SLC2A8 (GLUT8)

Abbildung 37 zeigt die relative Transkriptmenge von SCL2A8. Für dieses Gen konn-ten signifikante Unterschiede bei in vivo und in vitro generierkonn-ten Morulae und Blastozysten aufgezeigt werden. Morulae und Blastozysten aus der IVP unterschie-den sich in ihrer SLC2A8-Expression signifikant zu unterschie-denen aus In-vivo-Produktion bzw. Eileiterkultur.

Abbildung 37: Relative Transkriptmenge von SLC2A8 (GLUT8) in in vivo, in vitro gene-rierten Embryonen und Embryonen aus der temporären Eileiterkultur (a:b p≤ 0,05; ± SEM)

a a a

a b

b

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8

MO BLA

Relative Transkriptmenge SLC2A8

in vivo temporär in vitro

87 5 Diskussion

In vitro produzierte Embryonen unterscheiden sich immer noch deutlich von in vivo gewonnenen Embryonen (FARIN u. FARIN, 1995; THOMPSON 1997; HOLM et al.

2002). Außer morphologischen und biochemischen Unterschieden (GREVE et al.

1995; KHURANA u. NIEMANN 2000b) fallen auch Unterschiede auf molekularer Ebene auf (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000; LONERGAN et al. 2001; NIEMANN et al. 2002; WRENZYCKI et al. 2005b). Somit kann mit Hilfe des Expressionsmusters entwicklungsrelevanter Gene die Qualität von Embryonen aus IVP und nach sNT objektiver und besser evaluiert werden. Genexpressionsmuster der in vivo gewonne-nen Embryogewonne-nen diegewonne-nen hierbei als „physiologischer Standard“ (WRENZYCKI 2007).

Assistierte Reproduktionstechniken, wie z.B. die IVM von Oozyten, Superovulation, IVF/ICSI und die IVC greifen in äußerst sensitive Phasen der Entwicklung ein. In die-sen Phadie-sen wird das Genom reprogrammiert und ist besonders anfällig für epigene-tische Störungen. Die Störung dieses zeitlich und räumlich hochkoordinierten Pro-zesses stellte eine wichtige Ursache für den hohen Verlust von Embryonen bzw.

Trächtigkeiten und abnormaler Phänotypen nach Übertragung von IVP-Embryonen dar. Die Nutzung assistierter Reproduktionstechniken scheinen die Schwere und Häufigkeit von Reprogrammierungsstörungen zu verstärken (HAAF 2006).

Die In-vivo-Embryonen für diese Arbeit wurden nach Superovulation gewonnen. Ein möglicher nachteiliger Einfluss durch die vorangegangene Superovulation des Spen-dertieres ist vorstellbar. So wurde für Maus und Hamster nachgewiesen, dass durch Superovulation erzeugte Embryonen eine gestörte Entwicklung aufweisen können (ERTZEID u. STORENG 2001). Für das Rind wurde festgestellt, dass Embryonen gewonnen nach Superovulation eine abweichende Genexpression im Vergleich zu Embryonen haben, die ohne hormonelle Stimulation des Spendertieres gewonnen wurden. Diese Studie wirft die Frage auf, ob In-vivo-Embryonen, gewonnen nach Superovulation, der Standard für vergleichende Genexpressionsstudien sein sollten (MUNDIM et al. 2009).

Gegenüber der Embryogewinnung aus Superovulation ermöglicht die In-vitro-Technik die Produktion einer noch höhreren Anzahl von Embryonen. Andererseits weist die IVP Grenzen auf, die durch deutliche qualitative Mängel der Embryonen gekennzeichnet sind und sich auf den Embryo, den Fetus, die Plazenta und das ge-borene Kalb (LOS) auswirken. In erster Linie wird nach Embryotransfer von In-vitro-Embryonen und stärker noch bei In-vitro-Embryonen aus somatischen Klonen vermehrt ein Syndrom fetaler Anomalien beobachtet, das häufig mit einem embryonalen und feta-len Überwuchs einhergeht. Daher wird es als Large Offspring Syndrome (LOS;

WALKER et al. 1996; YOUNG et al. 1998; FARIN et al. 2006) bezeichnet. Die ge-naue Pathogenese dieses Syndroms ist noch weitestgehend unklar. Offensichtlich spielen in dessen Ätiologie Störungen der epigenetischen Reprogrammierung des Genoms während der frühembryonalen Phase eine erhebliche Rolle. Die Skelett-muskulatur ist abnormal entwickelt, Plazenta und Plazentagefäße sind verändert, Störungen im Metabolismus und Störungen in physiologischen und genetischen Me-chanismen (Polyploidie, Methylierung der DNA, Untergang von Zellen des Embryos, Embryotod, Funktionsstörungen zu späterem Zeitpunkt mit Abort bzw. Todesfolge etc.) treten vermehrt auf. Derzeitige Erklärungsmodelle gehen daher von einer Stö-rung der frühembryonalen DemethylieStö-rungs- bzw. MethylieStö-rungsvorgänge als einer wichtigen Ursache des LOS aus (KANG et al. 2001; WILMUT et al. 2002;

HIENDLEDER et al. 2006; FARIN et al. 2006).

