Um neue Wege zum Verständnis der embryo-maternalen Kommunikation aufzeigen zu können, ist es unumgänglich, die In-vitro-Methoden mit den physiologischen Ab-läufen bereits im Eileiter zu kombinieren. Neueste Arbeiten konzentrieren sich auf eine optimierte Embryogewinnung, die eine maximale Entwicklungsdauer im Rind (In-vivo-Kultur) mit den Vorteilen der In-vitro-Produktion kombinieren (HAVLICEK et al. 2010)
Die derzeitig gebräuchlichen In-vitro-Systeme beim Rind könnten dauerhafte Ände-rungen in den Genexpressionsmustern während der embryonalen und fetalen Ent-wicklung bedingen (WRENZYCKI et al. 2004), was zu einer verringerten Qualität der Embryonen führen und sogar die Überlebensfähigkeit der Nachkommen nach einem Transfer beeinflussen kann (WRENZYCKI et al. 2007).
Es ist möglich, dass epigenetische Modulationen in der IVP während der präimplantatorischen Embryonalentwicklung kausale Mechanismen sind, die am Auftreten des LOS beim Rind beteiligt sind (WILMUT et al. 2002; HIENDLEDER et al. 2006; FARIN et al. 2006). Daher ist die Analyse der mRNA-Gehalte von Genen, die für die embryonale Entwicklung wichtig sind, ein nützliches Werkzeug, um die
„Normalität“ der Embryonen zu messen (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000). Die ge-naue Analyse dieser entwicklungsrelevanten Gene könnte dazu beitragen, dass fun-dierte Klassifikationskriterien für die Selektion bezüglich einer guten Entwicklungs-kompetenz gefunden werden (COTICCHIO et al. 2004; PATEL et al. 2007).
Die Ergebnisse dieser Arbeit haben verdeutlicht, dass alle untersuchten mRNA-Expressionsprofile der Embryonen der temporären Eileiterkultur denen des „golde-nen Standards“, also de„golde-nen der In-vivo-Embryo„golde-nen, gleichen.
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Die Aufdeckung von Unterschieden im mRNA-Expressionsprofil zwischen in vivo und in vitro produzierten oder geklonten Embryonen ist ein wesentlicher Schlüssel für Optimierung der In-vitro-Systeme und zur Minimierung des Auftretens von Entwick-lungsstörungen.
Ein kritischer Punkt der IVP scheint die Supplementierung der Kulturmedien zu sein.
Bovines Serumalbumin und Serum werden am häufigsten als Medienzusätze ver-wendet, sind aber umstritten, da sie neben Hormonen und Wachstumsfaktoren eine Reihe weiterer unbekannter Komponenten enthalten können. Dies macht den Ver-gleich von Experimenten untereinander schwierig. Es ist also von großem Interesse, klar definierte Medien zu entwickeln, die auf synthetischen Makromolekülen basieren (WARZYCH et al. 2007).
NIEMANN et al. (2002) hat zusammenfassend beschrieben, dass all die auftretenden Abnormalitäten und Aberrationen nichts anderes sind als eine Stressantwort des Embryos auf ungenügende Kulturbedingungen.
Die fünf ausgewählten Gentranskripte wurden beim Rind erstmals vergleichend zwi-schen den Embryonen der drei Herkünfte untersucht. Die signifikanten Unterschiede in der relativen Transkriptmenge der DNA-Methyltransferasen zwischen in vivo und in vitro generierten Embryonen und Embryonen aus der temporären Eileiterkultur lassen darauf schließen, dass sowohl der Erhalt als auch die De-novo-DNA-Methylierung von der In-vitro-Kultur beeinflusst werden. Die ebenfalls signifikanten Unterschiede in der relativen Transkriptmenge für die Histonmethyltransferase zei-gen, dass auch die H3-K9-Methylierung stark von den In-vitro-Kulturbedingungen abhängig ist. Auch die Unterschiede in der relativen Transkriptmenge der Glukosetransporter, deren Produkte am embryonalen Metabolismus beteiligt sind (SLC2A3 und SLC2A8), werden durch die In-vitro-Kultur beeinflusst.
Die In-vitro-Techniken haben sich zum Teil als eigenständige Verfahren entwickelt und müssten daher mehr an den physiologischen Abläufen, zum Beispiel an denen im Eileiter und Uterus, bemessen werden. Insgesamt erscheint eine embryonale Entwicklung im Eileiter von Vorteil zu sein.
