Die transvaginale Endoskopie mit dem daraus resultierenden Zugang zum Eileiter stellt eine Technik dar, um sowohl frühe tubale Embryonalstadien gewinnen zu kön-nen (HAVLICEK et al. 1999; BESENFELDER et al. 2001) als auch Rinderembryokön-nen aus der IVP in vivo, im homologen Eileiter kultivieren zu können. Damit besteht eine Alternative zu den bisherigen Methoden der In-vivo-Kultur im heterologen System (z.
B. ligierter Schaf- und Kanincheneileiter) und zur Organkultur im isolierten Mäuseei-leiter (RIZOS et al. 2007), welche ebenso wie die In-vitro-Kultur nachteilige Einflüsse auf die Embryonen haben können (LAZZARI et al. 2002; HAVLICEK 2005a;
WETSCHER 2005a). Der 1998 von BESENFELDER und BREM entwickelte transva-ginal-endoskopische Zugang zum Eileiter des Rindes stellt einen minimal-invasiven Eingriff dar, welcher wiederholt und ohne größere nachteilige Effekte auf die spätere Nutzung der Tiere angewendet werden kann. Vorteil dieser Methode ist die minimale Manipulation der Reproduktionsorgane, da diese nicht wie bei konventionell chirurgi-schen Eingriffen an die Körperoberfläche vorverlagert werden müssen, sondern durch den endoskopischen Einsatz in situ bleiben (BESENFELDER u. BREM 1998).
Die transvaginale Endoskopie ist ein äußerst schonendes Verfahren, denn im Ver-gleich zu laparoskopischen oder chirurgischen Zugängen zur Bauchhöhle wird ledig-lich das dorsale Scheidendach durchstoßen, welches an der entsprechenden Stelle nur wenige Millimeter dick und äußerst regenerationsfähig ist. Bei späteren Schlach-tungen der mit dieser Technik endoskopierten Tiere konnte die Zugangsstelle im Fornix vaginae nur in wenigen Fällen als kleine Einziehung im Schleimhautrelief dar-gestellt werden (MÖSSLACHER et al. 2001). Auch ist durch die mittige Eintrittsstelle des Endoskops im Reproduktionstrakt eine gleichermaßen gute Erreichbarkeit des rechten und linken Ovars gegeben, um je nach Ovulationsseite Zugang zum
jeweili-91
gen Eileiter zu erlangen (BESENFELDER u. BREM 1998). Auch die Dauer des Ein-griffs ist bei diesem endoskopischen Verfahren wesentlich kürzer, welches ebenfalls zu einer erheblichen Reduktion der Belastung für die Tiere beiträgt (HAVLICEK 2002).
Als kritischer Punkt der transvaginalen Endoskopie bleibt die Eröffnung der Bauch-höhle durch einen scharfen Trokar zu nennen. Es ist hierbei durch rektale manuelle Kontrolle vor der Trokarierung des Fornix vaginae sicherzustellen, dass sich keine Organe wie zum Beispiel Pansen, Arteriae iliacae, Blase oder Nieren vor der Trokarspitze befinden. Ferner kann ein Ablösen des Bauchfells durch ruckartiges Durchstoßen des Scheidendaches vermieden werden.
Die transvaginale Endoskopie beim Rind stellt also eine Methode dar, mit deren Hilfe die einzelnen Schritte der frühen präimplantatorischen Embryonalentwicklung und die Effekte des Eileitermilieus auf die Embryonen untersucht werden können, zum Beispiel bei der Erspülung früher Embryonalstadien aus dem Eileiter oder nach Verwendung der transvaginalen Endoskopie zur temporären In-vivo-Kultur in vitro produzierter Embryonen (HAVLICEK et al. 2005a, 2005b; WETSCHER et al. 2005a, 2005b).
In der vorliegenden Arbeit konnten bei 16 Tieren erfolgreich Zygoten in den Eileiter abgesetzt werden, bei 4 Transfers brach die gläserne Transferkapillare ab und es kam somit zum Verlust aller Embryonen in die Bauchhöhle, bei zwei Tieren gab es eine ungenügende Wirkung der Epiduralanästhesie, so dass ein Transfer der Zygo-ten aufgrund des AbwehrverhalZygo-tens der Tiere nicht möglich war.
