADÁN et al.
2004; FAIR et al. 2004a, b)
SOX (2-und 4-Zeller), G6PD und Mn-SOD (4-Zeller), Ped und H3A (2-Zeller)
Änderungen aufgrund der Herkunft der
Eizellen (OROPEZA et al. 2004) Glut-1 (2 – 4-Zeller) Stadien vom 8-16-Zeller bis zur geschlüpften Blastozyste
Exprimierte Transkripte nach der MET Cx43, Plako, DcII, DcIII, PolyA, Glut1, 3, -8, Glut-5 u. Bax u. DNMT1/3a/3b (ab dem 8-Zell Stadium), SGLT, Hsp, Igf1r, Igf2, Igf2r, G6PD, PGK, Xist, HPRT, Cu/Zn-SOD, Mn-SOD, SOX, bFGF, β-actin, Ubiquitin, Lamin B, Tubulin, H2A, U2snRNA, 18S, Sry, ZFX, ZFY (in männlichen Blastozysten), GPI, HK, CS, LDH, PFK, LIF, LRβ, gp 130, TGF, PDGF, GH, GHr, pit-1, HDAC 1-3, HDAC 7, HAT1, GCN5, Na/K-ATPase, YY1, HMGA1, RY-1, p300, CREB, YAP65, HMGN1, HMGB1, NFAR, Oct-4, TEAD2, ATF-1,
HMGN2, MSY2, TBP, PAIP1, PSCD2, NADH-dehydrogenase subunit2, KIAA1764, NAPL1, TCF7L2, Alivin1, NY-REN-58 antigen, Cytokin-like nuclear factor Exprimierte Transkripte ab dem
Blastozystenstadium IF τ, Glut-4 Anstieg der Transkriptmenge in der
Morula Bax, Igf1r, IGF2, Cx43, SOX, Alivin1
Anstieg der Transkriptmenge in der Blastozyste
Glut-1, -5, Plako, PolyA, DcII, Igf1r, Igf2, Igf2r, β-actin, G6PD, Ubiquitin, Lamin B, Tubulin, U2-snRNA, Bax, Cx43, SOX, HDAC 1-3, Hat1, YY1
Transkripte, die nur in Blastozysten analysiert wurden
H4.1, Mash2, gadd153, bcl-xl, galectin-1, fibronectin, filaminA
8-16-Zeller (Major activation des embryonalen Genoms (MET) Änderungen aufgrund des
Kultivierungs-protokolls (GUTIÉRREZ-ADÁN et al. 2004;
WRENZYCKI et al. 1999; LONERGAN et al.
2003a; TESFAYE et al. 2004)
Cx43, Glut-1, -5, PolyA, DcIII, Hsp, Bax, Mn-SOD, Igf1r, Igf2, SOX, G6PD,Xist, NADH-dehydrogenase subunit2, TCF7L2, Cytokin-like nuclear factor
Änderungen aufgrund der Herkunft der Eizellen (OROPEZA et al. 2004)
Glut-1, eIF1A (nur in diesem Stadium exprimiert)
Kompaktierte Morula
Änderungen aufgrund des Kultivierungs-protokolls (WRENZYCKI et al. 1999, 2001a, LONERGAN et al. 2003a, TESFAYE et al. 2004)
Cx43, Hsp, DcII, DcIII, Plako, Glut-1, -5, E-cad, G6PD, Bax, Igf1r, Igf2, SOX, IF τ, TCF7L2, Alivin1
Änderungen aufgrund des
Kerntransfer-protokolls (WRENZYCKI et al. 2002) G6PD, Xist Änderungen aufgrund des Geschlechts
(WRENZYCKI et al. 2002) G6PD, PGK, Xist
Blastozyste
Änderungen aufgrund des Kultivierungs-protokolls (ECKERT u. NIEMANN 1998;
WRENZYCKI et al. 1999; 2001a, b, 2002;
LEQUARRÉ et al. 2001; YASEEN et al.
2001; BERTOLINI et al. 2002; KNIJN et al.
2002; LAZZARI et al. 2002; RIEF et al. 2002;
RIZOS et al. 2002, 2003; LONERGAN et al 2003a; WRENZYCKI u. NIEMANN 2003;
FAIR et al. 2004a; HARVEY et al. 2004;
MOHAN et al. 2004; TESFAYE et al. 2004)
Cx43, PolyA, DcII, Igf1r, Igf2, Igf2r, Plako, Glut-1, -3, -4, -5, G6PD, PGK, Hsp, Cu/Zn-SOD, bFGF, Dnmt1, Mash2, Xist, Bax, Mn-SOD, SOX, LIF, LRβ, Cx31, IF τ, Galectin-1, Fibronectin, Filamin A, Ped, Alivin1
Änderungen aufgrund des Kerntransfer-protokolls (WRENZYCKI et al. 2001b, 2002; WRENZYCKI u. NIEMANN 2003;
DANIELS et al. 2000, 2001; HAN et al.
2003)
G6PD, PGK, Xist, Dnmt1, Dnmt3a, Mash2, IF τ, Hsp, FGF4, FGFr2, Igf2
Änderungen aufgrund des Geschlechts (GUTIÉRREZ-ADÁN et al. 1997, 2000;
WRENZYCKI et al. 2002; PEIPPO et al.
2002; LARSON et al 2001; JIMENEZ et al.
2003)
G6PD, Xist, Sry, ZFY, HPRT, Xiap, IF τ
Änderungen aufgrund der
Kompak-tierungsperiode (MILLER et al. 2003) ZO-1, ZO-2 Änderungen aufgrund des Auftretens der
Expandierung (WRENZYCKI et al. 2002) Na/K, E-cad, DcII, Plako, ZO-1
Die auffälligen Hoch- oder Herunterregulierungen, de novo-Induktionen oder Stilllegungen von Genen, die für die ungestörte embryonale, fetale und neonatale Entwicklung von Bedeutung sind, können zu abnormalen Entwicklungen führen, die unter dem Begriff des Large Offspring Syndromes (LOS) zusammengefasst werden (WRENZYCKI et al. 2005a; Abb. 4). Dazu werden Symptome wie der signifikante
Anstieg des Geburtsgewichtes, Polyhydramnion, Hydrops fetalis, ein verändertes Organwachstum, verschiedene Defekte der Plazenta, des Skeletts und des Immunsystems sowie eine erhöhte perinatale Sterblichkeit gezählt (WALKER et al.
1996; KRUIP u. DEN DAAS 1997; YOUNG et al. 1998; RENARD et al. 1999;
NIEMANN u. WRENZYCKI 2000; SINCLAIR et al. 2000).
Abbildung 4: Hypothese für die Induktion des Large Offspring Syndromes (LOS; WRENZYCKI et al. 2004, modifiziert; oben) und Symptome des LOS: Übergroßes Kalb (unten links), vergrößerte Leber (unten Mitte) und vergrößerte Niere (unten rechts)
Optimal Suboptimal Defizient
In vitro-Produktion und/oder somatischer Kerntransfer
Normale Entwicklung Entwicklungsstillstand
Verändertes Wachstum und gestörte Entwicklung
Herunterregulierung/
Genstilllegung
Hochregulierung/
Induktion der Genexpression
2.4 Epigenetische Prozesse während der frühen Embryonalentwicklung