DNA-Methylierung

Die DNA-Methylierung beschreibt den Transfer einer Methylgruppe (CH₃-Gruppe) auf die Nukleinbasen Cytosin der DNA durch spezielle Enzyme. Die DNA-Methylierung ist die am besten untersuchte DNA-Modifikation. Sie wird vererbt und kommt sowohl bei Prokaryoten als auch bei Eukaryoten vor (JOHNSON et al. 2002). Die DNA-Methylierung ist meist mit einer Transkriptionshemmung assoziiert und spielt bei vie-len regulatorischen Prozessen wie der X-Chromosom-Inaktivierung, beim genomischen Imprinting, der Regulation der Entwicklung, der Mutagenese, der DNA-Reparatur und der Chromatin-Organisation eine große Rolle (KLIMASAUSKAS et al.

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1994; JAENISCH u. BIRD 2003). In Säugetierzellen findet die DNA-Methylierung ausschließlich an Position 5` des Cytosins eines CpG-Dinukleotids statt, wobei etwa 70% aller CpGs methyliert sind.

DNA-Methylierungen sind bei Wirbeltieren hauptsächlich in CpG-Inseln anzutreffen (OKANO et al. 1998). Diese Inseln sind Regionen der DNA, die reich an den aufei-nander folgenden Basen Cytosin und Guanin sind. In den CpG-Islands liegt das Dinukleotid Cytosin-Guanin (5 -CpG-3 ) im Vergleich zum restlichen Genom mit 10- bis 20-mal erhöhter Frequenz vor. Im Allgemeinen ist die Sequenzfolge Cytosin – Phosphat – Guanin im Genom im Vergleich zur statistischen Wahrscheinlichkeit ihres Auftretens unterrepräsentiert. Die DNA-Methylierung wird durch DNA-Methyltransferasen (DNMTs) durchgeführt (Abb. 4). Diese Enzyme (siehe Kapitel 2.4.1.1) katalysieren den Transfer einer Methylgruppe vom S-Adenosyl-L-Methionin an das Kohlenstoffatom C-5 der Base Cytosin (ROBERTSON et al. 1999).

Abbildung 4: DNA-Methyltransferasen katalysieren den Transfer einer Methylgruppe auf das C-Atom im Cytosinring (HAAF 2006)

Epigenetische Fehler, welche die Chromatinstruktur oder die DNA-Methylierung ver-ändern, können beim Menschen zu Erbkrankheiten und Tumorerkrankungen führen (TILGHMAN 1999; FALLS et al. 1999). Das Auftreten einer abweichenden Expressi-on vExpressi-on „imprinted“ Genen steht im Zusammenhang mit dem Beckwith-Wiedemann-Syndrom (BWS), Angelman Beckwith-Wiedemann-Syndrom (AS), Retinoblastomen (RB), Rett-Beckwith-Wiedemann-Syndrom, ATR-X-Syndrom (Alpha Thalassemia/Mental Retardation-Syndrome, X-linked), ICF-Syndrom (Immunodeficiency, Centromere instability and Facial abnomalies) und ver-schiedenen Krebsformen (DEAN et al. 2005). Ein erhöhtes Risiko für Imprintingstörungen und Imprintingkrankheiten, wie die zum Teil oben aufgeführten

Syndrome wurde bei Kindern nach In-vitro-Fertilisierung (IVF) und intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) beobachtet (COX et al. 2002;

DEBAUN et al. 2003; LAWRENCE et al. 2010). Außerdem werden Gene, die dem Imprinting unterliegen, als mögliche ursächliche Kandidaten für die Entstehung des LOS bei Tieren angesehen (WRENZYCKI et al. 2006).

Geschlechtsspezifische Methylierungen (siehe Abb. 5) im Genom von Oozyte und Spermium werden nach der Befruchtung durch Demethylierung entfernt. Geprägte Gene sind von dieser Demethylierung ausgenommen und bleiben methyliert. Das paternale Genom wird (siehe Abb. 5) innerhalb weniger Stunden nach der Befruch-tung aktiv demethyliert (Maus, Schwein, Rind, Mensch), Ausnahmen davon zeigen nur das Kaninchen und das Schaf (SHI et al. 2004, YOUNG u. BEAUJEAN 2004) Beim maternalen Genom findet eine passive Demethylierung während der ersten Teilungen statt (MAYER et al. 2000; DEAN et al. 2001; HAAF 2006; LEPIKHOV et al.