Die Wiederfindungsrate (Anzahl der übertragenen Zygoten zu den wiedergefundenen Stadien) lag bei 59,5%. Die einzelnen Wiederfindungsraten schwankten zwischen 0-100%. Mögliche Gründe für die zum Teil sehr unterschiedlichen Wiederfindungsraten dieser Arbeit im Vergleich zu den Ergebnissen der Wiener Arbeitsgruppe um Prof. U.
Besenfelder (BESENFELDER et al. 2005) sind multifaktoriell. Zum einen wurden in der Studie von Prof. Besenfelder verschiedene Versuchsgruppen [Zygoten in Hyaluronsäure, Zygoten mit und ohne Cumulus, GIFT, (Gamete Intra-Fallopian
Transfer), Zygoten in Alginat, Progressive Stadien (4- bis 8-Zellstadium)] übertragen und für jede Gruppe andere Wiederfindungsraten ermittelt. Diese Gewinnungsraten sind jedoch sehr deutlich von den in den verschiedenen Gruppen durchgeführten Transferaktionen abhängig. So konnte für die Embryonen der Gruppe „Zygoten in Alginat gebettet“ die höchste Findungsrate von 70,5% und die niedrigste für die Emb-ryonen der Gruppe „Hyaluronsäure“ (12,9%) ermittelt werden. Der wichtigste Grund der Alginateinbettung in diesem Versuch lag darin, den Verlust der Embryonen nach Transfer in einen aktiven und dynamischen Eileiter zu verhindern, was auch gelang.
Die deutlich erhöhte Konzentration an Hyaluronsäure (6 mg/ml) verhinderte jedoch die koordinierte und frequente Bewegung des Zilienbesatzes auf den Eilieiterepithelzellen (HUANG et al., 1997), was ein wichtiger Grund für die vermin-derte Findungsrate in der „Hyaluronsäuregruppe“ im Versuch sein könnte. Die Wiederfindungsrate bei der Studie BESENFELDER et al. 2005 war im Schnitt 50,5%, was dem Ergebnis dieser Arbeit (59,5%) ähnelt. Die Ergebnisse dieses „offenen“
Systems der In-vivo-Kultur lassen sich mit den in der Literatur dokumentierten Arbei-ten am ligierArbei-ten Schafeileiter vergleichen, wo WiedergewinnungsraArbei-ten zwischen 64%
und 74% erreicht wurden (SREENAN und SCANLON 1968; BOLAND 1984;
ENRIGHT et al. 2000; RIZOS et al. 2002).
Die Blastozystenrate lag bei der Studie der Wiener Arbeitsgruppe im Schnitt bei 24,4%, in dieser Arbeit bei 19,4%. Auch hier sind die Gründe zum Teil in den ver-schiedenen Versuchsgruppen der von BESENFELDER et a. 2005 durchgeführten Studie zu finden. Die Supplemente, die zu den übertragenen Embryonalstadien oder Gameten zugesetzt wurden, beeinflussen deren Entwicklung. Die höchsten Entwick-lungsraten mit 41,9% (Tag 7) und 43,3% (Tag 8) nach In-vivo-Kultur wurde bei BE-SENFELDER in der Gruppe erreicht, in der fortgeschrittene Stadien übertragen wur-den. Ein weiterer Grund für die höheren Entwicklungsraten bei der Forschungsgrup-pe um Prof. Besenfelder lag wahrscheinlich darin, dass im Anschluss an die Spülung nach der In-vivo-Kultur noch eine 24h In-vitro-Kultur der gewonnenen Stadien erfolg-te.
