Die Ergebnisse der transvaginalen Endoskopie beim Rind in der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Methode erfolgreich etabliert wurde und somit ein alternatives Verfahren zu den bestehenden Techniken der Gewinnung früher tubaler Embryonalstadien vorhanden ist.
Der routinemäßige Zugang zum bovinen Eileiter für die in vivo Kultur verwirklicht den Bedarf der Embryoproduktion sowohl für wissenschaftliche als auch für kommerzielle Zwecke. Die Qualität in vivo produzierter Embryonen übertrifft die der in vitro produzierten jeglicher IVP-Systeme. Die Selektion der Embryonen in der künstlichen in vitro Umgebung ist nicht so strikt wie in vivo, so dass einige Embryonen sich trotz schlechter Qualität bis zur Blastozyste entwickeln. Diese Blastozysten minderer Qualität weisen Aberrationen in ihren Genexpressionsmustern auf (GUTIÉRREZ-ADÁN et al. 2004). Viele bedeutende Ereignisse für die weitere Entwicklung des Embryos werden von inadäquaten Kulturbedingungen nachteilig beeinflusst und haben somit einen nachteiligen Einfluss auf die Blastozystenqualität (LONERGAN et al. 2003c). Durch Stress wie zum Beispiel hohe Temperaturen oder freie Sauerstoffradikale kann die Genexpression schon vor der Hauptaktivierung des bovinen Genoms induziert werden (WRENZYCKI et al. 1999; GUTIÉRREZ-ADÁN et al. 2004). Die Unterschiede in der Transkripthäufigkeit basieren wahrscheinlich auf Änderungen in der Degradierung bzw. Re-Akkumulation der jeweiligen mRNA.
Weiterhin resultieren Störungen der Transkription in frühen Entwicklungsstadien meist auch in Änderungen der relativen Transkriptmenge im Blastozystenstadium (LONERGAN et al. 2003b). Bis heute können die in vitro Konditionen die dynamischen Veränderungen des Eileiters und des Uterus nicht nachahmen, und nur die physiologische Umgebung des präimplantatorischen Embryos bietet optimale Konditionen für die Entwicklung zur Blastozyste (BAVISTER 1995). Die nachteiligen Einflüsse der in vitro Konditionen sind auch durch die nachgewiesenen signifikanten Unterschiede in den Expressionsmustern der in dieser Arbeit untersuchten Gene belegt worden.
Durch die verschiedenen Kultivierungsansätze im heterologen ligierten Eileiter (z. B.
Schaf und Kaninchen) oder auch im isolierten Mäuseeileiter in der Organ-Kultur sind
Verbesserungen der Kulturbedingungen möglich (LAWSON et al. 1972; SHARIF et al. 1991; LAZZARI et al. 2002; LONERGAN et al. 2001, 2003a, 2003c). Jedoch kann es dort durch die Ligatur zu Entzündungsreaktionen kommen, welche wiederum einen nachteiligen Einfluss auf die zu kultivierenden Embryonen haben können, da sie nicht dem physiologischen Zustand entsprechen. Somit bietet der endoskopische Zugang zum Eileiter beim Rind einen weiteren Vorteil durch die Möglichkeit der Kultivierung von Embryonen im homologen System.
Die transvaginale Endoskopie beim Rind stellt eine Methode dar, mit deren Hilfe die einzelnen Schritte der frühen präimplantatorischen Embryonalentwicklung und ihre Effekte auf die Embryonen untersucht werden können. Schritt für Schritt können so die gewünschten Stadien gewonnen werden. Dazu sind bereits Untersuchungen durchgeführt worden, wie zum Beispiel die Verwendung der transvaginalen Endoskopie zur temporären in vivo Kultur in vitro produzierter Embryonen und Eizellen (HAVLICEK et al. 2005a, 2005b; WETSCHER et al. 2005a, 2005b).
Weiterführend könnten so auch sNT-Embryonen in den Eileiter transferiert und dort kultiviert werden. Eine weitere denkbare Einsatzmöglichkeit dieser Methode ist die endoskopische Besamung. Hiermit könnte zum Beispiel gesextes Sperma in der unmittelbaren Umgebung der ovulierten Eizelle abgesetzt werden. Dabei wäre der Einsatz einer reduzierten Spermienmenge im Vergleich zur transzervikalen Besamung denkbar, welches einen enormen Vorteil darstellen würde. Bislang wurde von erfolgreichen Besamungen beim Rind mit gesextem Sperma berichtet, wobei zwei Millionen Spermatozoen eingesetzt wurden (SEIDEL et al. 1996; KLINC u.
RATH 2005).