6 Zusammenfassung
Karsten Müller
Auswirkung einer temporären In-vivo-Kultur in vitro produzierter Rinderemb-ryonen im bovinen Eileiter auf das mRNA-Expressionsmuster
entwicklungsre-levanter Gene
Im ersten Teil des Versuches wurden durch transvaginale Endoskopie in vitro erstell-te Embryonen (Zygoerstell-ten Stadium) in den Eileierstell-ter des Rindes zur 7-8 tägigen In-vivo-Kultur transferiert. Es sollte eine minimal-invasive, reproduzierbare Methode im Ver-gleich zu den bislang bestehenden Möglichkeiten von chirurgischen Eingriffen oder Organkulturen im unligierten, homologen Eileiter des Rindes etabliert werden. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte der Vergleich der Expressionsmuster fünf entwick-lungsrelevanter Gene in den Embryonen der verschiedenen Herkünfte. Zwei DNA-Methyltransferasen (DNMT1 und DNMT3a), die Histon-Methyltransferase SUV39H1, sowie die Glukosetransporter SLC2A3 und SLC2A8 wurden ausgewählt und analy-siert. Die Einflüsse der In-vitro-Produktion auf die präimplantatorische embryonale Genexpression sollten dargestellt werden, wobei die Expressionsmuster der In-vivo-Embryonen als physiologischer Standard dienten. Folgende Ergebnisse wurden er-zielt:
1. Im Vorversuch wurden 25 Färsen endoskopiert und somit die Technik der trans-vaginalen Endoskopie erlernt. In dieser Zeit wurde auch die Transferkapillare entwickelt und modifiziert.
2. Im Hauptversuch wurde der endoskopische Eileitertransfer bei 22 zyklussyn-chronen Rindern im Alter zwischen 13 - 25 Monaten durchgeführt. 640 in vitro erzeugte Zygoten sind in die Ovidukte der Empfängertiere übertragen worden.
Insgesamt lag die Wiederfindungsrate bei 59,5%. Die einzelnen Wiederfindungs-raten schwankten zwischen 0 und100%. Die durchschnittliche Entwicklungsrate zur Blastozyste/Morula lag bei 19,4%. In den 22 transvaginal-endoskopisch ge-leitetem Embryonentransfers wurden im Schnitt 29,1 IVF-Zygoten übertragen,
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davon konnten durchschnittlich 17,3 Stadien zurückgewonnen werden von de-nen sich 3,4 bis zur Morula oder Blastozyste entwickelt hatten.
3. Zeitgleich wurden routinemäßig In-vitro-Embryonen (Morulae/Blastozysten) pro-duziert und uterine Embryonalstadien in vivo durch Uterusspülungen gewonnen.
4. Es zeigte sich ein statistisch signifikanter Einfluss der Herkunft der Embryonen auf die relative Transkripthäufigkeit der zu untersuchenden Gene. Für die relati-ve Transkriptmenge des DNMT1-Gen konnte ein signifikanter Unterschied zwi-schen In-vivo- und In-vitro-Embryonen nachgewiesen werden. Ebenfalls fielen signifikante Unterschiede im Expressionsmuster von DNMT1 zwischen den Embryonen aus der temporären Eileiterkultur und den in vitro erzeugten Gegen-stücken auf. In den In-vivo- und Eileiterkulturembryonen war die relative Transkriptmenge für dieses Gen niedriger als in den in vitro produzierten. Zwi-schen in vivo gewonnenen Embryonen und In-vivo-Kulturembryonen fielen keine signifikanten Unterschiede auf.
5. Bei der relativen Transkriptmenge der DNMT3a-mRNA fielen signifikante Unter-schiede im Expressionsmuster zwischen in vivo und in vitro produzierten Emb-ryonen auf. Ebenso signifikant waren die Unterschiede bei der m-RNA Expres-sion der Morulae/Blastozysten aus der temporären Eileiterkultur im Vergleich zu den in vitro generierten. Bei den Blastozysten war der Gehalt in den in vivo ge-wonnenen und Eileiterkultur Embryonen niedriger als bei den In-vitro-Blastozysten, bei Morulae verhielt es sich genau anders herum. Zwischen in vi-vo gewonnenen Embryonen und In-vivi-vo-Kulturembryonen fielen keine signifikan-ten Unterschiede auf.
6. Die relativen Transkriptgehalte von SUV39H1 unterschieden in den Stadien der drei Herkünfte signifikant voneinander. So zeigten sich sowohl signifikante Un-terschiede zwischen in vivo und in vitro generierten Embryonen, als auch zwi-schen Embryonen aus temporärer Eileiterkultur und in vitro generierten
Embryo-nen. Die relativen Mengen der Gentranskripte von SUV39H1 in den Morulae und Blastozysten aus temporärer Eileiterkultur und in vivo waren ähnlich. Die Transkriptmenge der in vitro generierten Embryonen lag deutlich über denen der In-vivo- und Eileiterkulturembryonen.