93 5.2 Genexpressionsmuster
Die Charakterisierung embryonaler Genexpressionsmuster ermöglicht eine genauere Beurteilung der Qualität von Embryonen als die Betrachtung morphologischer Para-meter. Weiterhin erlaubt sie Einblicke in die molekularen Mechanismen der Embryo-nalentwicklung und in die Auswirkungen einzelner Veränderungen der Umgebung auf Wachstum und Entwicklung der Embryonen (LEIBFRIED-RUTLEDGE 1999;
SHEHU et al. 1996). Genexpressionsanalysen bei Rinderembryonen haben in den letzten Jahren stetig zugenommen. Durch die Technik der RT-PCR wurde es mög-lich, die Expression verschiedener Gene in einzelnen präimplantatorischen Embryo-nen qualitativ und quantitativ nachzuweisen (NIEMANN und WRENZYCKI, 2000;
WRENZYCKI et al. 2001a, 2001b). Die RT-qPCR ist die bevorzugte Methode für die Ermittlung quantitativer mRNA-Expression in kleinen Probenmengen, wie Oozyten oder präimplantatorischen Embryonen, insbesondere bei Genen mit geringer Ex-pression (GÁL et al. 2006). Viele Arbeiten über GenexEx-pressionsmuster in präimplantatorischen Rinderembryonen führten zu der Erkenntnis, dass eine Vielzahl von Transkripten in IVP-Embryonen ein anderes/abweichendes Expressionsmuster im Vergleich zu In-vivo-Embryonen aufweisen (HO et al., 1994; STOJANOV und O'NEILL, 1999; NIEMANN und WRENZYCKI, 2000; HYTTEL et al., 2000;
WRENZYCKI et al., 1999, 2000, 2001a, 2001b, 2002). Derartigen Unterschieden in der Genexpression wird eine wichtige Rolle bei verschiedenen Problemen, die im Zusammenhang mit der IVP auftreten, zugeschrieben (MENEZO et al., 2000; NIE-MANN und WRENZYCKI 2000). Ebenso wird ein Zusammenhang zum LOS vermu-tet. Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen zum besseren Verständnis der grundlegen-den zellulären und molekularen Mechanismen bei der Kontrolle der embryonalen Genexpression beitragen, indem die Expressionensmuster entwicklungsrelevanter Gene in in vitro produzierten und Embryonen aus einer temporären Eileiterkultur im Vergleich zu den Expressionsmustern in vivo gewonnener Embryonen verglichen werden.
Die Aufdeckung dieser Unterschiede ist der Schlüssel zur Optimierung von Biotech-nologien im veterinär- und humanmedizinischen Sektor. Daraus resultierend können möglicherweise verbesserte Kultursysteme entwickelt werden, Technologien zur
In-vitro-Erstellung von Embryonen verfeinert werden und vielleicht auch die Eileiterkul-tur zur Gewinnung qualitativ hochwertiger Embryonen standardisiert werden. Zusätz-lich liefern die Studien weitere Hinweise auf die Entstehung von Entwicklungsstörun-gen wie zum Beispiel des LOS.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die mRNA-Expression von fünf Genen (DNMT1, DNMT3a, SUV39H1, SLC2A3 und SLC2A8) in in vivo und in vitro generier-ten präimplantatorischen Rinderembryonen, sowie in Embryonen aus einer temporä-ren Eileiterkultur im homologen Eileiter des Rindes vergleichend untersucht. Für alle untersuchten Gene konnte eine signifikante Abhängigkeit von Transkriptmenge und Herkunft der Embryonen festgestellt werden, wobei die Expressionsmuster der in vivo gewonnenen Embryonen als physiologischer Standard dienten. Die für diese Studie ausgewählten Gene haben sich in ihrem Gehalt bereits von unterschiedlichen Einflussfaktoren verändert gezeigt (WRENZYCKI et al. 2007; Tabelle 2). Allerdings muss bei der Interpretation von Daten aus der RT-qPCR immer beachtet werden, dass eine Relevanz für die Protein- bzw. Funktionsebene angenommen wird, aber meist nicht nachgewiesen ist.
5.2.1 DNMT1 und DNMT3a
Die DNA- und Histon-Methylierungen spielen während der epigenetischen Reprogrammierung in der frühen Embryonalentwicklung eine bedeutende Rolle (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003).