2008). Die Demethylierung erfolgt aktiv, d.h. in Abwesenheit von DNA-Replikation und unterliegt speziesspezifischen Variationen.

Bislang war zwar bekannt, dass 5„-Methylcytosine in der väterlichen und mütterlichen DNA der Zygote demethyliert werden, doch die molekularen Mechanismen, die den Vorgang vermitteln, waren bis dato unerforscht. Eine Forschergruppe hat nun erst-mals nachgewiesen, dass die Abnahme von 5„-Methylcytosin (5-mC) in väterlichen Vorkernen von Maus-, Kaninchen- und Rinder-Zygoten mit der Zunahme an 5-Hydroxymethylcytosin (5-hmC) korreliert und die Oxidase Tet3 durch Knock-out-Experimente als Katalysator der Modifikation identifiziert. Zugleich entdeckten die Forscher durch Ausschalten des entsprechenden Gens, dass ein Schutzprotein die Konversion von 5-mc in 5-hmc in weiblichen Vorkernen verhindert. Die neuen Er-kenntnisse unterstreichen, dass 5-hmc und Tet3 eine wichtige Rolle bei der Reprogrammierung in frühen Embryonen spielen (WOSSIDLO et al. 2011; IQBAL et al. 2010).

Später findet eine De-novo-Methylierung der DNA statt. Dieser Vorgang beginnt beim Rind zwischen dem 8- bis 16-Zellstadium (BOURC´HIS et al. 2001a; DEAN et al.

2001; SHI et al. 2003) und bei der Maus sowie beim Menschen ab der Morula (DEAN

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et al. 2001). Dabei kommt es bei der Maus zu einer deutlich asymmetrischen Methylierung, wobei die DNA der Blastomeren der inneren Zellmasse (ICM) hypermethyliert wird, wohingegen die DNA der Zellen des Trophektoderms (TE) eine Hypomethylierung aufweist (DEAN et al. 2001; SANTOS et al. 2002). Diese Asym-metrie ist beim Rind schwächer ausgeprägt (Abb. 5) und beim Menschen liegt eine stärkere Methylierung der DNA der Zellen des Trophektoderms gegenüber der DNA der Blastomeren der inneren Zellmasse vor (FULKA et al. 2004). Auch beim Schaf kann eine asymmetrische Verteilung der Methylierung in voll expandierten Blastozysten beobachtet werden. Im Gegensatz zur Maus beruht diese Asymmetrie jedoch nicht auf einer verstärkten Remethylierung in den Kernen der ICM, sondern auf einer selektiven Demethylierung der DNA im TE (YOUNG u. BEAUJEAN 2004).

Die korrekte Reprogrammierung der Methylierung der beiden elterlichen Genome in der frühen Embryonalentwicklung hat große Bedeutung für die ungestörte weitere Entwicklung (LEPIKHOV et al. 2008). Veränderungen im Methylierungsmuster der DNA wurden beim Rind sowie bei der Maus nach Kerntransfer nachgewiesen (HUMPHERYS et al. 2001; ENRIGHT et al. 2005). Bei Kerntransferembryonen kommt es zu einer inkompletten, sowie auch variablen Demethylierung des diploiden Spendergenoms (DEAN et al. 2001; LIU et al. 2008).

Abbildung 5: Elternspezifische Methylierungsreprogrammierung im frühen Säugetier embryo (HAAF 2003, modifiziert)

