A Adenin
Abb. Abbildung
ADP Adenosindiphosphat AK Antikörper
ANOVA Analysis Of Variance
ART Assistierte Reproduktionstechniken
AS Angelman Syndrom
ATR-X Alpha Thalassemia/Mental Retardation Syndrome, X-linked
bp Basenpaare
BSA Bovines Serumalbumin
BWS Beckwith-Wiedemann Syndrom bzw. beziehungsweise
cDNA komplementär-DNA
C Cytosin
ca. cirka
CO2 Kohlenstoffdioxid
CpG Cytosin-phosphatidyl-Guanin; Cytosin und Guanin-reiche Region
D Tag
deg. degeneriert
DMR/DMRs Differentially Methylated Region(s) DMSO Dimethyl Sulfoxide
DNA Desoxyribonucleotide Acid dNTPs Desoxyribonucleosidtriphosphat (dT)25 Dynabeads oligo
EA Embryonenäquivalent
eCG equines Choriongonadotropin et al. et alii
EtBr Ethidiumbromid
Fa. Firma
FAL Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft
fg Femtogramm
G Guanin
H3/H4 Histon3/Histon4
hCG humanes Choriongonadotropin HECM Hamster Embryo Culture Medium HMTase Histon-Methyltransferase
I.E./U Internationale Einheiten/Unit
ICF Immunodeficiency, Centromere instability and Facial abnomalies ICM Inner Cell Mass
IETS International Embryo Transfer Society IVC In Vitro Kultur (in vitro culture)
IVF In Vitro Fertilisation (in vitro fertilization) IVM In Vitro Maturation (in vitro maturation) IVP In Vitro Produktion (in vitro production) K4/K9 Lysin
KOK/KOKs Kumulus-Oozyten Komplex/e Komp. kompaktierte
LOS Large Offspring Syndrome MII Metaphase II
m5C 5-Methylcytosin
MET Materno-Embryonale Transition
MM Master-Mix
mRNA messenger RNA N2 Stickstoff
NBCS Newborn Calf Serum O2 Sauerstoff
OPU Ovum Pick-Up
P Probability (Irrtumswahrscheinlichkeit) PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase Kettenreaktion
PG Prostaglandin PVA Polivinylalkohol RB Retinoblastom RNA Ribonucleotide Acid RT Reverse Transkription
S Seite
SET Suppressor of Variegation, Enhancer of Zeste, and Trithorax sNT Somatic Nuclear Transfer
SO Superovulation
SOF Synthetic Oviduct Fluid sog. so genannte/r
T Thymin
Tab. Tabelle
Taq Termophilus aquaticus TCM Tissue Culture Medium
TE Trophektoderm
u. und
u. a. unter anderem
UFO(s) Unfertilized Oozyte(s) UV Ultraviolett
vs. versus
Xi inaktiviertes X-Chromosom z. B. zum Beispiel
z. T. zum Teil
11 Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen
Tabellen
Tabelle 1: Ergebnisse der Eileiterspülungen bei lebenden Tieren ...9 Tabelle 2: Durch Uterusspülungen gewonnene bovine in vivo
Embryonen 2003 (THIBIER 2004)...11 Tabelle 3: Nachgewiesene Genexpressionsmuster
(mRNA-Expression) während des bovinen Oozytenwachstums, der Oozyten-Maturation und der präimplantatorischen
Embryonalentwicklung...15 Tabelle 4: Zusammensetzung des Reaktionsgemisches für die
Reverse Transkription ...55 Tabelle 5: Zusammensetzung des Reaktionsgemisches für die
Polymerase Kettenreaktion...56 Tabelle 6: Übersicht über die verwendeten Primer ...57 Tabelle 7: PCR-Programme für die Amplifikation spezifischer
Gentranskripte ...58 Tabelle 8: Zusammensetzung der verwendeten Reifungs- und
Kulturmedien ...120 Tabelle 9: PBS-Zusammensetzung...121 Tabelle 10: Übersicht über die einzelnen endoskopischen
Spülergebnisse ...123
Abbildungen
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Ovulation, Befruchtung
und Furchung beim Säuger (SCHNORR 1996) ...5 Abbildung 2: Uterus und Eileiter des Rindes, Seitenansicht
(SCHUMMER u. VOLLMERHAUS 1995)...6
Abbildung 3: Schematische Darstellung der in vitro Produktion
(NIEMANN u. MEINECKE 1993b, modifiziert)...12 Abbildung 4: Hypothese für die Induktion des Large Offspring
Syndromes (LOS; WRENZYCKI et al. 2004, modifiziert;
oben) und Symptome des LOS: Übergroßes Kalb (unten links), vergrößerte Leber (unten Mitte) und vergrößerte Niere (unten rechts) ...20 Abbildung 5: Zeitlicher Verlauf der DNA-Methylierung bei der Maus
(DEAN et al. 2005, modifiziert) ...24 Abbildung 6: Die drei DNMT-Familien der Säugetiere (MARGOT et al.