Darüber hinaus kann der Nachweis von Veränderungen im Expressionsmuster entwicklungsrelevanter Gene in den frühen Embryonalstadien des Rindes eine Bedeutung für die Anwendung von assistierten Reproduktionstechnologien in der Humanmedizin haben. Es scheint mittlerweile, dass der Rinderembryo ein besseres Modell für den humanen Embryo darstellt als der Mäuseembryo (MENEZO et al.
2000; NEUBER u POWERS 2000; NIEMANN u. WRENZYCKI 2000). So geben die Aberrationen einen Hinweis darauf, dass Manipulationen des Embryos bereits in den frühen tubalen Stadien, welche beim Menschen übertragen werden, zu
Veränderungen der Genexpression führen, welche nachteilige Einflüsse auf die später geborenen Kinder haben können (HARDY et al. 2002). Weitere Erkenntnisse über die frühembryonale Entwicklung des Rindes und speziell die Einflüsse der in vitro Manipulationen auf die spätere Entwicklung können somit auch zu einer Verbesserung der humanen assistierten Reproduktionstechniken (ART) beitragen.
6 Zusammenfassung
Katharina Isabell Höffmann
Etablierung der transvaginalen Endoskopie zur Gewinnung tubaler Embryonalstadien beim Rind und Vergleich der Expressionsmuster epigenetisch-relevanter Gentranskripte in in vivo und in vitro produzierten präimplantatorischen Rinderembryonen
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die transvaginale Endoskopie beim Rind zur Gewinnung präimplantatorischer tubaler Embryonalstadien etabliert. Es sollte eine minimal-invasive Methode im Vergleich zu den bislang bestehenden Möglichkeiten der Schlachtung oder den chirurgischen Eingriffen zur Verfügung gestellt werden. Hierzu wurden insgesamt 72 Färsen der Rassen Holstein-Friesian und Schwarzbunte endoskopiert. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte der Vergleich der Expressionsmuster fünf entwicklungsrelvanter Gene in in vivo gewonnenen Embryonen mit den gleichen Stadien in vitro produzierter Embryonen. Hierzu wurden drei DNA-Methyltransferasen (DNMT1, 3a und 3b) und zwei Histon-Methyltransferasen (SUV39H1 und G9A), die bei der epigenetischen Reprogrammierung während der frühen Embryonalentwicklung eine bedeutende Rolle spielen, mit Hilfe der semi-quantitativen Endpunkt RT-PCR analysiert. Einflüsse der in vitro Produktion auf die präimplantatorische embryonale Genexpression sollten dargestellt werden. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:
1. Im Vorversuch wurden 38 nicht superovulierte Färsen im Alter zwischen 20 und 22 Monaten endoskopiert und somit die Technik der transvaginalen Endoskopie etabliert. In dieser Zeit wurde auch die Spülkanüle entwickelt und zum Teil verändert.
2. Im Hauptversuch wurde die Endoskopie bei 34 superovulierten Färsen im Alter zwischen 19 und 26 Monaten angewandt. So wurden bei 28 erfolgreichen
Spülungen insgesamt 100 Embryonalstadien von der Zygote bis zum Acht-Zeller gewonnen.
3. Zeitgleich wurden routinemäßig in vitro Embryonen von der Zygote bis zur expandierten Blastozyste produziert (SOF-System) und uterine Embryonalstadien in vivo (10-16-Zeller bis Blastozysten) gewonnen.
4. Es zeigte sich ein statistisch signifikanter Einfluss der Herkunft (in vivo/in vitro) der Embryonen auf die relative Transkripthäufigkeit des DNMT1-, DNMT3a- und SUV39H1-Gens und des Entwicklungsstadiums auf die relative Transkripthäufigkeit des DNMT1-, DNMT3a-, DNMT3b-, SUV39H1- und G9A-Gens.
5. Für das DNMT1-Gen konnte ein signifikanter Unterschied der mRNA-Expression bei den Morulae und Blastozysten der beiden Herkünfte nachgewiesen werden.
In diesen beiden Stadien war die relative Transkriptmenge in den in vivo gewonnenen Embryonen niedriger als in den in vitro produzierten. Im Verlauf der mRNA-Expression zeigten sowohl die in vivo als auch die in vitro produzierten Embryonen jeweils signifikante Unterschiede zwischen den Zygoten bis 4-Zellern (höhere Expression) und den 8-Zell- bis Blastozysten-Stadien (niedrigere Expression).
