DNMT3b

Abbildung 32 zeigt beispielhaft einen gelelektrophoretischen Nachweis zur Darstellung der DNMT3b-Transkripte in den verschiedenen Stadien. Hierbei zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den jeweils gleichen Stadien unterschiedlicher Herkunft (Abb. 33).

Abbildung 32: Repräsentative Gelbanden der semi-quantitativen RT-PCR der DNMT3b-Expression von in vivo und in vitro generierten präimplantatorischen Rinderembryonen

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50

1

Relative Transkriptmenge

In vivo In vitro

2-Zeller

Zygoten 4-Zeller 8-Zeller 10-16-Zeller Morulae Blastozysten

Abbildung 33: Relative Transkriptmenge von DNMT3b in in vivo und in vitro generierten präimplantatorischen Rinderembryonen

Der zeitliche Verlauf der mRNA-Expression von DNMT3b in den in vivo gewonnenen Rinderembryonen war signifikant unterschiedlich (Abb. 34). Ein Trend zeichnete sich Zygoten 2-Zeller 4-Zeller 8-Zeller 10-16-Zeller Morulae Blastozysten

vivo vitro vivo vitro vivo vitro vivo vitro vivo vitro vivo vitro vivo vitro

zwischen Zygoten und 16-Zellern (P≤ 0,057), Zygoten und Blastozysten (P≤ 0,084) und Zygoten und 8-Zellern (P≤ 0,090) ab.

ab b

Zygoten 2-Zeller 4-Zeller 8-Zeller 10-16-Zeller Morulae Blastozysten

Relative Transkriptmenge

Abbildung 34: Verlauf der mRNA-Expression von DNMT3b in prä-implantatorischen Embryonalstadien in vivo (a:b P≤ 0.05)

Die signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen in vitro generierten Embryonalstadien sind in Abbildung 35 aufgezeigt.

b

Zygoten 2-Zeller 4-Zeller 8-Zeller 10-16-Zeller Morulae Blastozysten

Relative Transkriptmenge

Abbildung 35: Verlauf der mRNA-Expression von DNMT3b in prä-implantatorischen Embryonalstadien in vitro (a:b P≤ 0.05)

4.4.4 SUV39H1

Die relativen Transkriptgehalte von SUV39H1 unterschieden sich in mehreren Stadien der zwei verschiedenen Herkünfte (Abb. 36) signifikant (P≤ 0,05) voneinander. So zeigten sich sowohl signifikante Unterschiede zwischen den Zygoten in vivo und in vitro (0,3±0,08 vs. 0,55±0,04) als auch bei den 2-Zellern in vivo und in vitro (0,35±0,06 vs. 0,53±0,05) und den 8-Zellern (in vivo/in vitro;

0,05±0,01 vs. 0,24±0,05). Ebenfalls unterschieden sich die in vivo gewonnenen 10-16-Zeller signifikant von den in vitro generierten (0,07±0,03 vs. 0,19±0,03). Das traf auch auf die in vivo und in vitro generierten Blastozysten zu (0,34±0,12 vs.

0,74±0,14; Abb. 37).

Abbildung 36: Repräsentative Gelbanden der semi-quantitativen RT-PCR der SUV39H1-Expression von in vivo und in vitro generierten

Zygoten 4-Zeller 8-Zeller 10-16-Zeller Morulae Blastozysten

Relative Transkriptmenge

In vivo In vitro

Abbildung 37: Relative Transkriptmenge von SUV39H1 in in vivo und in vitro generierten präimplantatorischen Rinderembryonen (a:b P≤ 0.05) Zygoten 2-Zeller 4-Zeller 8-Zeller 10-16-Zeller Morulae Blastozysten

vivo vitro vivo vitro vivo vitro vivo vitro vivo vitro vivo vitro vivo vitro

Der zeitliche Verlauf der mRNA-Expression in vivo (Abb. 38) und in vitro (Abb. 39) variierte nicht signifikant.

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00

Zygoten 2-Zeller 4-Zeller 8-Zeller 10-16-Zeller Morulae Blastozysten

Relative Transkriptmenge

Abbildung 38: Verlauf der mRNA-Expression von SUV39H1 in prä-implantatorischen Embryonalstadien in vivo

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00

Zygoten 2-Zeller 4-Zeller 8-Zeller 10-16-Zeller Morulae Blastozysten

Relative Transkriptmenge

Abbildung 39: Verlauf der mRNA-Expression von SUV39H1 in prä-implantatorischen Embryonalstadien in vitro

4.4.5 G9A

Die relative Menge der Gentranskripte von G9A in den Stadien von der Zygote bis zur expandierten Blastozyste (Abb. 40) war in vivo und in vitro nicht signifikant unterschiedlich (Abb. 41).