2.4.1.1 DNA-Methyltransferasen

Methyltransferasen übertragen Methylgruppen auf bestimmte Basen der DNA. DNA-Methyltransferasen bestehen aus zwei funktionellen Domänen, einer N-terminalen Domäne mit regulatorischen Funktionen, und einer C-terminalen katalytischen Do-mäne (BESTOR 2000; ROBERTSON 2002). Fünf DNA-Methyltransferasen sind im Säugetiergenom identifiziert worden: DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b und DNMT3L (siehe Abb. 6). Je nach Funktion werden die DNA-Methyltransferasen in zwei Klassen eingeteilt. Als Erhaltungsmethyltransferase (maintenance methyltrans-ferase) wird die DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1) bezeichnet. Sie ist für die Auf-rechthaltung eines bereits existierenden Methylierungsmusters nach der DNA-Replikation zuständig (BESTOR u. VERDINE 1994). Die genaue Funktion der DNMT2-Familie ist nicht geklärt. Die DNMT2 wurde sowohl in Organismen, die Methylierung aufweisen, gefunden als auch bei solchen ohne feststellbare DNA-Methylierung. Homozygote Mäuse-DNMT2-Null-Mutanten sind lebensfähig und zei-gen normale Methylierungslevel an endozei-genen Sequenzen (OKANO et al. 1998). Im Jahre 2006 konnte gezeigt werden, dass die DNMT2 trotz ihrer strukturellen Ähnlich-keit zu den 5-Methylcytosin-Methyltransferasen nicht wie angenommen Nukleotidbasen in der DNA methyliert, sondern Transfer-RNA methyliert (tRNAASP;

GOLL et al. 2006). Um diese unterschiedliche biologische Funktion aufzuzeigen, wurde ihr der Name TRDMT1 (tRNA aspertartic acid methyltransferase 1) gegeben.

Eine zweite Gruppe von Methyltransferasen sind die sogenannten De-novo-Methyltransferasen. Sie sind u.a. für die DNA-Methylierungsmuster während der Embryonalentwicklung verantwortlich und übertragen Methylgruppen auf völlig unmethylierte DNA-Stränge. Zu den De-novo-Methyltransferasen zählen die DNMT3a und DNMT3b (OKANO et al. 1999; MARGOT et al. 2003).

Neben der DNMT3a und DNMT3b gehört auch DNMT3L zu dieser Enzymfamilie. Die DNMT3L, die alleine keine Methylierungsaktivität aufweist, ist zusammen mit DNMT3a und DNMT3b für die Etablierung des genomischen Imprintings bei der

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Maus essentiell und während der Oogenese für die De-novo-Methylierung verant-wortlich (BOURC‟HIS et al. 2001a/b; HATA et al. 2002). DNMT3a und 3L sind für die Ausbildung der geprägten Regionen in Oozyten verantwortlich (HATA et al. 2002).

Der genaue Mechanismus dieses Prozesses ist noch ungeklärt, es scheint aber, dass die DNMT3L eine Art Aktivator-Protein für die Methylierung einzelner Gene ist (DEAN et al. 2005). Die DNMT3L kann die katalytische Aktivität der DNMT3a und 3b scheinbar bis um das 15fache verstärken (GOWHER et al. 2005).

Die DNA-Methylierung spielt somit eine sehr wichtige Rolle in der Embryonalentwick-lung der Säugetiere (JAENISCH u. BIRD 2003). Mutationen des DNMT3a-Gens auf dem paternalen oder/und maternalen Allel führen zu Störungen der Reproduktion, der Embryonalentwicklung sowie beim Imprinting (KANEDA et al. 2004), Mutationen im DNMT1-Gen sind bei Mäusen letal (CAO u. JACOBSEN 2002).

In vergleichenden DNA-Studien zu DNMT´s (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b und DNMT3L) in Maus, Rind und Mensch konnte gezeigt werden, dass generell eine große strukturelle und funktionelle Übereinstimmung dieser Enzyme zwischen den Spezies besteht. Es gibt allerdings eine höhere Übereinstimmung in der Struktur zwischen Rinder- und DNMT´s als zwischen Maus- und Menschen-DNMT´s. Ebenfalls konnte in dieser Studie aufgezeigt werden, dass die mRNA-Expressionsmuster der Enzyme während der frühen Embryonalentwicklung in den drei Spezies übereinstimmen. Diese Erkenntnisse sind sehr wichtig für das Ver-ständnis, welche Rolle die korrekte DNA-Methylierung als epigenetischer Prozess für die normale Entwicklung des Embryos hat (RODRIQUEZ-OSORIO et al. 2010).