6. Die relative Transkriptmenge des DNMT3a-Gens unterschied sich signifikant zwischen den beiden verschiedenen Herkünften bei den 10-16-Zellern, Morulae und Blastozysten. Bei den 10-16-Zellern und Blastozysten war der Gehalt in den in vivo gewonnenen Embryonen niedriger als bei den in vitro Embryonen. Bei den Morulae verhielt es sich genau anders herum. Im Verlauf der mRNA-Expression zeigte sich bei den in vivo Embryonen ein signifikanter höherer Transkriptgehalt in den Blastozysten im Vergleich zu den Zygoten, 2-Zellern, 8-Zellern, 10-16-Zellern und Morulae. Bei den in vitro generierten Embryonen unterschieden sich alle untersuchten Stadien signifikant von den Blastozysten. Zusätzlich zu den
Signifikanzen war bei den in vivo Embryonen ein Trend zwischen den 4-Zellern und 10-16-Zellern zu erkennen.
7. Das DNMT3b-Gen zeigte keine signifikanten Unterschiede in der mRNA-Expression zwischen den in vivo und in vitro generierten präimplantatorischen Embryonen. Im Verlauf der mRNA-Expression in vivo war zwischen den Zygoten (höhere Transkriptmenge) und Morulae (niedrigere Transkriptmenge) ein signifikanter Unterschied nachweisbar. Bei den in vitro generierten Embryonen war die Transkriptmenge in den Zygoten und 2-Zellern signifikant höher als in den anderen untersuchten Stadien.
8. Die relative Transkriptmenge des SUV39H1-Gens unterschied sich in den untersuchten Stadien mit Ausnahme der 4-Zeller signifikant in den Embryonen der zwei verschiedenen Herkünfte (in vivo/in vitro). Hierbei lag die Transkriptmenge der in vitro generierten Embryonen immer über der der in vivo Embryonen. Innerhalb der beiden Herkunftsgruppen war kein signifikanter Unterschied nachweisbar.
9. Das G9A-Gen zeigte keinen signifikanten Unterschied in der relativen Transkriptmenge zwischen in vivo und in vitro generierten Embryonen. Im Verlauf der mRNA-Expression in vivo unterschieden sich sowohl die Zygoten als auch die 2-Zeller signifikant von den anderen Stadien. Einzige Ausnahme hiervon war der Vergleich zwischen den 2- und 4-Zellern wo sich aber ein deutlicher Trend in die gleiche Richtung zeigte. Die 4-Zeller bis Blastozysten zeigten eine niedrigere Expression. Ein weiterer Trend war zwischen den hoch exprimierenden Zygoten und den niedriger exprimierenden 2-Zellern zu erkennen. In vitro war die mRNA-Expression in den Zygoten und 2-Zellern signifikant höher als in den folgenden Stadien. Des Weiteren unterschied sich die relative Transkriptmenge in den 4-Zellern signifikant von der in den Morulae. Hier war zusätzlich ein deutlicher Trend für die 8- und 10-16-Zeller sowie die Blastozysten im Vergleich zu den
höher exprimierenden 4-Zellern zu erkennen und auch zwischen den Zygoten und 2-Zellern.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Methode der transvaginalen Endoskopie mit Eileiterspülung beim Rind erfolgreich etabliert wurde, und somit ein alternatives Verfahren zu den bestehenden Techniken der Gewinnung früher Embryonalstadien vorhanden ist.
Die signifikanten Unterschiede in der relativen Transkriptmenge der DNA-Methyltransferasen zwischen in vivo und in vitro generierten Embryonen lassen darauf schließen, dass sowohl der Erhalt als auch die de novo-DNA-Methylierung nach der Aktivierung des embryonalen Genoms von der in vitro Kultur beeinflusst werden. Die signifikanten Unterschiede in der Expression der Histon-Methyltransferasen vor und nach der Aktivierung der embryonalen Genexpression zeigen, dass auch die H3-K9-Methylierung stark von der in vitro Kultur abhängig ist.
Die fünf ausgewählten Gentranskripte wurden beim Rind erstmals in den frühen tubalen präimplantatorischen Embryonalstadien untersucht und hier mit denen in in vitro produzierten Embryonen verglichen. Durch die Etablierung der transvaginalen Endoskopie zur Gewinnung tubaler Embryonalstadien beim Rind ist die Möglichkeit für weitere vergleichende Genexpressionsanalysen gegeben.