2003)...26 Abbildung 7: Geschlechts-spezifische Exons und mRNAs von
DNMT1 (BESTOR 2000) ...28 Abbildung 8: Die vier Varianten der humanen DNA-Methyltransferase
3b (ROBERTSON et al. 1999) ...31 Abbildung 9: Überblick über einen Teil der Histon-Schwänze und
mögliche Modifikationen (PETERSON u. LANIEL 2004)...33 Abbildung 10: Molekulare Struktur von mono-, di-, und
tri-Methyl-Lysin (ZHANG u. REINBERG 2001) ...34 Abbildung 11: Modell der heterochromatischen Erhaltung durch den
SUV39H1/HP1-Komplex (BANNISTER et al. 2001,
modifiziert)...36 Abbildung 12: Humanes G9a und murines Suv39h1 (TACHIBANA et al.
2001)...37 Abbildung 13a-d: Instrumente zur transvaginalen Endoskopie beim Rind ...42 Abbildung 14: Spülsystem-Pumpe (links) und Uterusspülkatheter mit
aufgeblasenem Ballon (rechts)...42 Abbildung 15: Innenschaft mit Endoskop (unten) und Spülkanüle
(oben)...44
Abbildung 16: Spülkanüle mit aufgesetztem Kunststoffschlauch (oben) und Innenschaft mit Endoskop und
Kunststoffschlauch (unten) ...45 Abbildung 17: Schematische Darstellung der transvaginalen
Endoskopie...46 Abbildung 18: Bilder der transvaginalen Endoskopie...47 Abbildung 19: Schematische Darstellung der Behandlung der Tiere für
die Eileiterspülung...48 Abbildung 20: Längsschnitt durch ein Gebärmutterhorn mit
inseriertem Uterusspülkatheter ...49 Abbildung 21: Verschiedene Entwicklungsstadien in vivo und in vitro ...53 Abbildung 22: Überblick über die Versuchsanordnung...61 Abbildung 23: Prozentuale Verteilung der verschiedenen Stadien auf
die einzelnen Tage ...63 Abbildung 24: Repräsentative Gelbanden der semi-quantitativen
RT-PCR der DNMT1-Expression von in vivo und in vitro
generierten präimplantatorischen Rinderembryonen ...65 Abbildung 25: Relative Transkriptmenge von DNMT1 in in vivo und in
vitro generierten präimplantatorischen
Rinderembryonen...65 Abbildung 26: Verlauf der mRNA-Expression von DNMT1 in
prä-implantatorischen Embryonalstadien in vivo (a:b
P≤ 0.05) ...66 Abbildung 27: Verlauf der mRNA-Expression von DNMT1 in
prä-implantatorischen Embryonalstadien in vitro ...66 Abbildung 28: Repräsentative Gelbanden der semi-quantitativen
RT-PCR der DNMT3a-Expression von in vivo und in vitro
generierten präimplantatorischen Rinderembryonen ...67 Abbildung 29: Relative Transkriptmenge von DNMT3a in in vivo und in
vitro generierten präimplantatorischen
Rinderembryonen...67
Abbildung 30: Verlauf der mRNA-Expression von DNMT3a in
prä-implantatorischen Embryonalstadien in vivo...68 Abbildung 31: Verlauf der mRNA-Expression von DNMT3a in
prä-implantatorischen Embryonalstadien in vitro ...68 Abbildung 32: Repräsentative Gelbanden der semi-quantitativen
RT-PCR der DNMT3b-Expression von in vivo und in vitro
generierten präimplantatorischen Rinderembryonen ...69 Abbildung 33: Relative Transkriptmenge von DNMT3b in in vivo und in
vitro generierten präimplantatorischen
Rinderembryonen ...69 Abbildung 34: Verlauf der mRNA-Expression von DNMT3b in
prä-implantatorischen Embryonalstadien in vivo...70 Abbildung 35: Verlauf der mRNA-Expression von DNMT3b in
prä-implantatorischen Embryonalstadien in vitro ...70 Abbildung 36: Repräsentative Gelbanden der semi-quantitativen
RT-PCR der SUV39H1-Expression von in vivo und in vitro
generierten präimplantatorischen Rinderembryonen ...71 Abbildung 37: Relative Transkriptmenge von SUV39H1 in in vivo und
in vitro generierten präimplantatorischen
Rinderembryonen...71 Abbildung 38: Verlauf der mRNA-Expression von SUV39H1 in
prä-implantatorischen Embryonalstadien in vivo...72 Abbildung 39: Verlauf der mRNA-Expression von SUV39H1 in
prä-implantatorischen Embryonalstadien in vitro ...72 Abbildung 40: Repräsentative Gelbanden der semi-quantitativen
RT-PCR der G9A-Expression von in vivo und in vitro
generierten präimplantatorischen Rinderembryonen ...73 Abbildung 41: Relative Transkriptmenge von G9A in in vivo und in