Abbildung 6: Die drei DNA-Methyltransferasenfamilien der Säuger (SIMON et al. 2005, modifiziert)

2.4.1.1.1 DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1)

Die DNA-Methyltransferase 1 ist in erster Linie für die Aufrechterhaltung der Methylierung und die Methylierung hemimethylierter CpG-Dinukleotide zuständig (OKANO et al. 1999).

Das DNMT1-Protein (Abb. 7) verfügt im C-Terminus über eine DNA-Doppelbindungsstelle, durch welche sich die Präferenz für die hemimethylierte DNA erklären ließe. Die methylierte DNA wird hingegen durch die N-terminale Domäne gebunden (BACOLLA et al. 1999, 2001). Die katalytische C-Domäne muss von der N-terminalen Domäne aktiviert werden (MARGOT et al. 2003). Das Enzym besteht aus 1620 Aminosäuren. Die ersten 1100 Aminosäuren machen die N-terminale, re-gulatorische Domäne und die restlichen Aminosäuren die C-terminale, katalytische Domäne aus.

Die DNMT1 ist die hauptsächlich vorkommende DNA-Methyltransferase im Säugetier und weist verschiedene Isoformen auf. Homologe der DNMT1 sind in fast allen Eukaryonten mit 5-Methylcytosin-Domänen in der DNA zu finden, jedoch nicht in DNA ohne solche Domänen (BESTOR 2000).

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Abbildung 7: Struktur des DNMT1-Proteins der Maus (CIRIO et al. 2007, modifiziert)

Es wurden geschlechtsspezifische Isoformen von DNMT1 identifiziert, welche sich in der Anzahl an Aminosäuren unterscheiden (BESTOR et al. 1988; Abb. 8). Die Oozy-ten-Isoform von DNMT1 beinhaltet ein spezifisches 5´Exon (DNMT 1o), welches ver-ursacht, dass die Translation erst am ATG-Codon 4 beginnt. Daraus resultiert ein um 118 Aminosäuren kürzeres Protein. Während die somatische Form der DNMT1 (DNMT1s) vorrangig im Zellkern lokalisiert ist, befindet sich die DNMT1o nur zu Be-ginn des Oozyten-Wachstums und während des 8-Zell-Stadiums im Nukleus (BESTOR 2000). Vor der Ovulation und in präimplantatorischen Mäuseembryonen ist die DNMT1o im Zytoplasma zu finden und erst nach der Implantation im Zellkern lo-kalisiert, wo sie dann von der längeren somatischen Form ersetzt wird (CARLSON et al. 1992). Ein spermienspezifischer Promotor (DNMT1p) ist in der dritten Isoform von DNMT1 zu finden, dieser Promotor ist nur in pachytänen Spermatozyten zu finden.

Für das Rind existiert bisher kein Nachweis von somatischen und oozytenspezifischen DNMT1-Transkripten. Stattdessen deuten neueste Untersu-chungen darauf hin, dass keine oozytenspezifische Form der DNMT1 beim Rind existiert (RUSSELL u. BETTS 2008). So konnten RUSSELL und BETTS (2008) zwar eine neue Variante der DNMT1 nachweisen (DNMT1b), die jedoch wie die bisher bekannte DNMT1 ubiquitär in allen Geweben exprimiert wird. Diese neue DNMT1b-Variante ist nur in geringen Mengen in ungereiften Oozyten, in etwas höheren Men-gen in fetaler Leber und fetalen Gonaden und in den höchsten MenMen-gen in fetalen Muskelpräparaten nachzuweisen (RUSSELL u. BETTS 2008). Dagegen konnte kein Hinweis auf einen alternativen Promotor oder ein alternatives Exon gefunden wer-den, wie es bei der Maus für die DNMT1o existiert (RUSSELL u. BETTS 2008).

