DNMT1 und DNMT3a

Die DNA- und Histon-Methylierungen spielen während der epigenetischen Reprogrammierung in der frühen Embryonalentwicklung eine bedeutende Rolle (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003).

Für die DNMT1 zeigte sich in dieser Arbeit ein signifikanter Unterschied in Morulae und Blastozysten der drei Herkünfte. In diesen embryonalen Stadien war die relative Transkriptmenge für DNMT1 in in vivo gewonnenen und in den Embryonen aus der temporären Eileiterkultur niedriger als die in den in vitro produzierten Stadien. Die Embryonen aus der temporären Kultur im Eileiter ähnelten im Expressionsmuster den In-vivo-Embryonen. HÖFFMANN zeigte 2006 auf, dass die DNMT1 eine hohe Aktivität für die Aufrechterhaltung der Methylierung vor der Aktivierung des embryo-nalen Genoms hat, und das ein signifikanter Abfall, sowohl bei in vivo gewonnenen

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als auch bei in vitro generierten Embryonen, nach der Aktivierung des Genoms statt-findet. Hierbei blieb jedoch die relative Transkriptmenge der in vitro produzierten Embryonen, wie auch in dieser Arbeit, signifikant über dem Niveau der In-vivo-Embryonen. Ähnliche Ergebnisse konnten in den bislang veröffentlichten Studien über die DNMT1-Expression beim Rind (WRENZYCKI et al. 2001b; WRENZYCKI u.

NIEMANN 2003) erzielt werden. Unterschiedliche Studien zu Einflussfaktoren auf den Gehalt an mRNA für DNMT1 in Eizellen und Embryonen des Rindes sind in Ta-belle 8 aufgelistet.

Tabelle 8: Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von DNMT1 in frühen Embryonalsta-dien des Rindes

Referenz Untersuchte

Stadien Versuchsbedingungen Ergebnis HÖFFMANN

et al. (2006)(

Morulae und Blastozysten

IVP im Vergleich zur In-vivo-

Produktion ↑

WRENZYCKI

et al. (2001a)(WRENZYCKI e

Blastozysten IVP im Vergleich zur In-vivo-

Produktion ↑

et al. (2011) Blastozysten IVP im Vergleich zur

In-vivo-Produktion und Eileiterkultur →

→ = kein Einfluss erkennbar, ↑ = mRNA-Gehalt erhöht, ↓ = mRNA-Gehalt herabgesetzt

Für die DNMT3a zeigten sich in dieser Arbeit ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen den Morulae und den Blastozysten der drei Herkünfte. Im Morulastadium war die relative Transkriptmenge der in vivo gewonnenen Embryonen und Eileiterkul-turembryonen höher als die in den in vitro produzierten. Die Embryonen aus der temporären Kultur im Eileiter ähnelten im Expressionsmuster abermals den In-vivo-Embryonen. Im Blastozystenstadium verhielt es sich genau umgekehrt. Die relative Transkriptmenge der in vivo gewonnenen Embryonen und Eileiterkulturembryonen war deutlich niedriger als die der in vitro erzeugten Blastozysten. In Tabelle 9 sind Untersuchungen aufgelistet, die sich mit den Einflussfaktoren auf die mRNA-Gehalte

von DNMT3a in Oozyten und Embryonen des Rindes beschäftigten. WRENZYCKI und NIEMANN (2003) konnten in ihren Untersuchungen keinen Unterschied in der relativen Transkriptmenge von DNMT3a in Abhängigkeit zur Produktionsart (in vivo oder in vitro) der Embryonen nachweisen. Allerdings konnte in darauf folgenden Ar-beiten festgestellt werden, dass sich je nach Stadium (10-16 Zeller, Morula, Blastozyste) doch Signifikanzen in Bezug auf die Expression von DNMT3a-Transkripten (HÖFFMANN et al. 2006) sowie auch auf Proteinebene nachweisen ließen (DRALLMEYER 2008, et al. 2009). Diese Ergebnisse könnten durch die Tat-sache bedingt sein, dass in den späteren Arbeiten andere Kultursysteme zur IVP der Embryonen verwendet worden sind. Signifikante Unterschiede im Proteingehalt und der Proteinlokalisierung der DNMT3a in den Blastomeren weisen auf einen Einfluss der In-vitro-Kultur auf die De novo- Methylierung vor, während und nach der Aktivie-rung des embryonalen Genoms hin (DRALLMEYER 2008). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen ebenfalls auf, dass die Herkunft der Embryonen einen Einfluss auf die Genexpression von DNMT3a hat.

Tabelle 9: Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von DNMT3a in frühen Embryonal-stadien des Rindes

Referenz Untersuchte

Stadien Versuchsbedingungen Ergebnis BEYHAN et

97 SAGIRKAYA

et al. (2007)(SAGIR Blastozysten

Zusatz von Serum fetaler Kälber

in der IVM im Vergleich zu synthetischem

SCNT im Vergleich zu in vivo

bzw. in vitro generierten Embryonen

↓

→ = kein Einfluss erkennbar, ↑ = mRNA-Gehalt erhöht, ↓ = mRNA-Gehalt herabgesetzt

5.2.2 SUV39H1

Die Methylierung von H3-K9 ist eine weitere wichtige epigenetische Modifikation.

Sowohl SUV39H1 als auch G9A können an dieser Stelle die Methylgruppen übertra-gen, was mit einer Repression der Genaktivität verbunden ist (TACHIBANA et al.

2002). Die H3-K9-Methylierung durch SUV39H1 kann durch HP1 erkannt werden und stellt somit eine Grundlage für den Aufbau heterochromatischer Strukturen dar (LACHNER et al. 2001; CHEUTIN et al. 2003). Histon-Methylierungen spielen wäh-rend der epigenetischen Reprogrammierung in der frühen Embryonalentwicklung eine bedeutende Rolle (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003).

Die relative Transkriptmenge von SUV39H1 in den untersuchten Stadien unterschied sich in dieser Arbeit signifikant in den Embryonen der drei verschiedenen Herkünfte (In-vivo-/ In-vitro-/ temporäre In-vivo-Kultur). Hierbei lag die Transkriptmenge der in vitro generierten Embryonen immer über der der In-vivo-Embryonen und der Emb-ryonen aus der temporären Eileiterkultur. Auch bei diesem Gen ähnelten die Expres-sionsmuster der Embryonen aus der temporären Eileiterkultur denen der In-vivo-Embryonen.

NOWAK-IMIALEK et al. (2008) zeigten in Ihrer Arbeit auf, dass expandierte Blastozysten, die im SOF-System kultiviert worden waren, Blastozysten nach parthe-nogenetischer Aktivierung sowie solche nach Kerntransfer (männliche Spenderzel-len) einen signifikant höheren relativen SUV39H1-Transkriptgehalt zeigten als in vivo gewonnene Embryonen. Die signifikanten Unterschiede in der relativen Transkriptmenge zwischen den Herkünften lassen darauf schließen, dass die

H3-K9-Methylierung stark von der In-vitro-Kultur bzw. durch weitere assistierte Reprodukti-onstechniken beeinflusst wird. In einer weiteren Studie wurde die relativen Transkriptmenge von SUV39H1 in Embryonen zweier verschiedener Herkünfte (in vivo/ in vitro) untersucht. Auch hier unterschieden sich die Transkriptgehalte signifi-kant. Die Transkriptmenge für SUV39H1 der in vitro generierten Embryonen lag auch dort immer über der der In-vivo-Embryonen (HÖFFMANN 2006).