7. Für die relative Menge der Gentranskripte von SLC2A3 und SLC2A8 konnten signifikante Unterschiede in in vivo und in vitro erzeugten Embryonen festgestellt werden. Ebenso signifikant unterschieden sich die Embryonen der temporären Eileiterkultur von den in vitro generierten Stadien. Morulae und Blastozysten aus temporärer Eileiterkultur und in vivo unterschieden sich nicht signifikant in der Menge der exprimierten Transkripte. Auch bei diesen Genen lag die Transkriptmenge deutlich höher bei In-vitro-Embryonen im Vergleich zu den Embryonen der anderen beiden Herkünfte.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass mit Hilfe der transvaginalen Endoskopie eine Eileiterkultur beim Rind minimal-invasiv möglich ist und somit ein alternatives Verfahren zu bestehenden Techniken darstellt. Die signifikanten Unterschiede in der relativen Transkriptmenge der DNA-Methyltransferasen zwischen in vitro generierten Embryonen und den Embryonen der anderen beiden Herkünfte lassen darauf schlie-ßen, dass sowohl die Erhalt- als auch die De-novo-DNA-Methylierung von der In-vitro- Kultur beeinflusst werden. Die signifikanten Unterschiede in der Expression der Histon-Methyltransferase zeigen, dass auch die H3-K9-Methylierung von der Kultur-umgebung beeinflusst wird. Ebenso scheint die In-vitro-Kultur Embryonen im Meta-bolismus zu beeinflussen, denn auch bei den Transkriptmengen für die Glucosetransporter SLC2A3 und SLC2A8 gab es signifikante Unterschiede in den Expressionsmustern der verschiedenen Herkünfte. Alle untersuchten Gentranskripte zeigten ähnliche Expressionsmuster bei Embryonen aus Eileiterkultur und in vivo gewonnenen Embryonen.
105 7 Summary
Karsten Müller
Effect of a temporary in vivo culture in the bovine oviduct of in vitro produced bovine embryos on the mRNA expression of developmentally important gene
transcripts
The present study was designed to adopt a minimally invasive method to culture in vitro produced bovine embryos in bovine fallopian tubes. Bovine in vitro produced embryos (zygote stage) were transferred into the bovine oviduct via transvaginal en-doscopy for a culture period of 7-8 days. In the following these embryos were re-trieved by flushing and the mRNA expression of five developmentally important gene transcripts DNMT1, DNMT3A, SLC2A3, SLC2A8 and SUV39H1 was analysed by RTqPCR. Additionally, embryos that were completely in vitro generated and in vivo derived embryos were analysed by RT-qPCR. The following results could be ob-tained:
1. In preliminary tests, 25 Holstein Frisian heifers were endoscoped to adopt the technique. During these tests the capillary used for transfer was designed and modi-fied.
2. In the main experiments 640 zygotes were transferred into the fallopian tubes of 22 synchronised heifers aged 13-25 months. Recovery rates lay at 59.9% altogether, individually ranging from 0 to 100%. The average developmental rate of transferred zygotes to the morula/blastocyst stage was 19.4%. On average 29.1 in vitro pro-duced zygotes were transferred during each transfer session (n=22) of which 17.3%
embryos of differing stages could be recovered. Of these 3.4 had developed to the stage of a morula/blastocyst.
3. Embryos were also generated in vitro (SOF) and in vivo.
4. The following results could be obtained after the analysis of the expression of de-velopmentally important gene transcripts
- The expression of DNMT1, SLC2A3, SLC2A8 and SUV39H1 transcripts was sig-nificantly upregulated in those embryos (morulae/blastocysts) derived from the IVP-system compared to those generated in vivo. No differences could be seen for those embryos derived from the temporary in vivo culture compared to those generated completely in vivo.
- The relative abundance of DNMT3A was significantly upregulated in blastocysts derived from the IVP-system in comparison to those temporarily cultured in vivo and completely generated in vivo. No statistical differences could be between the em-bryos of the latter two groups. On the other hand, morulae derived from the IVP-system showed a significantly lower expression of DNMT3A-mRNA compared to the embryos of both other groups, whereas no differences could be seen in embryos from the temporary in vivo culture and those derived in vivo.
The results of this study show that an oviduct culture of bovine embryos using a transvaginal endoscopy approach.
The results of the mRNA analysis additionally show that the expression of develop-mentally important gene transcripts is not altered by the temporary in vivo culture as it is when comparing in vivo generated embryos to those derived from in vitro culture systems. Therefore, temporary culture in vivo seems to be an optimized system in comparison to conventional IVP.
107 8 Anhang: Verzeichnisse