Abbildung 8: Geschlechtsspezifische Exons und mRNAs der DNMT1 (BESTOR 2000)

In Abhängigkeit von der Herkunft und dem Entwicklungsstadium konnten bei Rindern für die DNMT1 in verschiedenen Versuchen unterschiedliche mRNA-Gehalte festge-stellt werden. WRENZYCKI u. NIEMANN (2003) beschrieben die DNMT1-mRNAExpression in maturierten Eizellen sowie in Embryonen verschiedener Her-kunft (parthenogenetisch, IVP, SCNT). Dabei war in identisch erstellten Embryonen im 8- Zellstadium ein signifikanter Abfall des mRNA-Gehaltes im Vergleich zu Zygo-ten der gleichen Herkunft nachweisbar. Im BlastozysZygo-tenstadium konnte jedoch ein signifikanter Anstieg der Transkriptmenge bei den Embryonen aus SCNT und IVP im Vergleich zu in vivo gewonnenen Embryonen beobachtet werden. Bei einem Ver-gleich früher präimplantatorischer boviner Embryonen aus IVP und In-vivo-Gewinnung konnte ein signifikanter Unterschied der DNMT1 mRNA-Expression bei Embryonen verschiedener Herkunft festgestellt werden. So ist die relative Transkriptmenge in in vivo gewonnenen Morulae- und Blastozystenstadien geringer als in Embryonen aus In-vitro-Kultur (HÖFFMANN et al. 2006).

37 2.4.1.1.2 DNA-Methyltransferase 3a (DNMT3a)

DNMT3a/b sind De novo-DNMTs (OKANO et al. 1999) und erreichen ihre höchste Expression in der frühen Embryogenese (BIRD 2002; WADE 2001). Die DNA-Methyltransferasen 3a und 3b bestehen aus einer großen N-terminalen Domäne und einer kleineren, katalytischen C-terminalen Domäne. Bei Untersuchungen an Hefen konnten keine intramolekularen Interaktionen zwischen den zwei Domänen, wie sie für DNMT1 beschrieben worden sind, festgestellt werden (MARGOT et al. 2003).

DNMT3a und DNMT3b sind essentiell für die De novo-Methylierung von embryona-len Stammzelembryona-len (OKANO et al. 1999). Untersuchungen an Mäusen konnten zeigen, dass sie ebenfalls eine große Rolle bei der De novo-Methylierung während der früh-embryonalen Entwicklung spielen. Sie sind desweiteren an der Ausbildung des maternalen und paternalen Imprinting beteiligt. Mutationen des DNMT3a-Gens so-wohl auf dem paternalen als auch auf dem maternalen Allel führen zu Störungen der Reproduktion, der Embryonalentwicklung und des Imprinting (KANEDA et al. 2004).

DNMT3b spielt eine bedeutende Rolle während der frühen Embryonalentwicklung und methyliert ein breites Spektrum an DNA-Sequenzen, wohingegen DNMT3a eine Reihe an Genen oder Sequenzen zu methylieren scheint, die während der späteren Embryonalentwicklung und/oder nach der Geburt von Bedeutung sind (OKANO et al.

1999).

Auch in der Spermatogenese spielt DNMT3a eine bedeutende Rolle. So war es nicht möglich, eine Trächtigkeit bei Wildtypmäusen zu etablieren, die mit DNMT3a mutan-ten Böcken gekreuzt wurden (KANEDA et al. 2004). Störungen der DNMT3a-Expression sind letal für Mäuse, und auch von der DNMT3a/DNMT3b homozygoten Knockoutmaus wurde berichtet, dass sie unfähig ist, neuintegrierte retrovirale DNA zu methylieren. Bei heterozygoten Knockoutmäusen bleibt diese Fähigkeit jedoch erhalten (OKANO et al. 1999). In Vergleichsstudien zwischen bovinen in vitro und in vivo generierten sowie geklonten Embryonen konnte ein signifikanter Anstieg der DNMT3a-Expression in den geklonten Embryonen im Vergleich zu in vivo generier-ten, parthenogenetischen und IVP-Blastozysten nachgewiesen werden. HÖFFMANN konnte 2006 durch vergleichende Untersuchungen mittels semi-quantitativer RT-PCR Unterschiede in der relativen Transkriptmenge für DNMT3a zwischen in vivo

und in vitro erzeugten Embryonen feststellen. Die relative Transkriptmenge von DNMT3a unterschied sich signifikant zwischen Morulae und Blastozysten aus den beiden Herkünften. Bei den Blastozysten war der Gehalt an DNMT3a in den in vivo gewonnenen Embryonen niedriger als bei ihren in vitro Gegenspielern, und umge-kehrt bei den Morulae (HÖFFMANN 2006; DRALLMEYER 2008).