Für die DNMT1 zeigte sich in dieser Arbeit ein signifikanter Unterschied in Morulae und Blastozysten der drei Herkünfte. In diesen embryonalen Stadien war die relative Transkriptmenge für DNMT1 in in vivo gewonnenen und in den Embryonen aus der temporären Eileiterkultur niedriger als die in den in vitro produzierten Stadien. Die Embryonen aus der temporären Kultur im Eileiter ähnelten im Expressionsmuster den In-vivo-Embryonen. HÖFFMANN zeigte 2006 auf, dass die DNMT1 eine hohe Aktivität für die Aufrechterhaltung der Methylierung vor der Aktivierung des embryo-nalen Genoms hat, und das ein signifikanter Abfall, sowohl bei in vivo gewonnenen
95
als auch bei in vitro generierten Embryonen, nach der Aktivierung des Genoms statt-findet. Hierbei blieb jedoch die relative Transkriptmenge der in vitro produzierten Embryonen, wie auch in dieser Arbeit, signifikant über dem Niveau der In-vivo-Embryonen. Ähnliche Ergebnisse konnten in den bislang veröffentlichten Studien über die DNMT1-Expression beim Rind (WRENZYCKI et al. 2001b; WRENZYCKI u.
NIEMANN 2003) erzielt werden. Unterschiedliche Studien zu Einflussfaktoren auf den Gehalt an mRNA für DNMT1 in Eizellen und Embryonen des Rindes sind in Ta-belle 8 aufgelistet.
Tabelle 8: Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von DNMT1 in frühen Embryonalsta-dien des Rindes
Referenz Untersuchte
Stadien Versuchsbedingungen Ergebnis HÖFFMANN
et al. (2006)(
Morulae und Blastozysten
IVP im Vergleich zur In-vivo-
Produktion ↑
WRENZYCKI
et al. (2001a)(WRENZYCKI e
Blastozysten IVP im Vergleich zur In-vivo-
Produktion ↑
et al. (2011) Blastozysten IVP im Vergleich zur
In-vivo-Produktion und Eileiterkultur →
→ = kein Einfluss erkennbar, ↑ = mRNA-Gehalt erhöht, ↓ = mRNA-Gehalt herabgesetzt
Für die DNMT3a zeigten sich in dieser Arbeit ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen den Morulae und den Blastozysten der drei Herkünfte. Im Morulastadium war die relative Transkriptmenge der in vivo gewonnenen Embryonen und Eileiterkul-turembryonen höher als die in den in vitro produzierten. Die Embryonen aus der temporären Kultur im Eileiter ähnelten im Expressionsmuster abermals den In-vivo-Embryonen. Im Blastozystenstadium verhielt es sich genau umgekehrt. Die relative Transkriptmenge der in vivo gewonnenen Embryonen und Eileiterkulturembryonen war deutlich niedriger als die der in vitro erzeugten Blastozysten. In Tabelle 9 sind Untersuchungen aufgelistet, die sich mit den Einflussfaktoren auf die mRNA-Gehalte
von DNMT3a in Oozyten und Embryonen des Rindes beschäftigten. WRENZYCKI und NIEMANN (2003) konnten in ihren Untersuchungen keinen Unterschied in der relativen Transkriptmenge von DNMT3a in Abhängigkeit zur Produktionsart (in vivo oder in vitro) der Embryonen nachweisen. Allerdings konnte in darauf folgenden Ar-beiten festgestellt werden, dass sich je nach Stadium (10-16 Zeller, Morula, Blastozyste) doch Signifikanzen in Bezug auf die Expression von DNMT3a-Transkripten (HÖFFMANN et al. 2006) sowie auch auf Proteinebene nachweisen ließen (DRALLMEYER 2008, et al. 2009). Diese Ergebnisse könnten durch die Tat-sache bedingt sein, dass in den späteren Arbeiten andere Kultursysteme zur IVP der Embryonen verwendet worden sind. Signifikante Unterschiede im Proteingehalt und der Proteinlokalisierung der DNMT3a in den Blastomeren weisen auf einen Einfluss der In-vitro-Kultur auf die De novo- Methylierung vor, während und nach der Aktivie-rung des embryonalen Genoms hin (DRALLMEYER 2008). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen ebenfalls auf, dass die Herkunft der Embryonen einen Einfluss auf die Genexpression von DNMT3a hat.