Abbildung 40: Repräsentative Gelbanden der semi-quantitativen RT-PCR der G9A-Expression von in vivo und in vitro generierten präimplantatorischen Rinderembryonen

2-Zeller

Zygoten 4-Zeller 8-Zeller 10-16-Zeller Morulae Blastozysten

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00

Relative Transkriptmenge

In vivo In vitro

Abbildung 41: Relative Transkriptmenge von G9A in in vivo und in vitro generierten präimplantatorischen Embryonalstadien

Der zeitliche Verlauf der G9A-mRNA-Expression war sowohl in in vivo gewonnenen (Abb. 42) als auch in in vitro generierten Embryonen (Abb. 43) signifikant verschieden.

Zygoten 2-Zeller 4-Zeller 8-Zeller 10-16-Zeller Morulae Blastozysten

vivo vitro vivo vitro vivo vitro vivo vitro vivo vitro vivo vitro vivo vitro

c c

Zygoten 2-Zeller 4-Zeller 8-Zeller 10-16-Zeller Morulae Blastozysten

Relative Transkriptmenge

Abbildung 42: Verlauf der mRNA-Expression von G9A in präimplantatorischen Embryonalstadien in vivo (a:b:c P≤ 0.05)

b bc

Zygoten 2-Zeller 4-Zeller 8-Zeller 10-16-Zeller Morulae Blastozysten

Relative Transkriptmenge

Abbildung 43: Verlauf der mRNA-Expression von G9A in präimplantatorischen Embryonalstadien in vitro (a:b:c P≤ 0.05)

Zusätzlich zu den ermittelten Signifikanzen waren bei den in vivo Embryonen noch folgende Trends zu ermitteln: Zygoten/2-Zeller (P≤ 0,075) und 2-Zeller/4-Zeller (P≤ 0,056). Bei den in vitro generierten Embryonen zeigte sich ein Trend im

Vergleich der Zygoten mit den 2-Zellern (P≤ 0,080), 4-Zeller mit 8-Zellern (P≤ 0,080), 4-Zeller mit Blastozysten (P≤ 0,093) und zwischen den 4- und 10-16-Zellern (P≤ 0,064).

5 Diskussion

Bislang sind vergleichende Studien zur mRNA-Expression zwischen in vivo und in vitro produzierten Embryonen vor allem bei späteren Entwicklungsstadien wie Morulae und Blastozysten durchgeführt worden, da tubale Embryonalstadien nur sehr aufwendig gewonnen werden konnten. Die in vivo gewonnen Stadien dienen als sog. „Goldener Standard“ im Vergleich mit in vitro erstellten Embryonen (nach IVP und/oder sNT). Auch im heterologen Eileiter (Schaf, Kaninchen) kultivierte Rinderembryonen sind den komplett in vivo generierten Embryonen bezüglich ihrer Genexpression nicht gleich zu setzen, da nur die physiologische Umgebung des präimplantatorischen Embryos optimale Konditionen für seine weitere Entwicklung bietet (BAVISTER 1995; LAZZARI et al. 2002; LONERGAN et al. 2003c;

WRENZYCKI et al. 2005). Ein möglicher nachteiliger Einfluss auf in vivo gewonnene Embryonen wäre höchstens durch die vorangegangene Superovulation des Spendertieres vorstellbar. So wurde für die Maus und den Hamster bewiesen, dass durch Superovulation erzeugte Embryonen eine gestörte Entwicklung aufweisen können (ERTZEID u. STORENG 2001).

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die transvaginale Endoskopie beim Rind zur Gewinnung präimplantatorischer tubaler Embryonalstadien etabliert. Im zweiten Teil erfolgte die Darstellung der mRNA-Expressionsmuster fünf ausgewählter Gene in in vivo und in vitro gewonnenen Embryonen mittels eines semi-quantitativen RT-PCR-Assays. Alle in vivo und in vitro Entwicklungsstadien von der Zygote bis zur expandierten Blastozyste wurden vergleichend untersucht. Die DNA- und Histon-Methyltransferasen wurden ausgewählt, da sie bei der epigenetischen Reprogrammierung des Genoms während der frühen Embryonalentwicklung eine bedeutende Rolle spielen (WRENZYCKI u.

NIEMANN 2003).