Im Unterschied zur Blastozystenrate, die durch die Sperma- und Eizellqualität festge-legt ist, wird die Beeinflussung der Blastozystenqualität vornehmlich durch die Kultur gesehen (RIZOS et al. 2002). Aus diesem Grund wurde die In-vivo-Kultur von IVM/IVF Embryonen schon zu Beginn der IVP-Entwicklung erfolgreich eingesetzt, indem chirurgischer Zugang zu Rinder-, Schaf- und Kanincheneileiter geschaffen wurde. Auf diese Weise wurden bislang über 25.000 transfertaugliche Embryonen guter Qualität gewonnen (HAVLICEK et al. 2010).

Neueste Arbeiten konzentrieren sich auf eine optimierte Embryonenproduktion, die eine maximale Entwicklungsdauer im Rind (In-vivo-Kultur) mit den Vorteilen der In vitro-Produktion kombiniert (HAVLICEK et al. 2010).

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Bislang sind vergleichende Studien zur mRNA-Expression nur zwischen in vivo und in vitro produzierten Embryonen (nach IVP und/oder sNT), bzw. zwischen in vitro produzierten Embryonen und Embryonen aus Eileiterkulturen im heterologen Eileiter (Kaninchen, Schaf) oder nach Organkultur (isolierter Mäuseeileiter) durchgeführt worden (Tabelle 2). Auch wenn eine Eileiterkultur im heterologen Ovidukt Embryonen guter Qualität hervorbrachte, sind sie den komplett in vivo generierten Embryonen bezüglich ihrer Genexpression nicht gleich zu setzen, da nur die physiologische Um-gebung des präimplantatorischen Embryos optimale Voraussetzungen für seine wei-tere Entwicklung bietet (BAVISTER 1995; LAZZARI et al. 2002; LONERGAN et al.

2003c; WRENZYCKI et al. 2005b). HAVLICEK et al. zeigten 2010 bereits mit ihrer Studie auf, dass Blastozysten aus der In-vivo-Kultur im homologen, nicht ligiertem Eileiter des Rindes bezüglich der Kryokonservierbarkeit ein ähnliches Verhalten zeig-ten wie Blastozyszeig-ten aus der reinen In-vivo-Produktion. Je länger die In-vivo-Kultur nach IVF erfolgte, desto bessere Qualität erlangten die getesteten Embryonen (HAVLICEK et al. 2010).

Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, Embryonen aus einer Eileiterkultur im homologen, nicht ligierten Eileiter mit Embryonen aus der IVP und in vivo gewonne-nen Embryogewonne-nen bezüglich ihrer Expressionsmuster entwicklungsrelevanter Gene zu vergleichen, um so weitere Qualitätsunterschiede aufzuführen. Die DNA- und Histon-Methyltransferasen wurden ausgewählt, da sie bei der epigenetischen Reprogrammierung des Genoms während der frühen Embryonalentwicklung eine bedeutende Rolle spielen (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003). Die Glukosetransporter sind essentiell für den Stoffwechsel des präimplantatorischen Embryos und somit auch Markergene für dessen korrekte Entwicklung.

2011 konnte in einer Studie vom KUZMAMY et al. aufgezeigt werden, dass die Kul-turbedingungen (IVP, Eileiterkultur, In-Vivo-Produktion) keinen signifikanten Einfluss auf das Expressionsmuster von ausgewählten Genen vor dem Einfrieren der Emb-ryonen hatten. Es wurden entwicklungsrelevante Gene, unter anderem auch DNMT1A und SLC2A3, ausgewählt und mittels RT-qPCR analysiert. Die Embryonen für die Genanalyse wurden in Pools, vor und nach Kryokonservierung, untersucht.

Nach dem Auftauen konnten signifikant höhrere Transkriptlevel für die Gene (OCC, DSC2, BAX) in Blastozysten aus der IVP und In-vivo-Produktion nachgewiesen wer-den. SLC2A3 war in der In-vitro-Gruppe ebenfalls signifikant erhöht (KUZMANY et al.

2011).