Tabelle 9: Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von DNMT3a in frühen Embryonal-stadien des Rindes
Referenz Untersuchte
Stadien Versuchsbedingungen Ergebnis BEYHAN et
97 SAGIRKAYA
et al. (2007)(SAGIR Blastozysten
Zusatz von Serum fetaler Kälber
in der IVM im Vergleich zu synthetischem
SCNT im Vergleich zu in vivo
bzw. in vitro generierten Embryonen
↓
→ = kein Einfluss erkennbar, ↑ = mRNA-Gehalt erhöht, ↓ = mRNA-Gehalt herabgesetzt
5.2.2 SUV39H1
Die Methylierung von H3-K9 ist eine weitere wichtige epigenetische Modifikation.
Sowohl SUV39H1 als auch G9A können an dieser Stelle die Methylgruppen übertra-gen, was mit einer Repression der Genaktivität verbunden ist (TACHIBANA et al.
2002). Die H3-K9-Methylierung durch SUV39H1 kann durch HP1 erkannt werden und stellt somit eine Grundlage für den Aufbau heterochromatischer Strukturen dar (LACHNER et al. 2001; CHEUTIN et al. 2003). Histon-Methylierungen spielen wäh-rend der epigenetischen Reprogrammierung in der frühen Embryonalentwicklung eine bedeutende Rolle (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003).
Die relative Transkriptmenge von SUV39H1 in den untersuchten Stadien unterschied sich in dieser Arbeit signifikant in den Embryonen der drei verschiedenen Herkünfte (In-vivo-/ In-vitro-/ temporäre In-vivo-Kultur). Hierbei lag die Transkriptmenge der in vitro generierten Embryonen immer über der der In-vivo-Embryonen und der Emb-ryonen aus der temporären Eileiterkultur. Auch bei diesem Gen ähnelten die Expres-sionsmuster der Embryonen aus der temporären Eileiterkultur denen der In-vivo-Embryonen.
NOWAK-IMIALEK et al. (2008) zeigten in Ihrer Arbeit auf, dass expandierte Blastozysten, die im SOF-System kultiviert worden waren, Blastozysten nach parthe-nogenetischer Aktivierung sowie solche nach Kerntransfer (männliche Spenderzel-len) einen signifikant höheren relativen SUV39H1-Transkriptgehalt zeigten als in vivo gewonnene Embryonen. Die signifikanten Unterschiede in der relativen Transkriptmenge zwischen den Herkünften lassen darauf schließen, dass die
H3-K9-Methylierung stark von der In-vitro-Kultur bzw. durch weitere assistierte Reprodukti-onstechniken beeinflusst wird. In einer weiteren Studie wurde die relativen Transkriptmenge von SUV39H1 in Embryonen zweier verschiedener Herkünfte (in vivo/ in vitro) untersucht. Auch hier unterschieden sich die Transkriptgehalte signifi-kant. Die Transkriptmenge für SUV39H1 der in vitro generierten Embryonen lag auch dort immer über der der In-vivo-Embryonen (HÖFFMANN 2006).
5.2.3 SLC2A3 und SLC2A8
Präimplantationsembryonen nutzen während der Teilung überwiegend Laktat und Pyruvat und mit Beginn der Blastozystenentwicklung Glukose zur Energiebereitstel-lung. Die Energieversorgung von Embryonen vor der Kompaktierung ist also haupt-sächlich von der ATP-Synthese abhängig. Mit fortschreitender Weiterentwicklung, verstärkter Proteinsynthese und Bildung des Blastozoel steigt der Verbrauch an ATP.
Der Embryo verwendet nun vermehrt auch Glukose und Aminosäuren zur Energie-versorgung (PARTRIDGE und LEESE 1996). Vom 8-16 Zellstadium steigt der Glukoseverbrauch des Embryos stetig an (KHURANA und NIEMANN 2000b). Neben dem Citratzyklus nutzen Blastozysten auch die Glykolyse zur Energiegewinnung.
