Generierung der In-vitro-Zygoten für den tubalen Transfer

Die Embryonen für die temporäre Kultur im homologen, nicht ligierten bovinen Eilei-ter wurden bis zum Zygotenstadium in vitro generiert. Hierzu sind Ovarien von einem nahegelegenen Schlachthof gesammelt und in einem Thermogefäß mit physiologi-scher Kochsalzlösung bei ca. 25°C ins Labor transportiert worden. Die Gewinnung der Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) aus den Ovarien erfolgte mit Hilfe der Slicing-Methode (ECKERT u. NIEMANN 1995). Dazu wurden die Ovarien mit einer Arterienklemme in einer Petrischale fixiert. Die Schale war mit 25 °C warmer, modifi-zierter phosphatgepufferter Salzlösung [PBS+ Heparin (2 I.E./500mL) + 0,1% BSA]

gefüllt. Jedes Ovar wurde von beiden Seiten in Längsrichtung mit einem Mehrfach-messer, bestehend aus 6-8 parallel angeordneten Rasierklingen eingeschnitten und anschließend mit PBS gespült. Die Flüssigkeit aus der Petrischale wurde zum Ab-trennen der größeren Gewebepartikel durch ein Teesieb in ein Becherglas mit einem Volumen von 600 ml gegossen. Anschließend erfolgte nach Sedimentation das Her-aussuchen der KOK unter einem Stereomikroskop bei 20-facher Vergrößerung. Je nach Beschaffenheit des Cumulus oophorus und des Ooplasmas wurden die KOK in Anlehnung an die unten verwendeten Beurteilungskriterien in fünf Qualitätsklassen (Tabelle 3, BUNGARTZ et al. 1995) eingeteilt. Nur KOK der Kategorien 1 und 2 wur-den für die IVP verwendet. Nach dreimaligem Waschen der KOK in TCM + BSA (0,1

%) wurden sie für 24 Stunden in mit Silikonöl überschichteten 100 μl großen Tropfen TCM + BSA (0,1 %) + eCG (10 I.E.) + hCG (5 I.E.; Suigonan®, Intervet) in einem Inkubator bei 39°C und 5 % CO₂ und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre gereift.

Zur In-vitro-Fertilisation der gereiften Oozyten wurde Tiefgefriersperma des IVF-getesteten Bullen Zauberer (414382, Nordrind 2002) eingesetzt. Um vitale von toten Spermien zu trennen, erfolgte eine modifizierte Percoll-Gradientenzentrifugation (PARRISH et al. 1995; SOMFAI et al. 2002). Nach Auftauen der Spermienportion im Wasserbad bei 30°C für 30 Sekunden wurde der Percollgradient von 90% mit dem aufgetauten Sperma überschichtet. Nach 16-minütiger Zentrifugation bei 380 x g konnte der Überstand verworfen, das Spermienpellet mit Fert-TALP resuspendiert und erneut zentrifugiert (3 Minuten bei 380 x g) werden. Nach diesem Schritt erfolg-ten wiederum ein Absaugen des Überstandes und eine weitere Resuspendierung und Zentrifugation (3 Minuten bei 380g) der Spermien in HHE [Heparin (Serva), Hypotaurin (Sigma), Epinephrine(Sigma)] + Fert-TALP. Die Befruchtung fand wäh-rend einer Kokultur der gereiften Oozyten und der motilen Spermien in einer End-konzentration von Spermien/ml bei 39°C und 5% CO₂ in 100l Fert-TALP+HHE-Drops statt. Nach 19-stündiger Inkubation wurde der Kumulus von den befruchteten Eizellen durch Schütteln (Vortexing) in 37°C warmem TCM-air mechanisch entfernt und unter dem Mikroskop nach Polkörpern gesucht. Zygoten guter Qualität (Ausbil-dung der Polkörper, homogenes Zytoplasma) wurden in 80µl TCM-air-Drops bis zum Eileitertransfer gesammelt.

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Tabelle 3: Klassifizierungsschema für unreife Oozyten (BUNGARTZ et al. 1995)

Kategorie 1 Homogenes dunkles Ooplasma, kompakt

angeordneter, durchgehend drei-vierlagiger Cumulus oophorus

Kategorie 2 Homogenes dunkles Ooplasma, mindestens

eine durchgehende Lage von Kumuluszellen

Kategorie 3 Beschaffenheit des Ooplasmas wie in Kate-gorien 1 und 2 oder davon

abweichend (heterogenes dunkles oder hel-les Zytoplasma oder homogenes

helles Zytoplasma), anhaftende Kumuluszel-len

Kategorie 4 Beschaffenheit des Ooplasmas wie in Kate-gorie 1, 2 oder 3, keine

anhaftenden Kumuluszellen

Kategorie 5 Beschaffenheit des Ooplasmas wie

Katego-rie1 bis 3, deutliche

Auflockerung (Expandierung) der anhaften-den Kumuluszellen

3.1.4 Medien und Instrumente für den transvaginal-endoskopischen Embryo-nentransfer in den Eileiter des Rindes

Die in vitro generierten Zygoten wurden bei einer Temperatur von ca. 37°C in TCM-air-Drops gesammelt und zusammen mit 100-150µl TCM-air-Lösung in eine Trans-ferkapillare überführt. Für den transvaginal-endoskopischen Embryonentransfer in den bovinen Eileiter wurden folgende Instrumente (Abb. 14-16) verwendet:

 Universalschaft mit Hahn zur Insufflation (STORZ 66016 EA, Ø 12,5mm, Länge 49,5cm)

 Stumpfer Obturator (STORZ 66016 EB, Ø 12,5 mm, Länge 49,5 cm)

 Obturator mit Dreikantspitze (STORZ 66016 ED, Ø 12,5 mm, Länge 49,5 cm)

 Innenschaft mit Arbeitskanal für Transferkatheter (STORZ 66016 B)

 Transferkapillare (Glas) für Embryonen (Modell Mariensee) mit aufge-setztem ca. 70 cm langen Kunststoffschlauch (Original-Perfusor, B.

Braun, Melsungen 8722960) und 1ml Einwegspritze

 HOPKINS Geradeausblick-Optik 0° (Ø 5,5 mm) mit eingebauter Fiber-glas-Lichtleitung (STORZ 61015 A)

 KARL STORZ Endovision TELECAM DX, Farbsystem PAL (STORZ 69232001), bestehend aus:

 400A Netzkabel

 TELECAM C-Mount Kamerakopf (STORZ 20212034)

 TELECAM DX Kamera-Kontrolleinheit (CCU; STORZ 20232020)

 C-Mount Objektiv, einlegbar 30mm (STORZ 20200042)

 BNC-Verbindungskabel (STORZ 536 MK)

 S-VHS (Y/C)-Verbindungskabel (STORZ 547 S)

 2 Verbindungskabel zur Ansteuerung von DVD/Video- Printern oder -Recordern (STORZ 20221070)

 Kaltlicht-Fontäne HALOGEN 250twin (STORZ 20113301) bestehend aus:

 400A Netzkabel

 Fiberglas-Lichtkabel (STORZ 69495 NA, Ø 3,5 mm)

 36 cm Farbmonitor (Panasonic WV-CM 1480)

 DVD-Recorder (Panasonic DMR-E 100)

Am Ende jeder Endoskopiesitzung wurden die Instrumente nach gründlicher Reini-gung mit Wasser für mindestens 60 Minuten in eine 4%ige Desinfektionslösung (Korsolex® plus, Bode Chemie, Hamburg) gelegt und anschließend mit H₂O bidest.

gespült.

57 Abbildung 14: Übersicht der Instrumente

Abbildung 16: Bildgebende Geräte (Endoskopie-/Lichteinheit, Monitor, DVD-Recorder) Abbildung 5: Detailaufnahmen der Instumente

Abbildung 15: Detailaufnahmen der Instrumente

Universalschaft Stumpfer Obturator Spitzer Obturator Innenschaft

Universalschaft

Stumpfer Obturator Spitzer Obturator Innenschaft Endoskop

3.1.4.1 Herstellung der Embryotransferkapillare

Die Herstellung der Embryotransferkapillare erfolgte nach dem Vorbild für die Trans-ferkapillare der Forschungsgruppe um Professor Urban Besenfelder aus Wien (Abb.

17).

Eine 50µl Kapillarpipette (BLAUBRAND® intraMARK, Brand, Wertheim) wurde mit Hilfe eines Bunsenbrenners hirtenstabartig an der Vorderseite gebogen. Die scharfen Ränder der Kapillarspitzen sind ebenfalls per Bunsenbrenner geglättet worden. Die gebogene Spitze sollte das Inserieren in den Eileitertrichter erleichtern. Die ersten Versuche wurden mit einer wie oben beschriebenen Kapillare durchgeführt, da diese allerdings bei zu vielen Transfers (n=4) abbrach, wurde sie modifiziert.

Die Embryotransferkapillare Modell „Mariensee“ (Abb. 18) wird ebenfalls aus einer 50µl-Glaskapillarpipette hergestellt. Die Spitze, welche in den Eileiter eingefädelt werden sollte, wurde mit einem Bunsenbrenner in einen ca. 90° Winkel gebogen.

Diese hakenartige Form erleichterte die Manipulation am Eileitertrichtereingang. Am anderen Ende erfolgte eine Kürzung der Länge der Kapillare mit Hilfe eines Glas-schneiders um etwa 3cm. Dadurch konnten die Hebelkräfte, die während des Inserie-rens in den Trichter entstehen, deutlich geringer gehalten werden. Die scharfen Kan-ten wurden per Bunsenbrenner geglättet, um eine Traumatisierung des Gewebes zu vermeiden. Durch diese Modifikationen konnte die Häufigkeit des Abbrechens der Transferkapillare auf null reduziert werden.

Abbildung 17: Transferkapillare Modell Besenfelder

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Abbildung 18: Transferkapillare Modell Mariensee (modifiziert)

3.1.5 Transvaginaler Zugang zur Bauchhöhle und endoskopisch geleiteter