7 Summary
Katharina Isabell Höffmann
Establishment of transvaginal endoscopy for the collection of tubal stage bovine embryos and comparison of expression patterns of epigenetic
important gene transcripts in in vivo and in vitro produced preimplantation bovine embryos
In the first part of this work, a transvaginal endoscopy based method was established for the collection of tubal stage bovine embryos. The goal was to have a minimally invasive method as an alternative to other possibilities which include surgical operations. A total of 72 heifers of two different breeds (Holstein-Friesian and Schwarzbunte) were used for endoscopy. In the second part of this work, the expression of five developmentally important genes was compared in in vivo produced embryos with their in vitro counterparts to determine the effects of the culture system on embryonic mRNA expression patterns. Three DNA methyltransferases (DNMT1, 3a and 3b) and two histone methyltransferases (SUV39H1 and G9A) were selected for this purpose. These genes were chosen because they play an important role during epigenetic reprogramming throughout early embryonic development. Messenger RNA expression was analysed by semi-quantitative endpoint RT-PCR. The following results were obtained:
1. In a preliminary experiment, 38 non-superovulated heifers aged 20 to 22 month were chosen for transvaginal endoscopy to establish the technique. During this period the flushing tube was developed and optimized.
2. In the main experiment, 34 superovulated heifers, aged 19 to 26 month, were selected for the endoscopic embryo collection experiments. In this group, a total of 28 successful flushings resulted in 100 embryos ranging in development from zygotes to eight-cell stages.
3. In the same time in vitro embryos from zygote to expanded blasotocyst were produced (SOF system) routinely and uterine in vivo embryos from 10-16-cell stage to blastocyst stage were flushed.
4. The origin of the embryos (in vivo fertilized vs. in vitro fertilized) affected the relative abundance of the DNMT1, DNMT3a and SUV39H1 gene and their developmental stage had a statistically significant influence on the mRNA expression level of all five genes examined: DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, SUV39H1,- and G9A.
5. The relative abundance of DNMT1 transcripts differed significantly between in vivo and in vitro produced morulae and blastocysts. The in vivo stages showed lower relative amounts of transcriptional products than their in vitro counterparts.
In all measurements of mRNA expression significant differences were found between the earlier and later developmental stages, irrespective of origin. Zygote to 4-cell stage embryos had higher expression levels of the gene studied than embryos from the 8-cell stage to the blastocyst stage.
6. For DNMT3a, significant mRNA differences were found between in vivo and in vitro produced 10-16-cell stages, morulae and blastocysts. The in vitro produced 10- to 16-cell embryos and blastocysts showed higher expression levels than did these embryos in vivo. In vivo derived morulae had a significantly higher mRNA expression than the in vitro generated ones. In the temporal expression pattern of the in vivo embryos, a significantly higher expression was seen in blastocysts than in zygotes, 2-cell-, 8-cell-, 10-16-cell embryos and morulae. In all the mRNA expression measurements, the in vitro embryos of all stages differed significantly from the blastocysts. Additionally, the in vivo embryos showed a trend for the 4-cell-stages and 10-16-4-cell-stages.
7. There were no significant differences in DNMT3b expression between in vivo and in vitro derived embryos. Throughout the preimplantation in vivo development,
there was a significant difference in expression of this gene between the zygotes (where it was highly expressed) and the morulae (where it shows a lower expression). The in vitro produced embryos showed a significant increase of DNMT3b expression in zygotes and 2-cell stages than in later stages.
8. The level of SUV39-H1 transcription differed significantly between in vivo and in vitro produced embryos in all stages except the 4-cell stage. The relative amount of transcriptional products was higher in in vitro generated than in in vivo ones.
No significant difference was determined in the temporal mRNA expression of the SUV39H1 gene.
9. There was no significant difference in G9A mRNA expression between embryos of different origin. However, throughout in vivo embryo development, the zygotes and 2-cell stages had significantly higher expression levels than those from the 4-cell to the blastocyst stage. Zygotes expressed significantly more G9A mRNA than the 2-cell stage embryos. In the temporal mRNA expression pattern of in vitro produced embryos, zygotes and 2-cell stages showed significantly higher expression levels than later stages. Furthermore the relative amount of G9A transcripts in 4-cell stages differed significantly from that of morulae. An additional trend was seen for the 8- and 10-16-cell-stages as well as blastocysts and the higher expressing 4-cell stages, and also between the zygotes and 2-cell stages.
In conclusion, these results indicate that bovine transvaginal endoscopy was successfully established and that it is a practical alternative to the already existing techniques to obtain early embryonic stages.
The significant differences in the relative amount of transcriptional products of the DNA methyltransferases between in vivo and in vitro generated embryos suggest that maintenance and de novo DNA methylation is affected by in vitro culture after the activation of the embryonic genome. The significant differences in the expression of the histone methyltransferases before and after the activation of the embryonic
gene expression suggest that H3-K9 methylation is affected by the in vitro culture early in development.
For the first time the mRNA expression patterns of these five genes has been analysed in bovine tubal preimplantation embryo stages and has been compared with those of their in vitro counterparts. Having established transvaginal endoscopy for the collection of tubal stage bovine embryos, the possibility exists for further investigations of gene expression in preimplantation embryos as they develop naturally in vivo.
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