Obwohl die anaerobe Glykolyse unter dem Aspekt der ATP-Gewinnung weniger günstig ist, stellt sie vermutlich eine Anpassung an die niedrigen Sauerstoffkonzent-rationen im Uteruslumen dar. Untersuchungen in der Maus, der Ratte, dem Kanin-chen und dem Rind zeigten eine Expression eines breiten Spektrums von Glukosetransportern in Präimplantationsembryonen. Das Expressionsmuster weist jedoch zell- und stadienspezifische Unterschiede in der Verteilung der Isoformen und Unterschiede zwischen den Spezies auf (FISCHER und NAVARRETE-SANTOS 2003). Viele Versuchsergebnisse deuten auf eine Funktion der Glukosetransporter bei der Entwicklung der Präimplantationsembryonen hin, die über die Glukoseaufnahme hinausgeht. Bei Antisense-Experimenten mit SCL2a1, SCL2a3 und SCL2a8 reduzierte sich nicht nur die Glukoseaufnahme der Embryonen, sondern es kam im Maus- und Rattenmodell auch zu einer Entwicklungsblockierung im Morulastadium, zu einem Anstieg der Apoptoserate oder zu erniedrigten
Graviditäts-99
raten nach Embryotransfer (BRISON et a. 1993; PINTO et al. 2002). AUGUSTIN et al. (2001) zeigten auf, dass Glukosetransporter während der Präimplantationsentwicklung beim Rind stadienspezifisch exprimiert werden. Dabei liegen die Solute Carrierer 1, 3, 8 und SGLT-I als maternale Transkripte vor und sind in allen untersuchten Embryonalstadien nachweisbar. Die SLC2A3 und SLC2A1-mRNA Expression ist bei bovinen Embryonen nachgewiesen worden (WRENZYCKI et al. 1999; AUGUSTIN et al. 2001). SLC2A3-mRNA wurde in Blastozysten aus In-vitro Kultur-Systemen (SOF-Serum, SOF-BSA) und aus Eileiterkulturen im ligierten Schafeileitern stärker exprimiert als bei in vivo gewonnenen Blastozysten (LAZZARI et a. 2002). MessengerRNA von SLC2A3 kann in Blastozysten an Tag 7 ihrer Ent-wicklung nur im Trophektoderm detektiert werden (WRENZYCKI et al. 2003).
SLC2A3, dessen Hauptaufgabe der Transport von Glukose an neuronalem Gewebe ist, hat sich in der Vergangenheit als sensitiver Marker für suboptimale Kulturbedin-gungen bei der IVP herausgestellt (LAZZARI et al. 2002). Dadurch dass die Expres-sion nur bei in vitro produzierten Embryonen signifikant erhöht war, kann davon aus-gegangen werden, dass diese qualitativ nicht denen, die in vivo generiert wurden, entsprechen. (LAZZARI et al. 2002). In Embryonalstadien des Rindes werden zwei Insulin-sensitive Glukosetransporter exprimiert. Im Gegensatz zu dem ausschließlich in Blastozysten transkribierten SLC2A4, wird die SLC2A8-RNA in allen untersuchten Embryonalstadien gefunden (AUGUSTIN 2001). In einer Studie von KUZMANY et al.
(2011) gab es keinen signifikanten Unterschied in der Expression von SCL2A3 in Blastozysten aus verschiedenen Herkünften.
Die relative Transkriptmenge von SLC2A3 und SCL2A8 in den untersuchten Stadien in dieser Arbeit (Morulae/Blastozysten) unterschied sich signifikant in den Embryo-nen der drei verschiedeEmbryo-nen Herkünfte (In-vivo-/ In-vitro-/ temporäre In-vivo-Kultur).
Hierbei lag die Transkriptmenge der in vitro generierten Embryonen immer über der der In-vivo-Embryonen und der Embryonen aus der Eileiterkultur.
In Anlehnung an die Ergebnisse der vorher genannten Arbeiten bedeutet dies für die vorliegende Arbeit, dass die Embryonen, die nach einer temporären Eileiterkultur
un-tersucht wurden, in ihren mRNA-Gehalten aller unun-tersuchter Gene eher denen in vivo erstellter Embryonen ähneln, also qualitativ hochwertiger erscheinen.