vitro generierten präimplantatorischen
Embryonalstadien...73
Abbildung 42: Verlauf der mRNA-Expression von G9A in
präimplantatorischen Embryonalstadien in vivo ...74 Abbildung 43: Verlauf der mRNA-Expression von G9A in
präimplantatorischen Embryonalstadien in vitro...74
Auszüge aus der Arbeit wurden bereits der Öffentlichkeit vorgestellt:
32. Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft Embryotransfer deutschsprachiger Länder (AET-d) am 30. Juni / 01. Juli 2005 in Neumünster:
„Etablierung der transvaginalen Endoskopie zur Gewinnung früher Embryonalstadien beim Rind“
Vortragstagung der Deutschen Gesellschaft für Züchtungskunde e. V. (DGfZ) und der Gesellschaft für Tierzuchtwissenschaft (GfT) am 21./22. September 2005 in Berlin:
„Unterschiede im Expressionsmuster epigenetisch-relevanter Gene in in vivo und in vitro generierten präimplantatorischen Rinderembryonen“
Danksagung
• Mein erster Dank gilt Frau PD Dr. Christine Wrenzycki für die Überlassung des Themas und die große Hilfsbereitschaft bei der Durchführung und Fertigstellung der Arbeit. Danke für die schnellen Korrekturen bis zur letzten Minute und das offene Ohr in allen Situationen.
• Dem Leiter des Instituts für Tierzucht der FAL in Mariensee, Herrn Prof. Dr. sc. agr. Dr.
habil. Dr. h. c. F. Ellendorf danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes.
• Herrn Prof. Dr. H. Niemann danke ich für die stete Diskussionsbereitschaft und Hilfe.
• Prof. Dr. U. Besenfelder und Dr. V. Havlicek danke ich für die geduldige Einweisung in die Technik der transvaginalen Endoskopie und die stete Bereitschaft weitere Fragen zu beantworten.
• Des Weiteren möchte ich mich bei Prof. Dr. K. Schellander und M. Gilles samt Team, insbesondere Franka und Heike, für die freundliche Aufnahme in Frankenforst bedanken.
• Ein großes Dankeschön an Klaus-Gerd Hadeler für die Hilfe bei der Durchführung der Endoskopie und die Gewinnung der uterinen Embryonalstadien.
• Grit Möller, Rolf Poppenga und Hans-Georg Sander danke ich für die Hilfe mit dem
„lieben Vieh“ und die nette Gesellschaft im Stall. Des Weiteren danke ich Gunnar Scharnhorst und Team für die Versorgung der Tiere in Mecklenhorst.
• Karin Korsawe ein herzliches Dankeschön für die Einarbeitung in die IVF Technik und die Mithilfe bei der Erstellung der Embryonen.
• Dr. A. Lucas-Hahn und Erika Lemme danke ich für die Tipps und Hilfe bei der Embryonenbeurteilung.
• Für die guten Ratschläge bei der Durchführung der PCR danke ich Doris Herrmann und für die Überlistung des Computers sowie die Korrektur des Summary Ph. D. Joe Carnwath.
• Den vielen fleißigen Helfern im Labor, insbesondere Lisa, Manon und Steph danke ich für die lustige Zeit.
• Für die unermüdliche Lieferung der Ovarien danke ich Fritz Rump, Dieter Diskau und Lothar Schindler sowie der Belegschaft der Schlachthöfe in Lübbecke und Minden für das Sammeln der Rinderovarien.
• Ein Riesendank geht an Dieter Bunke für die Mühe bei der Erstellung der Photos und an Christine Weidemann für die Verschönerung der Formatierung der Gesamtarbeit.
• Ich danke meinen Mitdoktoranden für die vielen Gespräche und Anregungen während dieser Zeit. Insbesondere Claudia, Daggi und Heide. Darüber hinaus danke ich Björn für die guten Ratschläge und Aufmunterungen.
• Nadine und Karsten danke ich für die Rettung des Material und Methoden Teils aus dem Computer-Nirvana, die Erstellung der Endoskopiebilder und die jederzeit gewährte Hilfe.
• Ich danke Monika und Simona für die viele Hilfe sowohl im Stall als auch im Labor und die Unterstützung in der letzten heißen Phase.
• Für das nette Beisammensein und das Ertragen auch im „Ausnahmezustand“ sowie die Durchsicht der Arbeit danke ich Änne und Claudia.
• Ich danke der Gesellschaft der Freunde der FAL für die Unterstützung.
• Ganz besonders herzlich danke ich meiner Familie für all die Unterstützung, viel Verständnis und Geduld!