5.3 Schlussbetrachtung
Um neue Wege zum Verständnis der embryo-maternalen Kommunikation aufzeigen zu können, ist es unumgänglich, die In-vitro-Methoden mit den physiologischen Ab-läufen bereits im Eileiter zu kombinieren. Neueste Arbeiten konzentrieren sich auf eine optimierte Embryogewinnung, die eine maximale Entwicklungsdauer im Rind (In-vivo-Kultur) mit den Vorteilen der In-vitro-Produktion kombinieren (HAVLICEK et al. 2010)
Die derzeitig gebräuchlichen In-vitro-Systeme beim Rind könnten dauerhafte Ände-rungen in den Genexpressionsmustern während der embryonalen und fetalen Ent-wicklung bedingen (WRENZYCKI et al. 2004), was zu einer verringerten Qualität der Embryonen führen und sogar die Überlebensfähigkeit der Nachkommen nach einem Transfer beeinflussen kann (WRENZYCKI et al. 2007).
Es ist möglich, dass epigenetische Modulationen in der IVP während der präimplantatorischen Embryonalentwicklung kausale Mechanismen sind, die am Auftreten des LOS beim Rind beteiligt sind (WILMUT et al. 2002; HIENDLEDER et al. 2006; FARIN et al. 2006). Daher ist die Analyse der mRNA-Gehalte von Genen, die für die embryonale Entwicklung wichtig sind, ein nützliches Werkzeug, um die
„Normalität“ der Embryonen zu messen (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000). Die ge-naue Analyse dieser entwicklungsrelevanten Gene könnte dazu beitragen, dass fun-dierte Klassifikationskriterien für die Selektion bezüglich einer guten Entwicklungs-kompetenz gefunden werden (COTICCHIO et al. 2004; PATEL et al. 2007).
Die Ergebnisse dieser Arbeit haben verdeutlicht, dass alle untersuchten mRNA-Expressionsprofile der Embryonen der temporären Eileiterkultur denen des „golde-nen Standards“, also de„golde-nen der In-vivo-Embryo„golde-nen, gleichen.
101
Die Aufdeckung von Unterschieden im mRNA-Expressionsprofil zwischen in vivo und in vitro produzierten oder geklonten Embryonen ist ein wesentlicher Schlüssel für Optimierung der In-vitro-Systeme und zur Minimierung des Auftretens von Entwick-lungsstörungen.
Ein kritischer Punkt der IVP scheint die Supplementierung der Kulturmedien zu sein.
Bovines Serumalbumin und Serum werden am häufigsten als Medienzusätze ver-wendet, sind aber umstritten, da sie neben Hormonen und Wachstumsfaktoren eine Reihe weiterer unbekannter Komponenten enthalten können. Dies macht den Ver-gleich von Experimenten untereinander schwierig. Es ist also von großem Interesse, klar definierte Medien zu entwickeln, die auf synthetischen Makromolekülen basieren (WARZYCH et al. 2007).
NIEMANN et al. (2002) hat zusammenfassend beschrieben, dass all die auftretenden Abnormalitäten und Aberrationen nichts anderes sind als eine Stressantwort des Embryos auf ungenügende Kulturbedingungen.
Die fünf ausgewählten Gentranskripte wurden beim Rind erstmals vergleichend zwi-schen den Embryonen der drei Herkünfte untersucht. Die signifikanten Unterschiede in der relativen Transkriptmenge der DNA-Methyltransferasen zwischen in vivo und in vitro generierten Embryonen und Embryonen aus der temporären Eileiterkultur lassen darauf schließen, dass sowohl der Erhalt als auch die
Die fünf ausgewählten Gentranskripte wurden beim Rind erstmals vergleichend zwi-schen den Embryonen der drei Herkünfte untersucht. Die signifikanten Unterschiede in der relativen Transkriptmenge der DNA-Methyltransferasen zwischen in vivo und in vitro generierten Embryonen und Embryonen aus der temporären Eileiterkultur lassen darauf schließen, dass sowohl der Erhalt als auch die